PLoS ONE: det undertrykkende Effekt af miR-148a på TGF beta-SMADs Signal Pathway Er Involveret i glabridin-induceret hæmning af Cancer Stamceller-lignende egenskaber i hepatocellulært carcinom Cells

Abstrakt

hepatocellulært carcinom ( HCC) er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Aktuelle standard praksis for behandling af HCC er mindre end tilfredsstillende på grund af cancer stamceller (CSCS) -medieret postoperative gentagelse. Af denne grund, at målrette de CSCS eller kræftcellerne med CSCS-lignende egenskaber er blevet en ny tilgang til behandling af HCC. GLA udviser antitumorvirkninger ved, at den dæmper proliferation, migration, invasion, og angiogenese af humane cancerceller. Men funktioner GLA i reguleringen af ​​CSCS-lignende egenskaber i HCC celler og de molekylære mekanismer, der ligger til grund i fortsat uklar. Her fandt vi, at GLA svækkede de CSCS-lignende egenskaber ved microRNA-148a (MIR-148a) -medieret inhibering af transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) /SMAD2 signalvej i HCC-cellelinier (HepG2, Huh-7, og MHCC97H). Faktisk GLA inhiberede aktiveringerne /udtryk både TGFp-inducerede og den endogene SMAD2. Endvidere GLA forbedret ekspression af MIR-148a i en dosis /tidsafhængig måde. MIR-148a, som målrettet

SMAD2

-3’UTR, faldt udtryk og funktion af SMAD2. Knockdown af MIR-148a afskaffede GLA-induceret hæmning af TGF-β /SMAD2 signalvej og CSCS-lignende egenskaber i HCC-celler. Vores undersøgelse fundet en ny mekanisme, GLA hæmmer CSCS-lignende egenskaber af HCC celler ved miR-148a-medieret hæmning af TGF-β /SMAD2 signal pathway, som kan hjælpe med at identificere potentielle mål for behandlinger af HCC.

Henvisning: Jiang F, Mu J, Wang X, Ye X, Si L, Ning S, et al. (2014) det undertrykkende Effekt af miR-148a på TGF beta-SMADs Signal Pathway Er Involveret i glabridin-induceret hæmning af cancer stamceller-lignende egenskaber i hepatocellulært carcinom celler. PLoS ONE 9 (5): e96698. doi: 10,1371 /journal.pone.0096698

Redaktør: Lian-Yue Yang, Xiangya Hospital Central South University, Kina

Modtaget: Januar 2, 2014 Accepteret: April 10, 2014; Udgivet: 7. maj 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81171987, 30972507) og et projekt finansieret af Priority Academic Program Udvikling af Jiangsu højere uddannelsesinstitutioner (PapD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er den mest almindelige leveren malignitet og den tredje hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed på verdensplan [1]. Aktuelle standard praksis for behandling af HCC, kirurgisk resektion og kemoterapi er mindre end tilfredsstillende på grund af metastaser og post-kirurgisk recidiv [1]. Et koncept foreslået at forklare kendetegnene ved neoplastiske væv er eksistensen af ​​selvfornyende, stamceller-lignende celler, der kaldes cancer stamceller (CSCS) [2]. CSCS er blevet identificeret i forskellige humane cancere, herunder HCC. Inden for en tumor, CSCS, der udgør en lille del af de neoplastiske celler, defineres ved deres evne til at producere nye tumorer [3]. Af denne grund, målrettet kræftcellerne med CSCS-lignende egenskaber er blevet den nye måde til behandling af humane leverkræft.

Roden af ​​

Glycyrrhiza glabra

(lakrids) er blevet anvendt til mange århundreder i Asien og Europa som en antioxidant, modgift, lindrende middel, slimløsende og et middel mod allergisk inflammation, samt en aroma og sødemiddel [4]. Glabridin [GLA, (

R

) -4- (3, 4-dihydro-8, 8-dimethyl) -2

H

, 8

H

benzo [ ,,,0],1, 2-

b

: 3, 4-

b

‘] dipyran-3-yl) -1, 3-benzendiol] er en polyphenolisk flavonoid og en hovedbestanddel i den hydrofobe del af lakrids udtrække [5]. Foruden østrogene effekter, GLA udviser en lang række biologiske aktiviteter, herunder neuro-beskyttende, cardiovaskulær-beskyttende, anti-inflammatorisk, osv [5] – [7]. Nylige undersøgelser viser, at GLA præsenterer antitumorvirkninger, med dæmpning af proliferation, migration /invasion, og angiogenese i humane cancerceller [8], [9]; Virkningerne af GLA på de CSCS-lignende egenskaber i HCC-celler og de molekylære mekanismer, der ligger i forblive uklar.

transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) er en kritisk regulator involveret i cellevækst, differentiering og udvikling [10]. Det er også den mest potente hepatisk pro-fibrogene cytokin overvejende produceres af aktiverede mesenkymale celler efter kronisk leverskade [11]. I initieringen og udviklingen af ​​forskellige tumorer, TGF-β inducerer epitel-mesenkymale overgang (EMT), som er en kritisk cellulær begivenhed i erhvervelse af CSCS-lignende egenskaber [12], [13]. Derfor har TGF-β-hæmmere blevet udviklet til anti-cancer behandlinger [14], [15]. Aktuelle undersøgelse indikerer, at inhibering af TGF-β blokerer generation af CSCS, som forbedrer kemoterapi aktion mod triple-negativ brystcancer [16]. I den foreliggende undersøgelse, vi behandlede HCC cellelinier (HepG2, Huh-7, og MHCC97H) af GLA at bestemme de tidlige molekylære ændringer, med betoninger på CSCS-lignende egenskaber og TGF-β vej.

Materialer og Metoder

Cell kultur og reagenser

HCC-cellelinjer (HepG2 og Huh-7) og human normal lever cellelinje (L-02) blev indhentet fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy af Sciences (Shanghai, Kina). MHCC97H cellelinje (HCC celler med en høj vandrende potentiale) blev opnået fra Liver Cancer Institute, Zhongshan Sygehus, Fudan University, Shanghai, Kina. Celler blev holdt i 5% CO

2 ved 37 ° C i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Life Technologies /Gibco, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). GLA (≥98.0% renhed) blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Alle andre anvendte reagenser var af analytisk kvalitet eller den højeste tilgængelige kvalitet.

Reverse-transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Totalt RNA (2 ug) blev transkriberet til cDNA under anvendelse af AMV Reverse transkriptase (Promega, Madison, USA). Anvendte primere er som opregnet i tabel S1. PCR-reaktionen blev evalueret ved at kontrollere PCR-produkterne på 2% vægt /volumen agarosegeler. Bånd blev normaliseret ved anvendelse af

glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)

at korrigere for forskelle i belastning af cDNA’er.

Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

Totalt RNA (1 ug) blev transkriberet til cDNA under anvendelse af TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) med miRNA-specifikke løkker reverse primere. Reaktionsbetingelserne var som følger: 42 ° C i 15 min og 85 ° C i 5 s. QRT-PCR blev udført under anvendelse af et TaqMan PCR kit af Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) i 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min.

U6

snRNA blev anvendt som en intern kontrol. Fold ændringer i ekspressionen af ​​hvert gen blev beregnet ved en sammenlignende tærskel cyklus (Ct) metode ved hjælp af formlen 2

-. (ΔΔCt)

Western blots

Cellelysater blev adskilt af natrium dodecylsulfat (SDS) -polyacrylamid-gelelektroforese og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, USA); immunkomplekserne blev påvist ved forøget kemiluminescens (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Anvendte antistoffer var SMAD2 og p-SMAD2 (Ser 465/467, Cell Signaling Technology); GAPDH (Sigma). Blots blev normaliseret ved brug af GAPDH at korrigere for forskelle i læsning af proteinerne.

Sfæroide dannelse

I ikke-klæbende 24-brønde retter (Costar, US), behandlede celler (2 × 10

3) blev suspenderet i defineret serum-frit medium sammensat af DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml human rekombinant basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, R efter i 14 dage, blev kolonier talt under et mikroskop (Olympus).

Cell transfektion

Anti-con, anti-miR-148a, Con-mimik, og miR-148a-efterligner var syntetiseret ved RiBoBio Co. Celler blev transient transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) i 12 timer, ifølge fabrikantens protokol. For gen recovery assay efter MHCC97H celler blev transficeret ved anti-MIR-148a i 12 timer, de blev dyrket i frisk DMEM-medium suppleret med 10% FBS (Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco ) i yderligere 24 timer, efterfulgt af transfekteret med Con-efterligner eller miR-148a-efterligning i 12 timer.

Luciferase reporter assay

pGL3-

SMAD2

-3 ‘UTR-Luc konstruktionen blev købt fra Shuntian Biology (Shanghai). Plasmidet phRL-tk (anvendt som intern kontrol til transfektion effektivitet og cytotoksicitet af test kemikalier), der indeholder Renilla luciferasegenet blev købt fra Promega. Kort beskrevet blev HepG2-celler udpladet i 24 brønde celle dyrkningsskåle. Cellerne prolifererede til 60 til 80% sammenflydning efter 24 timers kultur. Anti-con eller anti-MIR-148a blev co-transficeret med reporter-konstruktionerne henholdsvis ved hjælp Lipofecamine 2000 reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Efter en inkubationsperiode på 12 timer blev transfektionsmediet udskiftet. Derefter, efter at cellerne blev behandlet ved 0 eller 20 uM GLA i 24 timer, blev de høstet, vasket med PBS (pH 7,4). Cellerne blev lyseret med passiv lysepuffer (Promega). Cellelysaterne blev analyseret øjeblikkeligt med en 96-brønds plade luminometer (Berthold Detection System, Pforzheim, Tyskland). Mængderne af luciferase og Renilla luciferase blev målt med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) ifølge producentens anvisninger. Værdierne af luciferaseaktivitet for hvert lysat blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Den relative aktivitet blev omdannet til fold induktion over køretøjets kontrolværdien.

Statistisk analyse

arvet værdier blev præsenteret som middelværdier ± SD. En studerendes

t

prøven inden for en envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Dunnetts

t

testen blev anvendt til at vurdere signifikante forskelle mellem grupperne.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

GLA dæmper CSCS-lignende egenskaber i HCC celler

For at bestemme koncentrationerne af. GLA hjælp i vores undersøgelse, vi udsat HepG2 eller L-02-celler til 0, 5, 10, 20, 40, eller 80 uM GLA i 24, 48 eller 72 timer. Som vist i fig. S1A og S1B, der var ingen påviselig effekt af 10 eller 20 uM GLA på celle levedygtighed hverken i HCC-celler (HepG2) eller i normale leverceller (L-02). Så vi valgte disse koncentrationer til yderligere undersøgelse.

En øget udstilling af CSCS-lignende egenskaber spiller en central rolle i initiering, udvikling, og resultatet af forskellige cancer, herunder HCC [2].

CD44

,

CD90

,

CD133

, og

EpCAM

er de celle-overflade markører for leverkræft stamceller [17] – [19] endvidere,

Oct-4

og

BMI-1

er de vigtigste “stemness ‘gener i CSCS fra forskellige kræftformer [13], [20]. Her, som vist i fig. 1A og 1B, GLA faldt udtrykkene for disse gener i HepG2-celler på en dosis-afhængig måde; i mellemtiden blev de faldt udtryk for

CD44

EpCAM

blev også observeret i yderligere to HCC-celler (Huh-7 og MHCC97H).

(A) HepG2 celler behandlet med 0, 10 eller 20 uM GLA i 72 timer. RT-PCR-analyser af

CD44

,

EpCAM

,

CD133

,

CD90

,

Oct-4

, og

BMI-1

; (B) Huh-7 og MHCC97H celler blev behandlet ved 0 eller 20 pM GLA i 72 timer. RT-PCR-analyser af

CD44

EpCAM

; (C og D) HepG2 og Huh-7 celler blev behandlet med 0 eller 20 pM GLA i 72 timer. (C) Frit flydende, levedygtige sfærer dannet af celler (bar = 250 um); (D) Sphere kvantificering (middelværdi ± SD, n = 3); (E og F) HepG2 og MHCC97H celler blev behandlet ved 0 eller 20 pM GLA i 72 timer. (E) Kolonidannelse i blød agar (bar = 250 um); (F) Colony numre (gennemsnit ± SD, n = 3). ** P. 0,01 sammenlignet med medium kontrol celler (studerendes

t

test)

Dannelse af sfæroider viser kapaciteten af ​​celler til selv-fornyelse og for indledning /udvikling af tumorer [2]. Derefter kapacitet HCC-celler til dannelse af sfæroider under GLA behandlingen blev bestemt. Som vist i fig. 1C og 1D, GLA faldt dannelsen af ​​sfæroider i HepG2 og Huh-7-celler. Forankringsuafhængig vækst er karakteristisk for maligne celler [21]. Vi yderligere bestemmes virkningerne af GLA på de maligne egenskaber i HCC-celler. Som vist i fig. 1E og 1F, GLA faldt forankringsuafhængig vækst i HepG2 og MHCC97H celler.

TGF-β /SMADs signal pathway er involveret i højden af ​​CSCS-lignende egenskaber i HepG2-celler

TGF -p /SMADs pathway har vist sig at øge stamceller-lignende egenskaber i humane cancerceller [22]. Her fandt vi, at TGF-β forbedret udtrykkene for CD44 og EpCAM (fig. 2A). Endvidere i TGF-p-behandlede HepG2-celler, evner sfæroiderne dannelse og forankringsuafhængig vækst blev forøget (fig. 2B og 2C). Men i SMAD2 (en klassisk nedstrøms faktor reguleres af TGF-β, [16]) Knockdown HepG2-celler, blev sådan fænomen induceret af TGF-β svækkede (fig. 2D-2F).

(A -C) HepG2-celler blev behandlet ved 0 eller 10 ng /ml TGF-β i 48 timer. (D-F) Efter HepG2-celler blev transficeret med 10 nM SMAD2-siRNA i 12 timer, blev de behandlet med 10 ng /ml TGF-β i 48 timer. (A og D) RT-PCR-analyser af

CD44

EpCAM

; (B og E, venstre) Frit flydende, levedygtige sfærer dannet af celler (bar = 250 um); (B og E, højre) Sphere kvantificering (middelværdi ± SD, n = 3); (C og F, venstre) Kolonidannelse i blød agar (bar = 250 um); (C og F, til højre) Colony numre (gennemsnit ± SD, n = 3). * P 0,05 sammenlignet med medium kontrolceller eller Con-siRNA-transficerede celler behandlet med TGF-β (studerendes

t

test)

GLA blokerer TGF-β /SMAD2. signal vej hos HCC celler

Vi derefter undersøgt virkningerne af GLA på TGF-β-induceret aktivering af SMAD2. Som vist i fig. 3A, GLA blokerede TGFp-inducerede phosphorylering af SMAD2 og ekspressionen af ​​

Sneglen

(nedstrøms genet af SMAD2, [23]); interessant, GLA svækkede også ekspressionen af ​​total SMAD2 mRNA og protein i nærvær eller fravær af TGF-β. Så vi næste bestemmes virkningerne af GLA på udtryk for endogene SMAD2. Som vist i fig. 3B og 3C, GLA faldt ekspressionen og aktiveringen af ​​endogen SMAD2 i HCC-celler (HepG2, Huh-7, og MHCC97H). Som det faktum, at

SMAD2

mRNA blev reduceret med GLA, vi den hypotese, at denne repressive virkning kan være medieret af de miRNA.

(A) Efter HepG2-celler blev forbehandlet med 0 eller 20 pM GLA i 12 timer, blev de udsat for 0 eller 10 ng /ml TGF-β i 24 timer. (Øverst) Western blot analyser af p-SMAD2 og SMAD2, (nederst) RT-PCR-analyser af

SMAD2

snegl

; (B) HepG2-celler blev behandlet ved 0, 10, eller 20 pM GLA i 72 timer. (Øverst) Western blots analyser af p-SMAD2 og SMAD2, (nederst) RT-PCR-analyser af

SMAD2

snegl

; (C) Huh-7 og MHCC97H celler blev behandlet ved 0 eller 20 pM GLA i 72 timer. RT-PCR-analyser af

SMAD2

snegl

.

GLA forbedrer ekspressionen af ​​miR-148a i HCC celler

Ved at bruge Targetscan 6.2 (www.targetscan.org), fandt vi, at miR-148a blev forudsagt at binde

SMAD2

-3 ‘UTR. De mål steder af miR-148a i

SMAD2

mRNA blev udstillet i figur. 4A. Vi bestemmes derefter virkningerne af GLA på ekspressionen af ​​miR-148a i HCC celler. Som vist i fig. 4B og 4C, GLA forbedret ekspression af MIR-148a i en dosis /tidsafhængig måde i HepG2-celler. I mellemtiden, GLA forhøjet også udtryk for miR-148a i Huh-7 og MHCC97H celler (Figur 4D).

(A) De målsekvenser af miR-148a i 3′-UTR af

SMAD2

; (B) HepG2-celler blev behandlet ved 0, 10, eller 20 pM GLA i 24 timer. QRT-PCR-analyser af ekspressionen af ​​MIR-148a (middelværdi ± SD, n = 3); (C) HepG2-celler blev behandlet ved 0 eller 20 pM GLA i 0, 8, 16, 24, eller 48 timer. QRT-PCR-analyser af ekspressionen af ​​MIR-148a (middelværdi ± SD, n = 3); (D) Huh-7 og MHCC97H celler blev behandlet ved 0 eller 20 pM GLA i 24 timer. QRT-PCR-analyser af ekspressionen af ​​MIR-148a (gennemsnit ± SD, n = 3). ** P. 0,01 sammenlignet med medium kontrol celler (studerendes

t

test)

GLA hæmmer SMAD2 af miR-148a i HCC celler

Baseret på den forudsigelse, at der er målsteder af mIR-148a i

SMAD2

mRNA og på at GLA forhøjede ekspressionen af ​​mIR-148a, vi hypotese, at mIR-148a kan være involveret i GLA-induceret nedsat ekspression af SMAD2 . Her knockdown af miR-148a (figur. 5A) ført til en betydelig forøgelse af luciferaseaktiviteten (figur. 5B), og blokerede GLA-induceret nedsat ekspression og aktivering af SMAD2 i HepG2-celler (figur. 5C). I mellemtiden overekspression af MIR-148a (fig. 5D) i Huh-7-celler faldt ekspressionen og aktivering af SMAD2 (fig. 5E). Desuden brugte vi gen opsving assay for yderligere at bekræfte vores konklusion. I MHCC97H celler, knockdown af miR-148a forhøjet udtryk for

SMAD2

dog restaurering af miR-148a af mimisk afskaffet sådan virkning (figur. 5F og 5G).

(A- C) efter HepG2-celler blev præ-transficeres ved anti-con eller anti-mIR-148a i 12 timer, blev de udsat for 0 eller 20 uM GLA i 72 timer. (A) QRT-PCR-analyser af ekspressionen af ​​MIR-148a (middelværdi ± SD, n = 3); (B) Luciferase reporter analyser analyse af virkningerne af miR-148a på

SMAD2

3’UTR; (C) RT-PCR-analyser af

SMAD2

snail

(øverst), og Western blots analyser af p-SMAD2 og SMAD2 (nederst). ** P 0,01 sammenlignet med medium kontrolceller, og

## p 0,01 sammenlignet med HepG2 celler behandlet med GLA alene eller med anti-con-transficerede HepG2-celler behandlet med GLA (ANOVA efterfulgt af Dunnetts

t

test). (D og E) Huh-7-celler blev transficeret ved con-efterligner eller MIR-148a-mimic i 12 timer. (D) QRT-PCR-analyser af ekspressionen af ​​MIR-148a (middelværdi ± SD, n = 3); (E) RT-PCR-analyser af

SMAD2

snail

(øverst), og Western blots analyser af SMAD2 (nederst); ** P 0,01 sammenlignet med Huh-7 celler transficeret med con-mimic (Students t-test). (F og G) Efter MHCC97H celler blev transficeret ved anti-MIR-148a i 12 timer, de blev dyrket i frisk DMEM-medium suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i yderligere 24 timer, efterfulgt af transficeret med con-efterligner eller mIR-148a-mimic i 12 timer. (F) QRT-PCR-analyser af ekspressionen af ​​MIR-148a (middelværdi ± SD, n = 3); (G) RT-PCR-analyser af

SMAD2

. ** P 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transficeret med anti-con,

## p 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transficeret med anti-MIR-148a plus con-mimic (ANOVA efterfulgt af Dunnetts

t

test).

GLA dæmper CSCS-lignende egenskaber i HCC celler ved miR-148a

da TGF-β /SMAD2 forbedrer CSCS-lignende egenskaber, og siden miR-148a mål SMAD2, vi hypotese, at GLA dæmper CSCS-lignende egenskaber ved mIR-148a i HCC-celler. Her knockdown af miR-148a blokerede GLA-inducerede faldt udtryk for

CD44

EpCAM

mRNA (figur. 6A). For HepG2-celler, knockdown af miR-148a blokerede GLA-induceret nedsat dannelse af sfæroider (figur. 6b og 6c). For Huh-7-celler, overekspression af MIR-148a svækket evne forankringsuafhængig vækst (fig. 6D og 6E). Derefter brugte vi gen opsving assay for yderligere at bekræfte vores konklusion. I MHCC97H celler, knockdown af miR-148a forhøjet udtryk for

CD44

EpCAM

, og forbedret dannelsen af ​​sfæroider; Men restaurering af miR-148a af mimisk afskaffet sådan virkning (figur. 6F-6H).

(AC) Efter HepG2 eller Huh-7 celler blev præ-transficeret af anti-con eller anti-miR-148a i 12 timer, blev de udsat for 0 eller 20 pM GLA i 72 timer. (A) RT-PCR-analyser af

CD44

EpCAM

; (B) Frit flydende, levedygtige sfærer dannet af HepG2-celler (bar = 250 um); (C) Sphere kvantificering (middelværdi ± SD, n = 3); ** P 0,01 sammenlignet med mediekontrol HepG2-celler, og

## p 0,01 sammenlignet med anti-con-transficerede HepG2-celler behandlet med GLA (ANOVA efterfulgt af Dunnetts

t

test). (D og E) Huh-7-celler blev transficeret ved con-efterligner eller MIR-148a-mimic i 12 timer. (D) Kolonidannelse i blød agar (bar = 250 um); (E) Colony numre (gennemsnit ± SD, n = 3). ** P 0,01 sammenlignet med medium kontrol Huh-7-celler eller med Huh-7 celler transficeret med con-mimic (ANOVA efterfulgt af Dunnetts

t

test). (F-H) MHCC97H celler blev behandlet som beskrevet i fig. 5F. (F) RT-PCR-analyser af

CD44

EpCAM

; (G) Frit flydende, levedygtige sfærer dannet af MHCC97H celler (bar = 250 um); (H) Sphere kvantificering (middelværdi ± SD, n = 3); ** P 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transficeret med anti-con,

## p 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transficeret med anti-MIR-148a plus con-mimic (ANOVA efterfulgt af Dunnetts

t

test).

Diskussioner

Aktuel kemoterapi mod HCC normalt rettet mod størstedelen bestand af tumor direkte, som er i stand til at skrumpe den primære tumor, men det ikke konsekvent udrydde læsioner . Opdagelsen af ​​CSCS har ændret vores syn på carcinogenese og kemoterapi. CSCS, også blevet kaldt “tumorfremkaldende celler«, har kapacitet til at producere nye tumorer. Baseret på dette koncept, CSCS er ansvarlige for dannelse og vækst af neoplastisk væv og er resistente over for kemoterapeutiske midler, der forklarer, hvorfor de traditionelle lægemidler oprindeligt kan skrumpe en tumor, men undlader at udrydde det, så tilbagefald [24]. Her valgte vi HepG2, Huh-7, og MHCC97H cellelinjer at studere virkningerne af GLA på CSCS-lignende egenskaber, fordi disse cellelinjer udstillede CSCS-lignende egenskaber, og har været anvendt til at undersøge virkningerne af fytokemikalier på CSCS -lignende “side population” celler [24] – [27]

GLA, en Isoflavonoiderne af

G.. glabra L. rødder

, hæmmer tyrosinase-afhængige melanin biosyntesen effektivt, hvilket tyder på, at det kan fungere som en kandidat til hud-lysne stoffer [5]. Desuden er det også blevet forbundet med en lang række biologiske egenskaber, såsom antioxidant, anti-inflammatorisk, østrogene, neurobeskyttende, etc [5] – [7]. Nylige undersøgelser viser de anti-cancer effekt induceret af GLA, at den forhindrer den oxidative DNA fragmentation i UVB-bestrålede humane keratinocyt HaCaT celler [28]; I mellemtiden er det blokerer proliferationen af ​​humane brystcancerceller [8]; Desuden inhiberer migration, invasion, og angiogenese ved at hæmme FAK /Rho-signalvejen [29]; yderligere, det forbedrer også effektiviteten af ​​kemoterapi ved at inhibere P-glycoprotein og multiresistens protein 1 syntese [30]. Her identificerede vi, at GLA svækkede (a) udtrykkene for CD44, CD133, CD90, og EpCAM, (b) kapacitet sfæroiderne dannelse (en markør for selvfornyelse), og (c) kapaciteten af ​​forankringsuafhængig vækst ( en karakter af maligne celler) i HepG2, Huh-7, og MHCC97H celler, hvilket antyder en hidtil ukendt funktion, GLA kunne regulere CSCS-lignende egenskaber i HCC-celler.

i leveren, TGF-β er en vigtig link blandt kronisk skade, skrumpelever, og HCC, og kan serveres som en vigtig målsætning for HCC terapi [15], [31]. TGF-β-signalering initieres af binding af TGF-β til TGF-β-receptor II (TGF-RII), efterfulgt af aktivering af TGFp-RI, Smad2 /3 phosphorylering, og dannelse af SMAD2 /3/4-komplekser [ ,,,0],10]. Der er en sammenhæng mellem TGF-β og CSCS, med de tegn, TGF-β inducerer EMT, hvilket fører til erhvervelsen af ​​CSCS-lignende egenskaber [12], [13]. Her fandt vi, at (a) TGF-β behandling inducerede putative cancer stamceller markører og øget forankringsuafhængig vækst og dannelse af sfæroider i HepG2-celler og (b) knockdown af Smad2 vendt disse virkninger, tyder på, at TGF-β-signalering spillede en vigtig rolle i styrke CSCS-lignende egenskaber i HCC celler. Men en sammenhæng mellem TGF-β og GLA-regulerede CSCS-lignende egenskaber er ikke tidligere blevet undersøgt. I den foreliggende undersøgelse GLA faldt TGF-β-induceret phosphorylering af SMAD2. Vigtigt er, GLA svækket ekspressionen og aktiveringen af ​​endogen SMAD2 i HCC-celler, hvilket viser, at TGF-β /SMAD2 pathway kan være involveret i GLA-inducerede undertrykkende virkning på CSCS-lignende egenskaber i HCC-celler. Salg

miRNA er de ikke-kodende små RNA oligonucleotider, der regulerer genekspression [32]. I flere tumorer nogle miRNA udtrykkes forskelligt i forhold til normale væv [33]. Men de miRNA netværk og deres regulering af mRNA-translation og proteinekspression i de CSCS-lignende egenskaber i HCC celler forbliver, ikke belyst. MIR-148a er en pro-apoptotisk miRNA ved at målrette Bcl-2 [34]. Desuden er inhibering af MIR-148a ved hyper-methylering associeret med metastase i mange tumortyper og med opregulering af metastase-associerede gener [35]. I leveren blev MIR-148a først vist at modulere niveauerne af cytochrom P450 3A4 via post-transkriptionelt regulere 3’UTR af pregnan X Receptor (

PXR

) mRNA [36]. Tidligere undersøgelse tyder på, at miR-148a er involveret i anti-metastase af HCC celler ved de hæmninger af Wnt1-medieret EMT og erhvervelse af CSCS-lignende egenskaber [24]. Her ved hjælp Targetscan 6.2, fandt vi, at miR-148a blev forudsagt at binde

SMAD2

-3 ‘UTR. Desuden knockdown af miR-148a medførte markante udtryk /aktivering af SMAD2 og CSCS-lignende egenskaber i GLA-behandlede HepG2-celler. Endvidere overekspression af MIR-148a faldt ekspressionen /aktivering af SMAD2 og CSC-lignende egenskaber i Huh-7 og MHCC97H celler. Disse resultater tydede på, at inhiberingen af ​​SMAD2 af MIR-148a kan mediere GLA-svækkede CSCS-lignende egenskaber i HCC-celler.

Afslutningsvis GLA svækkede de CSCS-lignende egenskaber ved inhibering af TGF-β /SMADs pathway. Faktisk GLA forbedret udtryk for miR-148a, som målrettet SMAD2-3’UTR og nedreguleret den SMAD2 udtryk /aktivering. Knockdown af MIR-148a afskaffede GLA-induceret hæmning af TGF-β /Smad2 og CSCS-lignende egenskaber i HCC-celler (fig. 7). Forståelse en ny mekanisme, hvorved GLA hæmmer CSCS-lignende egenskaber af HCC celler, kan vores undersøgelse bidrage til at identificere potentielle mål for behandlinger af HCC.

Støtte oplysninger

figur S1. Salg Virkninger af GLA på levedygtigheden og CSCS markører i HepG2 og L-02 celler. (A og B) HepG2 eller L-02-celler blev behandlet med 0, 5, 10, 20, 40, eller 80 pM GLA i 24, 48 eller 72 t. Cellerne levedygtigheder blev evalueret ved WST-8 hydrolyse under anvendelse af et Cell Counting Kit-8 assay. De relative forhold mellem cellelevedygtigheden blev bestemt ved sammenligning af celler udsat for nogen GLA. (C) L-02-celler blev behandlet ved 0 eller 20 pM GLA i 72 timer. QRT-PCR-analyser af ekspressionen af ​​

CD44

,

EpCAM

, og

CD133 Hotel (middelværdi ± SD, n = 3)

doi:. 10,1371 /tidsskrift .pone.0096698.s001

(TIF)

tabel S1.

Primere anvendt til RT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0096698.s002

(DOCX)