PLoS ONE: Kombineret AKT og MEK Pathway Blokade i prækliniske modeller af Enzalutamide-Resistant Prostate Cancer

Abstrakt

På trods af de seneste forbedringer i patienternes resultater ved hjælp af nyere androgen receptor (AR) pathway hæmmere, behandling modstand i kastrationsniveau resistent prostatacancer (CRPC) fortsat er et klinisk problem. Co-targeting alternative modstand veje er af væsentlig interesse for at behandle CRPC og sinke udviklingen af ​​resistens. Både AKT og MEK signalveje blive aktiveret som prostatakræft udvikler resistens over for AR-målrettede behandlinger. Denne præklinisk studie udforsker co-targeting disse veje i AR-positive prostatacancer modeller. Ved hjælp af forskellige

in vitro

modeller af prostatakræft sygdomstilstande, herunder androgen afhængig (LNCaP), CRPC (V16D og 22RV1) og Enz-resistent prostatacancer (MR49C og MR49F), vi evaluerer relevansen af ​​at målrette både AKT og MEK pathways. Vores data viser, at AKT hæmning inducerer apoptose og hæmmer cellevækst i PTEN null cellelinjer uafhængigt af deres følsomhed over for hormonbehandling; dog AKT inhibering havde ingen virkning på den PTEN positive 22RV1 cellelinie. Interessant, fandt vi, at MEK hæmning havde større effekt på 22RV1 celler i forhold til LNCaP, V16D eller Enz-resistente celler MR49C og MR49F celler.

In vitro

, kombination AKT og MEK blokade havde tegn på synergi observeret i nogle cellelinjer og analyser, men dette var ikke konsistent på tværs af alle resultater.

In vivo

, kombinationen af ​​AKT og MEK-inhibering resulterede i mere konsistent tumorvækstinhibering af MR49F xenotransplantater og længere sygdomsspecifikke overlevelse sammenlignet med AKT-inhibitor monoterapi. Som i vores

in vitro

undersøgelse, 22RV1 xenotransplantater var mere resistente over for AKT inhibering, mens de var mere følsomme over for MEK-inhibering. Vores resultater antyder, at målretning AKT og MEK i kombination kan være en værdifuld strategi i prostatacancer når begge veje er aktiveret og støtte yderligere vigtigheden af ​​at karakterisere den dominerende onkogene pathway i hver patients tumor for at udvælge optimale terapi.

Henvisning: Toren P, Kim S, Johnson F, Zoubeidi A (2016) kombineret AKT og MEK Pathway blokade i prækliniske modeller af Enzalutamide-Resistant prostatakræft. PLoS ONE 11 (4): e0152861. doi: 10,1371 /journal.pone.0152861

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: 7. oktober, 2015; Accepteret: 20 Marts 2016; Udgivet: April 5, 2016

Copyright: © 2016 Toren et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af Discovery Grant, prostatakræft Canada og AstraZeneca til A. Zoubeidi. PT blev støttet af den canadiske Urologiske Association Scholarship Foundation. AstraZeneca var involveret i drøftelser om undersøgelsen design og gennemgang af manuskriptet, men indsamling og analyse af data og beslutning om at offentliggøre blev foretaget af forfatterne. De andre finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. AZ beskriver som modtager forskningsstøtte fra AstraZeneca og Gilead Sciences. PT beskriver modtager forskningsstøtte fra Innocrin Pharma. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Medicinsk eller kirurgisk kastration er stadig den første linje af systemisk terapi for metastatisk prostatacancer (PSA), idet dens opdagelse over 70 år siden [1]. Desværre forbliver kur undvigende følgende kastrering og patienter uundgåeligt fremskridt at udvikle kastrationsniveau resistent prostatacancer (CRPC). Potent androgen receptor (AR) pathway hæmmere såsom enzalutamide (Enz) og abiraterone er nu almindeligt anvendt i behandlingen af ​​patienter med CRPC. Mens overlevelse forbedres, modstand alligevel uundgåeligt udvikles til disse midler [2]. Det forventes, at den øgede kliniske anvendelse af disse mere potente AR pathway hæmmere at målretningsmetoder mod ikke-AR drevne modstand veje vil få stigende betydning [3]. Derfor, forståelse og målretning veje impliceret i modstanden har vigtig klinisk relevans.

PI3K /AKT /mTOR og RAF /MEK /ERK signalveje spiller en vigtig rolle i celle overlevelse, behandling modstand, og samarbejde om at gøre PCa progression til CRPC [4-8]. Både AKT [9, 10] og ERK [11, 12] signalveje er opreguleret med CRPC og er forbundet med dårligt resultat [13, 14]. Der er omfattende krydstale mellem disse to veje samt med andre onkogene pathways [15, 16]. Vi har tidligere vist, at både AKT og ERK aktiveres efter behandling med ENZ i PCA-celler [17]. Målretning AKT alene er ikke tilstrækkelig til at fremkalde betinget letalitet på grund feedback signalering fører til aktivering af AR og dermed målrette AKT alene er ikke en god strategi til bekæmpelse af Enz modstand [18]. Interessant, har dobbelt hæmning af P 3K /AKT og MEK /ERK veje vist lovende i prækliniske modeller for andre kræftformer [19-22]. Resultater af kombinationen af ​​en mTOR-hæmmer med en MEK-inhibitor i den transgene

NKx3

.

1-PTEN

murine prostatakræft model understøtter yderligere den logiske begrundelse for en kombineret tilgang i prostatakræft [14] terapi.

Derfor er vi sat til at undersøge kombination AKT plus MEK-hæmmer i humane prostatakræft modeller, især Enz-resistente prostatacancer modeller. Vi valgte et panel af cellelinjer, herunder ENZ-resistente LNCaP-afledte cellelinjer samt 22RV1 cellelinie. Den 22RV1 prostatakræft cellelinje besidder aktivering af MEK /ERK-vejen [23], mens Enz-resistente MR49C og MR49F anerkendes at være mere afhængige af AKT-vejen [24]. Vi viser, at kombinationen blokade af AKT og MEK bliver bedre respons sammenlignet med monoterapi i nogle af ourin

in vitro

og

in vivo

prostatakræft eksperimenter. Især resultaterne varierer betydeligt mellem modelsystemer med fraværet af yderligere fordel i nogle tilfælde, hvilket understreger behovet for passende identificere, hvilke patienter vil drage størst fordel af en kombination tilgang.

Materialer og metoder

prostatakræft cellelinjer

Den menneskelige prostatakræft LNCaP og 22RV1 cellelinjer anvendt i denne undersøgelse blev venligst stillet til rådighed af Dr. Leland WK Chung [25] (1992 MDACC, Houston Tx). V16D (kastrere resistent), MR49F og MR49C celler (enzalutamide resistente) blev afledt via seriel xenograft passage af LNCaP-celler som tidligere beskrevet [26] (S1 Fig). Kort fortalt blev LNCaP-celler injiceret i mus og når serum PSA nåede 50 ng /ml mus blev kastreret. Når serum PSA igen nåede 50 ng /ml 5-6 uger senere blev tumorer kaldet kastrationsniveau resistente. V16D celler blev afledt fra en LNCaP xenotransplantat resistente over for kastration. Tumorer blev udskåret og cellelinier blev frembragt i androgen-frie medier. For MR49C og MR49F cellelinier, når LNCaP xenotransplantater nået den resistente tilstand kastrationsniveau blev de behandlet med 10 mg /kg ENZ med en efterfølgende PSA fald til lave serumværdier. Når serum PSA returneres til kastrere resistente niveauer eller højere blev tumorer kaldet ENZ-resistente. Disse tumorer blev derefter ledt 3 gange i kastrationsniveauer mus behandlet med Enz og cellelinier blev frembragt. Celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære med 10 pM ENZ tilsat til alle medier for MR49C og MR49F celler.

Reagenser

AKT-inhibitor AZD5363 blev leveret af AstraZeneca (Macclesfield, UK). ENZ blev købt fra Shanghai Haoyuan Chemexpress (Shanghai, Kina), PD0235901 fra Selleck Chem (Houston, TX) og LY294002 og UO126 fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). LY294002 er en reversibel PI3K-inhibitor; AZD5363 er en konkurrencedygtig pan-AKT-hæmmer [27]. PD0325901 er en konkurrencedygtig MEK1 /2-hæmmer, mens UO126 hæmmer MEK1 /2 i en ikke-konkurrencedygtig, selektiv måde [28]. Stamopløsninger af AZD5363, PD0235091, UO126 og LY294002 udarbejdet i dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich); ENZ blev fremstillet i H

2O.

celleproliferation assays

Cellelevedygtighed blev vurderet i 96-brønds dyrkningsplader ved anvendelse af WST-1 reagens og /eller krystalviolet assay som beskrevet tidligere [26].

Cell cyklus analyse

Cell cyklus analyse med propidiumiodidfarvning blev udført som tidligere beskrevet [29]. Relativ DNA-indhold blev analyseret ved FACS Canto II flowcytometer ved hjælp af cyflogic V1.2.1 software (www.cyflogic.com) til analyse.

Caspase-3-aktivitet assay

Caspase-3 aktivitet var vurderet ved hjælp af caspase 3 Assay kit, med acetyl Asp-Glu-Val-Asp 7-amido-4-methylcoumarin (Ac-DEVD-AMC) fluorometrisk substrat (Enzo Scientific). Tredive mikrogram helcellelysat blev inkuberet med caspase-3 substrat AC-DEVD-AMC ved 37,5 ° C i 2,5 timer og caspase-3-aktivitet blev kvantificeret med et fluorometer med excitation sat til 365 nm og emission 460 nm. Fold ændre forskelle fra kontrol blev beregnet følgende subtraktion af aflæsninger fra tomme brønde uden lysat.

Western blot-analyse

I alt proteiner blev udvundet i RIPA buffer som beskrevet tidligere [29]. 30-50 ug protein lysat blev separeret ved SDS-PAGE og western blot blev udført ved anvendelse primære antistoffer PSA, AR (Santa Cruz Biotechnology), vinculin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), PARP, p-AKT Ser473 , AKT, p-ERK, total ERK, total S6 og p-S6 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Påvisning af sekundære antistoffer blev udført ved anvendelse af ODYSSEY IR imaging system (Li-COR Biosciences) eller ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

Kvantitativ revers transskription (RT) -PCR

RNA-ekstraktion og RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [30]. Real time overvågning af PCR-amplifikation af cDNA blev udført ved hjælp af følgende primerpar og prober:

AR

(Hs00171172_m1),

PSA

(Hs00426859_g1), og

GAPDH

(Hs03929097_g1 ) (Applied Biosystems, Foster City, CA) på ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) under anvendelse af TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems). Target genekspression blev normaliseret til

GAPDH

niveauer i de respektive prøver som en intern kontrol.

Animal behandling

Seks uger gammel mand kastrerede athymiske nøgne mus (Harlan Sprague-Dawley, Inc.) blev injiceret subkutant med 2×10

6 MR49F celler (suspenderet i 0,1 ml Matrigel; BD Biosciences) på begge flanker. Ni mus pr arm blev randomiseret til køretøjer (0,1% methylcellulose), AZD5363 100mg /kg BID, PD0325901 5 mg /kg OD eller kombinationen. ENZ 10mg /kg blev administreret før inokulering og fortsatte indtil tumorerne nåede 200 mm

3. Tumor målinger blev målt hver anden uge og tumor volumen beregnes ved hjælp af formlen L x B x D x 0,5236. Lægemidler blev indgivet som en oral sondeernæring 5 dage på, 2 off. PSA-niveauer blev målt ugentligt under anvendelse automatiseret enzymatisk immunassay (Cobas, Montreal, Quebec, Canada). Mus blev aflivet, hvis den samlede tumorbyrde var 2000mm

3 eller havde 20% tab af kropsvægt. For 22RV1 xenotransplantater, 2×10

6 celler blev inokuleret i venstre flanke hos nøgne kastreringsniveauer mus. Otte mus pr arm blev randomiseret til køretøj, AZD5363 100 mg /kg BID, selumitinib (AZD6244; Arry-142.886) 25 mg /kg BID, og ​​kombinationen. De 22RV1 xenotransplantater blev aflivet, da tumor volumen var 1500mm

3. Alle mus blev overvåget regelmæssigt for deres kliniske tilstand under tilsyn af en dyrlæge ved University of British Columbia. Ved aflivning blev alle mus dybt bedøvet med isofluran før den aflivet med CO2. Tumorer indsamlet ved aflivning blev inddelt i dele og lynfrosset i flydende nitrogen eller fikseret i formalin. Alle dyreforsøg blev udført i henhold til canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer og med godkendelse af Animal Care udvalg fra University of British Columbia (protokol # A12-0210).

Immunhistokemi

En væv microarray af alle MR49F xenotransplantattumorer blev konstrueret ved hjælp af en manuel væv microarrayer (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI). Immunhistokemisk farvning blev udført som tidligere beskrevet [31]. Alle sammenligninger af farvningsintensiteter blev udført ved 20X forstørrelse på tredobbelte prøver af en patolog blindet for behandlingen opgave.

Statistisk analyse

Alle resultater er udtrykt som middelværdi ± SEM, med én-vejs ANOVA anvendes til at påvise signifikante forskelle mellem flere behandlinger. Når ANOVA viste signifikante forskelle (p 1 indikerer synergi, et CI 1 angiver antagonistiske vekselvirkninger

Resultater

Effekt af målrettet MEK og AKT veje på AR signalvej

For at undersøge. relevans AKT og MEK veje i PCa, vi målrettet respektive veje ved hjælp AZD5363 (AKT-inhibitor) og PD0325901 (MEK-inhibitor). Vi evaluerede deres virkninger alene og i kombination i modeller for forskellige stadier af prostatakræft, herunder androgen følsomme celler (LNCaP), kastrere resistente (V16D, 22RV1) og Enz-resistente celler (MR49C og MR49F) (figur 1). Blokering AKT med AZD5363 blev evalueret af dens virkning på AKT nedstrøms effektor p6SK og ikke på AKT fosforylering sig selv på grund af arten af ​​AZD5363. Dybest set, AZD5363 inducerer øget AKT phosphorylering som er inaktiv, et fænomen forekommer med mange ATP konkurrencedygtige, katalytisk inhibitorer af AKT, og skyldes, at proteinet bliver holdt i en hyperphosphoryleret men katalytisk inaktiv form som en konsekvens af forbindelse binding som tidligere er blevet etableret . AZD5363 viste sig at inducere et fald i S6K phosphorylering i alle cellelinjer; denne effekt var mere udtalt i PTEN nulceller MR49C, MR49F, LNCaP- og V16D celler sammenlignet med PTEN positive 22RV1 celler (figur 1). Lignende effekter blev observeret ved anvendelse af andre MEK-inhibitor (UO126) og AKT-inhibitor (LY294006) eller i kombination med Ay (figur 1, S2 Fig). I 22RV1 celler, PD325901 helt ophæver ERK fosforylering mens AZD5363 havde ingen effekt på AKT nedstrøms effektor S6K fosforylering, som kun var med kombination af AZD5363 og PD0325901 (figur 1). Der blev imidlertid ikke yderligere fald i Perk niveauer observeret med kombinationen sammenlignet med MEK-inhibitor monoterapi. Desuden observerede vi, at AKT inhibition øgede både AR og PSA med protein og RNA-niveauer i LNCaP og dets derivater (Fig 1). Selvom AZD5363 steg AR og PSA niveauer i alle cellelinjer, virkningen af ​​PD0325901 på AR og PSA niveauer alene eller i kombination med AZD5363 varierede mellem cellelinier (figur 1). I modsætning til LNCaP-baserede cellelinjer, blev PSA yderligere forøget ved kombinationen af ​​AZD5363 og PD0325901 i 22RV1 celler. Især disse resultater spejlet lignende data med den tidligere testede vellykket kombination af AZD5363 og ENZ hvor ændringerne i AR udtryk også afveg mellem 22RV1 og LNCaP-baserede cellelinjer (S2 Fig) [32]. Tilsammen konkluderer vi, at AKT og MEK samarbejder om at regulere AR vej.

(A) Effekt af AKT og MEK hæmning på nedstrøms signalveje. Androgenafhængige PCa LNCaP, CRPC (V16D og 22RV) og Enz resistente cellelinier MR49C blev MR49F cellelinier behandlet med AZD5363 1 uM, PD0325901 20 pM alene eller i kombination i 48 timer. Totale proteiner blev ekstraheret og western blots blev udført ved anvendelse af AR, PSA og PI3K /AKT pathway signalering proteiner som angivet. Repræsentative blots af identiske eksperimenter er vist. (B-C) Effekt af AKT og MEK hæmning på AR vej. MR49C, MR49F og 22RV cellelinjer blev behandlet med AZD5363 1 uM, PD0325901 20 uM alene eller i kombination i 48 timer. RNA blev ekstraheret fra forskellige cellelinier og kvantitativ real tid blev udført under anvendelse Taqman prober til AR (B) og AR målgen PSA (C). Repræsentative resultater af biologiske dubletter med tekniske tredobbelte vises.

Effekt af kombination af MEK og AKT blokade på celle apoptose og proliferation

For at bestemme den biologiske aktivitet af målrettet AKT og MEK signalering veje på celle apoptose, vi behandlede vores panel af cellelinier med AZD5363, PD0325901 eller kombinationen. Vores data viser, at kombinationen af ​​målretning AKT og MEK inducerer apoptose som vist ved forøget sub G0 /G1 cellecyklus population. Denne virkning var større end AZD5363 monoterapi i CRPC celler V16D (17% vs 10%, P = 0,009) og ENZ-resistent MR49C (29% vs. 12%, p = 0,005) og MR49F (12% vs 3%, p = 0,006 ) celler. Ingen af ​​de behandlinger udstillet væsentlige ændringer i sub G1 /G0 fraktionen i 22RV1 celler (Fig 2). I modsætning hertil i androgen-sensitive LNCaP-celler, kombinationsbehandling terapi viste ikke yderligere induktion af sub G1 /G0 sammenlignet med AZD5363 monoterapi (17% vs. 16%, p = 0,76). S-fasen og G2 /M fraktioner syntes at falde til et tilsvarende beløb i MR49C, MR49F og V16D celler med AZD5363 eller kombinationen med betydelige forskelle for begge behandlinger fra kontrol (P 0,001). Desuden AZD5363 og PD325901 kombinationsbehandlingen induceret spaltet PARP i LNCaP-baserede cellelinjer sammenlignet med PTEN positive celler 22RV1 celler (Fig 2). Mens ikke statistisk forskellige, blev lignende tendenser observeret med caspase 3 aktivitetsassays (fig 2).

(AE) propidiumiodid flowcytometri cellecyklusanalyse af angivne cellelinjer viser forøget apoptotisk cellecyklus fraktion (SubG1 /G0) (venstre paneler). Middelværdier af tredobbelte eksperimenter er afbildet +/- SEM. Repræsentative resultater af alle cellecyklus populationer er vist i højre paneler. (F) viste celler blev behandlet med AZD5363 1 uM, PD0325901 20 uM, eller kombinationen i 48 timer. Proteiner blev ekstraheret og western blot blev udført ved anvendelse PARP-antistof, vinculin blev anvendt som en loading kontrol. Repræsentative blots af to eller flere forsøg er vist. (G) Caspase-3-aktivitet i MR49C, MR49F, 22RV1, LNCaP og V16D cellelinier behandlet med AZD5363 og /eller PD0325901 i 24 timer. Mean fold ændring +/- SEM af poolede værdier fra mindst to biologiske dubletter er vist.

Vi undersøgte det næste, hvis den observerede i celleapoptose virkning kan oversættes til cellelevedygtighed. Vore data viser, at målretning AKT hjælp AZD5363 påvirker cellernes levedygtighed i alle testede cellelinier (figur 3), mens målretning MEK under anvendelse af enten PD0325901 (figur 3) eller UO126 (S3 Fig) havde større aktivitet i 22RV1 celler sammenlignet med de andre cellelinier yderligere bekræfter vores data på cellecyklus befolkning og PARP-spaltning. Selvom vi observerede tendenser for nedsat levedygtighed og synergi med kombinationen sammenlignet med monoterapi i LNCaP celler og V16D celler, i MR49C og MR49F celler kombinationen ikke forekommer synergistisk (figur 3). Dette blev yderligere bekræftet ved hjælp af kombinationen af ​​MEK inhibitor U0126 med AKT-inhibitor LY294006 i MR49C, MR49F celler (S3 Fig). Synergi blev observeret i 22RV1 celler med en kombination indeks. 1 (fig 3, S3 Fig)

(AE) MR49C, MR49F, 22RV1, LNCaP og V16D cellelinjer blev behandlet med AZD5363 og /eller PD0325901 som angivet i 48 timer og cellelevedygtigheden blev vurderet ved anvendelse WST-1 assay. Samlede resultater af biologiske triplikater med tekniske tredobbelte vises. Kombination indekser vises indsat, med værdier. 1 indikerer synergi

Målretning AKT og MEK veje i kombination hæmmer tumorvækst og forbedret kræft specifik overlevelse

Da aktiviteten af ​​kombinationsbehandling viste forskelle relateret til PTEN udtryk, vi undersøgte

in vivo

hvordan målrettet AKT og MEK vil påvirke tumorvækst i to mulige kliniske indstillinger (PTEN positive og negative tumorer). Vi brugte ENZ-resistente MR49F celler og CRPC 22RV1 celler til at vurdere

in vivo

effekten af ​​kombinationen af ​​at målrette AKT og MEK veje.

De MR49F xenografter blev følsomme over for AZD5363, hvilket gør vurderingen af yderligere fordel med MEK blokade udfordrende. Monoterapi behandling med PD0325901 demonstrerede tumorvækst hæmning og viste en ikke-signifikant tendens til lavere serum PSA i forhold til køretøjet (figur 4). Kombinationsbehandling med AZD5363 og PD0325901 i MR49F xenotransplantater resulterede ikke i større fald i tumorvolumen i forhold til AZD5363 monoterapi, men kombinationen havde signifikant forbedret cancer specifik overlevelse (CSS) (P 0,001) sammenlignet med optaget fra en bil og PD0325901- behandling arme (fig 4). Median CSS var 17 dage for vehikelbehandlede mus, 25 dage for PD0325901-behandlede mus, og blev ikke nået i enten alene eller i kombination med PD0325901 AZD5363. Nr mus i kombinationsarmen blev aflivet på grund af tumorstørrelse efter 35 dages behandling. Serum PSA blev signifikant reduceret i både AZD5363 og kombinationsbehandlingen arme sammenlignet med bærer (figur 4).

Efter etablering af tumorer (200mm3) fra subkutan injektion af Enz resistente MR49F celler hos kastrerede mus under pres af 10 mg /kg daglig af ENZ blev mus behandlet med 100 mg /kg, AZD5363 100mg /kg BID, PD0325901 5mg /kg QD eller AZD5363 100 mg /kg BID + PD0325901 5 mg /kg QD. (A) Repræsentative data for MR49F betyde tumorvolumen over 4 uger er vist. (B) Mean MR49F tumorvækst hastighed for hver behandlingsgruppe +/- SEM beregnet ved anvendelse af lineær regression estimering af tumorvækst hastighed for hver mus. (C) Mean MR49F ugentlig PSA plottet som fold ændring fra baseline for hver behandlingsgruppe +/- SEM. (D) vandfaldsdiagram af individuelle PSA-målinger efter 3 ugers behandling for alle MR49F xenotransplantater i undersøgelsen. (E-F) Kaplan-Meier kræft specifik overlevelse og samlet overlevelse kurverne for behandling arme MR49F xenografter. (G) Mean 22RV1 xenograft volumen efter behandling med køretøj, AZD5363 100 mg /kg BID, selumetinib 25 mg /kg QD eller AZD5363 100 mg /kg BID + selumetinib 25 mg /kg QD. Mean gange ændring i tumorstørrelse plottes +/- SEM. (H) Waterfall plot af 22RV1 xenograft tumorvolumener efter 6 ugers behandling.

Vi næste vurderede kombinationen af ​​AKT og MEK pathway hæmning hjælp 22RV1 xenografter i kastrerede mus. AZD5363 blev igen brugt som en AKT-inhibitor, mens Selumetinib blev valgt som en MEK-inhibitor, som kan være mere klinisk relevant, da det er i øjeblikket i klinisk evaluering og blev for nylig godkendt til behandling af modermærkekræft. I modsætning til MR49F model, 22RV1 tumorer var relativt ufølsom over for AZD5363, men gjorde demonstrere tumor væksthæmning til både Selumetinib og kombinationen af ​​Selumetinib plus AZD5363. Med alle 22RV1 tumorer vokser relativt robust på trods af behandling, fandtes ingen signifikante forskelle mellem behandlingsarmene, selvom den største hæmning af tumorvækst blev set med kombinationsbehandling (Fig 4).

Analyse af de enkelte mus tumorvolumener hos den MR49F model antyder, at kombineret blokade kan opnå en delmængde af mus (Fig 5). I AZD5363 monoterapiarmen, mens de fleste tumorer reagerede på udvalgte tilfælde tumorvækstinhibering var minimal. Men i kombinationsterapigruppen, blev der ikke outliers bemærket (Fig 5). Især immunohistokemi farvning af MR49F tumorer demonstrerede pERK farvning i de mus, som viste resistens mod AZD5363 (figur 5). Ingen signifikant pERK farvning blev set i de mus, der responderede på behandlingen (figur 5), eller var forskelle i PS6 farvning eller Ki67 farvning påvist mellem kombinationsbehandling og AZD5363 monoterapi arm (figur 5).

(A) individuelle tumor vækstkurver for alle mus i undersøgelsen grupperet efter behandling. (B) Immunhistokemi af pERK demonstrerer påviselige niveauer i 3 mus med tidlig resistens mod AZD5363 behandling (øverst); 3 andre mus behandlet med AZD5363 er vist til sammenligning (nederst). (C) Farvning af microarray prøver viser, at positiv pERK farvning var kun tydelig i disse mus. (D) Andelen af ​​PS6 reduceres med AZD5363 og i højere grad med kombination AZD5363 + PD0325901. (E) Ki67-farvning som markør for proliferation. Væv microarray blev bygget ved hjælp af tumor prøver i hver gruppe (7-9 per gruppe). Mean snesevis af farvningsintensitet klassificeret af en blindet patolog vises +/- SEM.

Diskussion

På trods af succesen med kastration og nyere potent AR pathway hæmmere såsom enzalutamide, behandling modstand forekommer i alle tilfælde. Vedvarende AR signalering er normalt klinisk evident af en stigende PSA. Den vedvarende AR-signalering kan være drevet af flere resistensmekanismer, herunder AR splejsningsvarianter, intratumoral produktion af androgener og aktivering af alternative veje, der understøtter AR signalering, herunder AKT og MEK veje [33]. Kombinationsbehandling i PCa rummer potentiale for at øge patientens overlevelse ved at blokere disse modstand veje.

Tidligt klinisk erfaring i PCA patienter tyder på, at målrette AKT alene er ikke en effektiv strategi. Kliniske forsøg med AKT-hæmmer monoterapi i CRPC har vist begrænset succes med denne tilgang [34, 35]. Forud

in vitro

arbejde tyder på, at PI3K /AKT inhibering kan resultere i opregulering af Raf /MEK /ERK pathway [36], og vores resultater i MR49F xenograft model antyder også dette kan forekomme i nogle tilfælde . Den velkendt krydstale mellem disse veje giver en begrundelse for at kombinere begge disse inhibitorer [19-22, 37-39]. Klinisk erfaring med dobbelt målretning af MEK og AKT veje er begrænset; tidlige resultater i avancerede maligniteter tyder på, at dobbelt målretning af begge veje forbedrer onkologisk effekt på bekostning af større toksicitet [40].

Vores undersøgelse fremhæver de forskelle, der kan opstå mellem AR positive PCA modeller og især relevansen af ​​PTEN status, når målrettet AKT og MEK veje. Interessant, rettet mod AKT-vejen øget PSA transskription i de overlevende celler og denne effekt, bemærkede tidligere af andre [41], kan være vigtigt at overveje i udformningen af ​​fremtidige kliniske forsøg med disse målrettede midler, da PSA er almindeligt anvendt som en markør for progression. I LNCaP-afledte ENZ-resistente modeller, MEK inhibering tilsat en beskeden fordel sammenlignet med AKT inhibering; interessant synergien optrådte større

in vivo

end

in vitro

. I 22RV1 celler, MEK hæmning alene haft betydelig indvirkning på celleproliferation og signalering, men kombinationen af ​​MEK og AKT hæmning viste minimal ekstra fordel

in vitro

. Medens forbedringer i anticanceraktivitet blev bemærket af nogle målinger med kombinationen i hver model, hver model forekom relativt afhængige AKT og MEK, henholdsvis, hvilket begrænser fordelen ved kombinationsbehandlingen.

Kombineret målretning af MEK og AKT-vejen er blevet undersøgt i flere andre kræftformer i prækliniske modeller, med resultater, støtte brugen af ​​kombinationen [19-22, 37-39]. I en præklinisk prostatacancer

in vivo

undersøgelse, PD0325901 blev vurderet i kombination med mTOR inhibitor rapamycin [14]. Mens vi ikke iagttage nogen signifikant fald i Ki67 med kombinationen, kan dette være relateret til opsamling alle vores tumorer ved afslutningen af ​​studiet på hvilket tidspunkt de xenotransplantattumorer var behandlingsresistente. For nylig, Park et al, viste kombinationen af ​​selumitinib og den pan-PI3K hæmmer GSK2126458 forbedret tumor væksthæmning i forhold til enten monoterapi i AR-negative DU145 og PC3 xenografter [42]. Samlet, deres resultater i AR-negative modeller kan sammenlignes med vores resultater. Tilsammen vore data antyder, at effektiviteten af ​​målretning AKT og MEK er uafhængig af sygdomstilstanden af ​​prostatacancer, og at effekten korrelerer med aktiveringen af ​​disse veje i tumoren.

Vores undersøgelse er begrænset af flere aspekter af vores prostatakræft modeller. LNCaP-celler synes at være stærkt afhængig af AKT-vejen. Ikke desto mindre, som AR positive, PSA-producerende cellelinier med en aktiveret PI3K /AKT pathway, de ligner en sædvanlig CPRC fænotype stødt [43]. Desuden vores ENZ-resistente modeller demonstrere flere fænotyper svarer til klinisk ENZ-resistent sygdom, såsom vedvarende AR kernelokalisering, AR F876L mutationen, og opregulering af steroiodogenic enzymer [26, 32, 44]. 22RV1 celler havnen androgen splejsningsvarianter, der forudsiger en dårligere respons på AR-pathway hæmmere [45]. Tilstedeværelsen af ​​enzalutamide-agonistisk F876L mutationen og tilstedeværelsen af ​​dominerende AR splejsning varianter begrænset vores evne til at teste for effektiviteten af ​​kombineret AKT og MEK hæmning sammen med AR hæmning i fremskreden prostatacancer modeller. Endvidere mens vores in vitro-undersøgelser ikke er blevet foretaget i androgen mangelfuld medier, er det uklart, om dette ville resultere i markant forskellige resultater, især da CRPC tumorer kan producere deres egne androgener gennem

de novo

syntese veje [46] . Derfor vores resultater i kastrationsniveauer betingelser

in vivo

var ikke væsentligt forskellige.

Som konklusion, vores resultater i Enz-resistente CRPC celle modeller tyder på, at kombinationsbehandling med AKT og MEK hæmning kan være en rationel kombination i en delmængde af resistent prostata kræfttilfælde behov yderligere undersøgelser. Vores resultater tyder også vigtigheden af ​​at målrette inhibitorer til tumor veje, som vides at blive aktiveret; i godt udvalgte patienter monoterapi kan være så effektiv som kombinationsbehandling. Samlet set understreger behovet for rationel, biomarkør-drevet udvælgelse af patienter som målrettede lægemidler evalueres i kliniske forsøg.

Støtte Information

S1 Fig. MR49C celler er resistente over for ENZ.

5×10

4cells blev podet i plader med 12 brønde, derefter behandlet med forskellige koncentrationer af ENZ (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 uM). Efter 72 timers eksponering, dyrkningsmediet ændret frisk medier alene (Gendan) eller med ENZ (fortsætte). 48hrs senere blev cellelevedygtigheden analyseret med krystalviolet assay

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152861.s001

(TIF)

S2 Fig. Virkning af kombination AKT plus MEK inhibering med alternative inhibitorer på cellesignalering.

(A) MR49C og MR49F cellelinjer blev behandlet med LY294006 20 uM, UO126 10 uM eller kombination i 48 timer.