PLoS ONE: Wogonin har flere anti-cancer effekter ved at regulere c-myc /SKP2 /Fbw7α og HDAC1 /HDAC2 Pathways og inducere apoptose i Human Lung adenocarcinomacellelinie A549

Abstrakt

Wogonin er en plante monoflavonoid som er blevet rapporteret at inhibere cellevækst og /eller inducere apoptose i forskellige tumorer. Den foreliggende undersøgelse undersøgte apoptose-inducerende aktivitet og underliggende virkningsmekanisme wogonin i A549-celler. Resultaterne viste, at wogonin var en potent inhibitor af levedygtigheden af ​​A549-celler. Apoptotisk protein ændringer opdages efter udsættelse for wogonin omfattede nedsat XIAP og Mcl-1-ekspression, øget kløvet-PARP udtryk og øget frigivelse af AIF og cytotchrome C. Western blot analyse viste, at aktiviteten af ​​c-myc /Skp2 og HDAC1 /HDAC2 veje, som spiller en vigtig rolle i tumor fremskridt, blev nedsat. Kvantitativ PCR identificerede forhøjede niveauer af c-myc mRNA og nedsat niveau af sin protein. Protein niveauer af Fbw7α, GSK3p og Thr58-Myc, som er involveret i c-myc ubiquitin-afhængige nedbrydning, blev også analyseret. Efter udsættelse for wogonin, Fbw7α og GSK3p udtryk faldt og Thr58-Myc udtryk steget. Men MG132 var ude af stand til at forhindre c-myc nedbrydning. De foreliggende resultater tyder på, at wogonin har flere anti-cancer effekter forbundet med nedbrydning af c-Myc, SKP2, HDAC1 og HDAC2. Dens evne til at inducere apoptose uafhængigt af Fbw7α tyder på en mulig anvendelse i lægemiddel-resistens cancer relateret til Fbw7 mangel. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, hvilke veje er relateret til c-myc og Fbw7α vending, og om Thr58 phosphorylering af c-myc er afhængig af GSK3p

Henvisning:. Chen Xm, Bai Y, Zhong Yj, Xie Xl, Long Hw, Yang Yy, et al. (2013) Wogonin har flere anti-cancer effekter ved at regulere c-myc /SKP2 /Fbw7α og HDAC1 /HDAC2 Pathways og inducere apoptose i Human Lung adenocarcinom cellelinje A549. PLoS ONE 8 (11): e79201. doi: 10,1371 /journal.pone.0079201

Redaktør: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina

Modtaget: Januar 23, 2013; Accepteret: September 20, 2013; Udgivet: November 12, 2013 |

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Guizhou-provinsen, Kina ([2012] 7006 og NY [2011] 3072); Guangzhou Medical College (2012C16); Fonden for Unge Forskere i Guangzhou Educational Committee (2012C118). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af det store antal af kliniske forsøg, der skal forbedre patientens overlevelse, lungekræft fortsat en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan i både mænd og kvinder. Ca. 85% af alle tilfælde af lungekræft er kategoriseret som ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som typisk diagnosticeret på fremskredne stadier [1]. Lung adenocarcinom, den dominerende histologiske undertype af NSCLC, tegner sig for 20 til 30% af tilfældene primære lungekræft blandt forsøgspersoner under 45 år, uanset rygevaner [2]. De fleste tilfælde af NSCLC er uegnede til kirurgi og kemoterapi fortsat er hjørnestenen i behandling for fremskreden sygdom.

HDACi (HDAC) er enzymer, der fjerner histonacetylering produkter. Denne proces komprimerer strukturen af ​​kromatin og undertrykker transkription [3]. HDAC’er virker på forskellige nonhistone proteinsubstrater, som spiller en rolle ved reguleringen af ​​genekspression, celleproliferation, cellemigration, celledød og angiogenese [4]. Data fra prækliniske undersøgelser har vist, at naturligt forekommende og syntetiske histondeacetylaseinhibitorer har kraftig anticancer-aktivitet.

HDAC1 og HDAC2 hører til klasse I histondeacetylase (HDAC) familie. In vivo, disse enzymer danne komplekser med Sin3, NuRD og Co-REST [5]. HDAC1 og HDAC2 også binde direkte til DNA-bindende proteiner, såsom YY1, Rb bindende protein-1 og Sp1 [5].

c-Myc er en transkriptionsfaktor, som er ansvarlig for at regulere et array af gener involveret i cellulær proliferation, vækst, apoptose og differentiering [6]. Dereguleret c-myc-ekspression er observeret i omtrent 70% af alle humane tumorer [10]. c-Myc-ekspression reguleres af gentranskription, og er afhængig af mRNA-stabilitet og posttranslationel kontrol med proteinstabilitet [7] -. [9]

posttranslationel regulering af c-Myc kan medieres ved Skp2 (S- fase kinase-associeret protein 2) og Fbw7 (F-box og WD gentag domæne-holdige 7) [11]. Skp2 og Fbw7 er to forskellige anerkendelse underenheder af SCF-typen E3 ligase (SCF, Skp1 /Cullin /F-box protein komplekser), der genkender specifikke substrater for proteasomalaktivitet nedbrydning. Regulering af c-Myc involverer phosphorylering af c-Myc ved Thr58, hvilket resulterer i Fbw7-medieret proteasomalaktivitet nedbrydning. Glycogensynthasekinase 3β (GSK3p) er den eneste kinase vides at phosphorylere c-Myc ved Thr58 [24].

Skp2 er et lovende mål for begrænsning cancer stamceller og kræft progression [12], er det overekspression er ofte observeret i human cancer, og det kan derfor virke som et onkogen. Til støtte for denne hypotese har Skp2 blevet vist at genkende cyclinafhængige kinase (Cdk) hæmmere og tumor suppressive proteiner, såsom P27 Kip1 (cyclinafhængige kinaseinhibitor 1B), p57 Kip2 (cyclinafhængige kinaseinhibitor 1C), p130 ( 130 kDa retinoblastoma-associeret protein) og Tob1 (transducer af erbB-2 1), men ikke c-myc [13] – [16]. Skp2-medieret dannelse af ubiquitin fra c-myc sker uafhængigt af phosphorylering [25].

Fbw7 mangel menes at være involveret i lægemiddelresistens i humane cancere [22], [23]. Det har vist sig at blive inaktiveret ved mutation, deletion, eller promotor hypermethylering i brystcancer [17], [18], tyktarmskræft [19], [20], og leukæmi [21]. Fbw7 udtrykkes som tre forskellige isoformer (betegnet α, β og y) henholdsvis placeret i α-kernen, β-cytoplasma, og γ-kernelegeme [26], [27]. Da der ikke er nogen antistoffer til disse tre isoformer vi brugt bedst beskrevet og længste af de tre isoformer Fbw7α, i vores eksperimenter med wogonin.

Wogonin (5, 7-dihydroxy-8-methoxyflavanon) er et naturligt monoflavonoid udvundet fra

Scutellaria baicalensis

radix [28], der er blevet anerkendt som en anticancer lægemiddelkandidat med potentielt lav toksicitet [29]. Anticancer aktivitet af wogonin er blevet rapporteret forskellige humane cellelinjer, herunder myelomcellelinje RPMI 8226 [30], hepatocellulær carcinoma SK-HEP-1 [31] og SMMC-7721 [32], gliom cancerceller [33], nasopharyngeale carcinomaceller [ ,,,0],34], humane brystcancerceller [35], [36] og humane cervical carcinoma HeLa-celler [37]. Dets aktivitet medieres ved induktion af apoptose og celledifferentiering, og reguleres af forskellige gener og proteiner [38] – [41]

I denne undersøgelse vurderede vi virkningerne af wogonin på cellelevedygtighed og apoptose. i human lunge adenocarcinom epitelcellelinie A549. Vi vurderede også regulering og funktion af c-myc /Skp2 /Fbw7α og HDAC1 /HDAC2 veje involveret i apoptotisk effekt.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

Wogonin blev indkøbt fra Guangzhou IDC (Kina) og MG132 (carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal) blev opnået ud fra (Beyotime, Kina). Følgende antistoffer blev anvendt: Fbw7 (Cdc4, H-300) og p-c-Myc (Thr 58) (Santa Cruz, USA); c-Myc, GSK3p, AIF (apoptoseinducerende faktor, Proteintech Group, Inc., USA); HDAC1, HDAC2, Skp2, Survivin, Bcl-2 (B-cellelymfom 2), β-Actin (Boster, Kina); MCL-1 (myeloid celleleukæmi sekvens 1), XIAP (X-bundet inhibitor af apoptose protein, BIOSs, Kina); Cytochome c (Keygen, Kina); PARP (poly ADP-ribose polymerase, Sino Biological Inc., Kina).

Cell Culture

Den menneskelige lunge adenocarcinom cellelinje A549 blev opnået fra Cell Bank of Animal Experiment Center, North Skole Region, Sun Yat-Sen University. Cellerne anvendt i forsøgene blev holdt i vores laboratorium i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (Holly blade, Kina) ved 37 ° C og 5% CO

2.

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid ( MTT) Cell Vaibility Assay

Celler høstet med trypsin blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 per brønd. Efter inkubation natten over, blev dyrkningsmediet fjernet, og cellerne blev inkuberet med forskellige koncentrationer af wogonin. Efter eksponering for wogonin i 24, 48 eller 72 timer blev cellerne inkuberet med MTT ved 37 ° C i yderligere 4 timer. Dette tillod mitokondrie-dehydrogenase for at omdanne MTT til uopløselige formazankrystaller. Dyrkningsmediet blev derefter kasseret, og 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat til hver brønd for at opløse formazan-krystallerne. Absorptionen af ​​solubiliseret formazan blev målt ved 490 nm under anvendelse af en EL340-mikropladelæser (Bio-Tek. Instruments, Winooske, VT).

kernefarvning

A549-celler blev farvet med et DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol) farvning kit (keygen, Kina). Efter eksponering for graduerede koncentrationer af wogonin i 48 timer, blev cellerne vasket og inkuberet med en DAPI arbejdsopløsning (1-2 ug /ml) i 15 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev derefter skyllet med methanol og puffer A (60% glycerol i 10 mM phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,6)) blev tilsat til suspensionen. A549-celler blev vist ved hjælp af en Eclipse Ti Nikon mikroskop (Nikon, Japan).

mitokondriemembranen Potential

Den mitokondrielle membranpotentiale (A ^ m) af A549 celler blev målt usimg en fluorescerende, lipofilt, kationisk probe, JC-1 (Beyotime, Kina), i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler udsat for wogonin inkuberet med 1X JC-1-farvning opløsning i 20 minutter ved 37 ° C. De blev derefter skyllet to gange med JC-1-farvning puffer og billeder blev taget med en Eclipse Ti Nikon mikroskop (Nikon, Japan).

Apoptose Assay

Celler blev mærket med FITC-mærket Annexin V og propidiumiodid (PI) ved anvendelse af en Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit (keygen Biotech, Kina), i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt, efter 48 timers eksponering for forskellige koncentrationer af wogonin blev cellerne vasket med koldt PBS og resuspenderet i 1X bindingsbuffer. Alikvoter af 10

5-celler blev blandet med 5 pi Annexin V-FITC og 5 pi PI i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Fluorescens (530 nm) blev påvist ved flowcytometri (FACS Aria, BD Biosciences, USA) inden for 1 time.

Real-time PCR-analyse

Kvantitativ RT-PCR blev foretaget ved anvendelse af en SYBR Green reporter. A549-celler udsat for wogonin blev vasket med PBS og total RNA blev oprenset ved hjælp RNAiso Plus (TAKARA, Japan). Det resulterende RNA blev først revers transkriberet til cDNA under anvendelse af en PrimeScript® RT Master Mix kit (TAKARA, Japan). Genspecifikke primere blev kombineret med SYBR® Premix Ex Taq ™ (TAKARA, Japan) og amplificeret ved anvendelse af et ABI 7500 real-time PCR-maskine (Applied Biosystems, USA). Alle qPCR reaktioner blev udført uafhængigt på fem prøver. Den relative mRNA-ekspression blev beregnet ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode. Primersekvenserne anvendte er anført i tabel 1.

Western blot analyse

Celler vasket med PBS blev lyseret med RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, natriumorthovanadat, natriumfluorid, EDTA og leupeptin, (Beyotime, Kina) suppleret med proteasehæmmer PMSF (Beyotime, Kina). Cytoplasmatiske proteiner blev ekstraheret under anvendelse af en nuklear og cytoplasmatisk protein Extraction kit (keygen Biotech, Kina).

Det opløselige protein blev bestemt med et BCA protein assay kit (Beyotime, Kina). cellelysaterne blev kogt i 5 minutter i påsætningsbuffer og separeret på en SDS- PAGE-gel. Efter elektroforese blev proteinerne overført til en PVDF-membran (Millipore, USA). membranerne blev blokeret med skummetmælk, probet med forskellige primære antistoffer og HRP-konjugerede sekundære antistoffer og visualiseret med forøget kemiluminescens (ECL) detektionsreagenser (Beyotime, Kina).

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev foretaget ved hjælp af SPSS-version 17.0 software. Resultater udtrykkes som middelværdier og standardafvigelser (gennemsnit ± SEM) af mindst tre uafhængige forsøg. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans mellem grupperne. Værdier af P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Wogonin inhiberer Cell Levedygtighed og inducerer Cell Apoptose

Cell levedygtighed blev vurderet ved hjælp af en MTT assay i samarbejde med DAPI farvning. og flowcytometrianalyse efter udsættelse for forskellige koncentrationer af wogonin. MTT-analyse viste, at wogonin inhiberede cellelevedygtighed på en dosis-afhængig og tids-afhængig måde (Fig. 1B). (. Figur 1C). Dette blev bekræftet af resultaterne af flowcytometrisk analyse ved hjælp AnnexinV-PI

(A) Kemisk struktur af wogonin (C

16H

12o

5, MW: 284,27 ). (B) Cellelevedygtighed blev analyseret under anvendelse af MTT-assayet. Celler blev inkuberet med wogonin i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Søjlerne repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 3). (C) Apoptose vurderes af Annexin V /PI-farvning i A549-celler. Celler blev inkuberet med wogonin i koncentrationer på 0, 15, 25, 35 ug /ml, i 24 timer, 48 timer og 72 timer. (D) Kerner farves af DAPI og observeret ved fluorescens mikroskop. Apoptotiske celler er angivet med pile. *

P

0,05 vs kontrolgruppen, **

P

0,01 vs kontrolgruppe

I forhold til kontrolgruppen, satsen for begge. tidligt og sent apoptose steg efter udsættelse for alle koncentrationer af wogonin. Den samlede apoptose oversteg 50% i 35 ug /ml gruppen.

DAPI farvning (fig. 1D) identificerede kondenseres og spaltede kerner i celler udsat for 35 ug /ml wogonin, mens kun klare kerner med lyseblå farvning blev observeret i kontrolgruppen.

Som vist i fig. 2A, blev Wogonin forbundet med en dosisafhængig formindskelse i mitokondrier potentiale (ATm), som resulterede i nedsat rød fluorescens (JC-1-polymer) og øget af grøn fluorescens (JC-1 monomer). Dette kan have været forbundet med nedregulering af Mcl-1, da der ikke var nogen indlysende fald i Bcl-2-niveauer. Wogonin forfremmet også frigivelse af AIF og cytochrom C i cytoplasmaet giver yderligere bevis skader på mitokondrierne (Fig. 2C). Nedregulering af XIAP, survivin, og spaltede fragmenter fra PARP indikeret, at processen af ​​apoptose fortsatte efter mitokondrier beskadigelse (fig. 2B).

(A) Analyse af den mitokondrielle membranpotentiale (A ^ m) under anvendelse af JC -1 farvning efter udsættelse for wogonin i 48 timer. En fluorescensmikroskop blev anvendt til at visualisere resultaterne. Mitokondrie depolarisering blev indikeret ved en stigning i grøn fluorescens og et fald i rød fluorescens intensitet. (B) Protein niveauer af Bcl-2, Mcl-1, XIAP, survivin og PARP analyseret ved western blot. (C) Cytoplasmatiske proteiner blev ekstraheret i Western blot-analyse af frigivet cytochrom C og AIF. I disse forsøg blev cellerne eksponeret for wogonin 0, 15, 25, 35 ug /ml i 48 timer. *

P

0,05 vs kontrolgruppen, **

P

. 0,01 vs kontrolgruppen

Wogonin nedregulerer HDAC1 og HDAC2 på begge mRNA og proteinniveauer

Protein niveauer af HDAC1 og HDAC2 blev nedreguleret i en dosisafhængig måde efter udsættelse for forskellige koncentrationer af wogonin i 48 timer (fig. 3B). Dette resultat er i overensstemmelse med nedreguleringen af ​​mRNA detekteret ved qPCR viser, at HDAC1 blev reduceret med 0,69 gange og HDAC2 af 0,73-fold, (usikkerheder relateret til fold-ændringer var 2) (. Figur 3A). Disse ændringer kan resultere i en proportional stigning i histonacetylering og fremme ekspressionen af ​​tumor undertrykkende proteiner.

(A) Relative mRNA-niveauer af HDAC1 og HDAC2 blev påvist ved hjælp af real-time PCR med GAPDH som en intern kontrol. Resultater udtrykkes som middelværdien ± SEM for fem uafhængige forsøg.

#

P

0,01 vs kontrolgruppen. (B) Protein niveauer af HDAC1 og HDAC2 analyseret ved western blot. I disse forsøg blev cellerne eksponeret for wogonin 0, 15, 25 og 35 ug /ml i 48 timer. *

P

0,05 vs kontrolgruppen, **

P

. 0,01 vs kontrolgruppen

Wogonin nedregulerer c-myc og Skp2 på protein niveau, og Øger mRNA niveau af c-myc

Både c-myc og Skp2 blev nedreguleret på proteinniveauet efter udsættelse for wogonin (0, 15, 25, 35 pg /ml) i 48 H, (fig. 4B). Som vist i fig. 4A, mRNA niveauet af Skp2 faldt 0,81 gange, mens mRNA niveau af c-myc steget ca. 1,6-fold (usikkerhed vedrørende folde-ændringer både 2). Disse resultater viser, at en proteasomalaktivitet nedbrydningsvej kan være involveret i reguleringen af ​​c-myc og Skp2. Men som wogonin resulterede i nedsat proteinekspression i Skp2, yderligere eksperimenter fokuseret på proteasomet anerkendelse subunit, Fbw7α, som er rettet mod c-myc.

(A) Relative mRNA-niveauer af c-myc og Skp2 blev påvist under anvendelse real-time PCR med GAPDH som en intern kontrol. Resultater udtrykkes som middelværdien ± SEM for fem uafhængige forsøg.

#

P

0,01 vs kontrolgruppen. (B) Protein niveauer af c-myc og Skp2 analyseret ved western blot. I disse forsøg blev cellerne eksponeret for wogonin 0, 15, 25 og 35 ug /ml i 48 timer. *

P

0,05 vs kontrolgruppen, **

P

. 0,01 vs kontrolgruppen

Wogonin Nedsat Fbw7α og GSK3p, og Øget Thr58- myc på proteinniveauet

Protein niveauer af Fbw7α faldt efter udsættelse for wogonin, (fig. 5B), men der var ingen tilsvarende fald i mRNA-ekspression (fig. 5A). Thr58 phosphorylering af c-Myc forøget (fig. 5B). Thr58 phosphorylering af c-Myc er en nødvendig komponent af dets nedbrydning og er medieret af GSK3p. Imidlertid GSK3p ekspression faldt både mRNA (0,78 gange ved 35 ug /ml) (fig. 5A) og proteinniveau (fig. 5B). Disse resultater antyder, at phosphorylering af c-Myc ved Thr58 kan forekomme uafhængigt af GSK3p. Men det kræver yderligere undersøgelse,.

(A) Relative mRNA-niveauer af Fbw7α og GSK3p blev påvist ved hjælp af real-time PCR med GAPDH som en intern kontrol. Resultater udtrykkes som middelværdien ± SEM for fem uafhængige forsøg.

#

P

0,01 vs kontrolgruppen. (B) Protein niveauer af Fbw7α, Thr58-Myc og GSK3p analyseret ved western blot. (C) Protein niveauer af c-Myc analyseret ved western blot. I disse forsøg blev 1 uM MG132 tilsat inkuberet med eller uden 25 ug /mL wogonin i 48 timer. *

P

0,05 vs kontrolgruppen, **

P

. 0,01 vs kontrolgruppen

Eksperimenter blev udført med proteasominhibitoren MG132 til yderligere forstå proteasomalaktivitet nedbrydningsvej involveret i reguleringen af ​​c-myc. Resultaterne i fig. 5C viser, at MG132 ikke var i stand til at vende c-myc nedbrydning fremkaldt af 25 ug /ml wogonin. Der er derfor behov for yderligere forskning for at definere den præcise sti involveret i c-myc nedbrydning.

Diskussion

Wogonin er et naturligt forekommende monoflavonoid udvundet fra

Scutellaria baicalensis

radix [28] . Det er blevet rapporteret at have antineoplastisk aktivitet i forskellige typer af cancer ved induktion af apoptose og celledifferentiering [30] – [37], og at blive reguleret af forskellige gener og proteiner [38] – [41]. Det er kendt, at c-Myc /Skp2 /Fbw7α og HDAC1 /HDAC2 veje, er associeret med tumorudvikling. Her undersøger vi deres rolle i de anticancer effekter af wogonin i NSCLC A549 celler.

Vi først evalueret anti-levedygtighed og apoptotiske virkninger af wogonin hjælp MTT og Annexin V-PI dobbelt farvning analyser. Vores resultater indikerede, at wogonin forårsagede dosisafhængig og tidsafhængige hæmning af cellelevedygtighed (IC

50 35 ug /ml ved 48 timer). Den tidlige stigning i apoptose som reaktion på wogonin forekom parallelt, med Annexin V-positive celler efterhånden Annexin-V negativ.

På IC50 (35 ug /ml) celler viste

bevis for markant apoptose, i overensstemmelse med de nukleare ændringer morfologi ses med DAPI-farvning.

ekspressionen af ​​apoptose relaterede proteiner, såsom Bcl-2, Mcl-1, PARP, XIAP, Survivin, cytochrom c og AIF blev evalueret til yderligere at identificere de apoptotiske virkninger af wogonin på proteinniveauet. Resultaterne indikerer, at wogonin er i stand til at påvirke mitochondriemembran stabilitet og mindske mitokondrier membran potentiale (^ m). Dette fremgik af JC-1 farvning, nedsat MCL-1-ekspression og frigivelse af cytochrom C og AIF i cytoplasmaet. Kløvet PARP og faldt XIAP og survivin udtryk kan også have bidraget til udviklingen af ​​apoptose.

HDAC1 og HDAC2 er klasse I HDAC der deacetylate histon og ikke-histon proteiner [5]. De undertrykker genekspression, og ændre tumorspecifikke proteiner involveret i progression [4]. Vores resultater viser, at mRNA og protein niveauer af HDAC1 og HDAC2 var begge faldt i nærvær af wogonin, hvilket indikerer, at acetyleret histon-protein kan fremme ekspression af tumor suppressive proteiner og derved inhibere tumorudvikling.

En indbyrdes forhold eksisterer mellem c-myc og Skp2 således at c-myc fremmer Skp2 udtryk, og Skp2 mål c-myc for ubiquitin-afhængige nedbrydning [11], [12], [24], [25]. I vores eksperimenter, wogonin nedreguleret c-Myc og Skp2 på proteinniveauet, men mRNA-ekspression af c-Myc steg 1,6 gange. Disse resultater antyder, at den proteasomalaktivitet nedbrydningsvej kan være relateret til tilbageførsel af c-Myc. Men da Skp2 udtryk faldt, vi fokuserede vores yderligere eksperimenter på Fbw7α, anden proteasom anerkendelse subunit, der er målrettet c-myc.

Thr58 phosphorylering af c-myc er nødvendig for Fbw7α medieret c-myc nedbrydning [24]. Som Thr58 er phophorylated af GSK3p, vi evaluerede ekspressionsniveauer for Fbw7α, Thr58 c-myc og GSK3p. I disse forsøg faldt Fbw7α ekspression på proteinniveauet men ikke på mRNA-niveauet. Thr58 phosphorylering af c-Myc steg i nogen grad og GSK3p ekspression på både mRNA og proteinniveauet faldt. Disse resultater fremhæve manglende overensstemmelse mellem Fbw7α mRNA og protein niveauer, faldt udtryk for GSK3p, og den øgede phosphorylering af c-myc på Thr58.

En tidligere undersøgelse viste, at phosphorylering af Thr58 i A549 celler opstod uafhængigt af GSK3p [42]. Men GSK3p er den eneste kendte kinase, som phosphorylerer c-Myc ved Thr58. I vores undersøgelser af proteasominhibitoren MG132 var ude af stand til at forhindre nedbrydningen af ​​c-myc tyder på, at faldet Fbw7α og Skp2 kan være involveret i denne proces. Men den nøjagtige mekanisme involveret kræver yderligere forskning.

Tilsammen vores resultater tyder på, at evnen hos wogonin at påvirke forskellige biokemiske veje kan forklare dets aktivitet mod en række forskellige cancere. Vores data kan også delvist forklare, hvorfor nogle gen mangelfulde celler (fx dem med Fbw7α mangel) er resistente over for wogonin.