PLoS ONE: DUSP1 er en roman Mål for Forbedring kræft i bugspytkirtlen Cell Følsomhed til Gemcitabine

Abstrakt

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er en dødelig kræft med en dårlig prognose, der er kendetegnet ved overdreven mitogen-aktivering og mærket kemoresistens til et bredt spektrum af kemoterapeutiske lægemidler. Dual specificitet proteinphosphatase 1 (DUSP1) er en vigtig negativ regulator af mitogenaktiveret proteinkinaser (MAPK’er). Alligevel er DUSP1 overudtrykt i bugspytkirtelkræftceller (PCC’er) i PDAC hvor det paradoksalt nok forbedrer kolonidannelse i blød agar og fremmer

in vivo

tumorigenicitet. Det er imidlertid ikke, om DUSP1 overekspression bidrager til PDAC kemoresistens. Brug af BxPC3 og COLO-357 humane PCC’er viser vi, at gemcitabin aktiverer c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK p38), centrale kinaser i to store stress-aktiverede signaleringsveje. Gemcitabin-induceret JNK og p38 MAPK-aktivering medierer forøget apoptose, men også transkriptionelt opregulerer DUSP1, som det fremgår af forøgede DUSP1 mRNA-niveauer og RNA-polymerase II læsning ved DUSP1 gen krop. Omvendt shRNA-medieret inhibering af DUSP1 forbedrer JNK- og p38 MAPK-aktivering og gemcitabin kemosensitivitet. Brug af doxycyclin-inducerbar knockdown af DUSP1 i etablerede ortotopisk pankreatiske tumorer, fandt vi, at kombinere gemcitabin med DUSP1 inhibering forbedrer dyrs overlevelse, dæmper angiogenese, og forbedrer apoptotisk celledød, sammenlignet med gemcitabin alene. Taget sammen antyder disse resultater, at gemcitabin-medieret opregulering af DUSP1 bidrager til en negativ feedback loop, der dæmper dens gunstige virkninger på stress veje og apoptose, øge muligheden at målrette DUSP1 i PDAC kan have den fordel at forøge gemcitabin kemosensitivitet mens undertrykke angiogenese.

Henvisning: Liu F, Gore AJ, Wilson JL, Korc M (2014) DUSP1 er en ny Mål for Forbedring kræft i bugspytkirtlen Cell Følsomhed til Gemcitabin. PLoS ONE 9 (1): e84982. doi: 10,1371 /journal.pone.0084982

Redaktør: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, USA

Modtaget: 23. oktober 2013; Accepteret: November 27, 2013; Udgivet: 7 Jan 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute (NCI) tilskud CA-R37-075059 til MK, tildelt af National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Murray Korc er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, med en årlig dødelighed på næsten 38.000, en median overlevelse på 6-7 måneder og en fem-års overlevelse på 6% [1]. Mens resektion forlænger overlevelsen og tilbyder en potentiel kur, 80-85% af PDAC er inoperabel på tidspunktet for diagnose på grund af tilstedeværelsen af ​​fjerne metastaser, peritoneal seeding eller invasion i tilstødende vitale strukturer [2]. Det kemoterapeutiske middel gemcitabin (2 ‘, 2’-difluordeoxycytidin, dFdC) har været standarden for pleje af patienter med lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom [3]. For nylig, Food and Drug Administration godkendt kombinationen af ​​gemcitabin og nab-paclitaxel, baseret på den konstatering, at denne kombination forbedret samlet overlevelse til 8,5 måneder versus 6,7 måneder med gemcitabin alene [4]. Det er almindeligt accepteret, at en forbedring modtagelighed over for gemcitabin i PDAC ville føre til en yderligere stigning i patient overlevelse.

modstand PDAC at gemcitabine og mange andre kemoterapeutiske stoffer skyldes til dels til en bred vifte af genetiske og epigenetiske ændringer, der fører til unormal aktivering af celleoverlevelse og anti-apoptotiske veje [5], en intens desmoplasia som forstyrrer drug delivery til tumormassen [6], [7], og ændringer i ekspression af nøglemolekyler involveret i gemcitabin optagelse, intracellulær aktivering og efflux [8]. Der er et presserende behov, derfor, at fremme vores forståelse af de mekanismer, der ligger til grund kemoresistens i PDAC, med henblik på at udtænke nye og mere effektive kemoterapeutiske strategier.

Unormal aktivering af mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK’er) spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​cellernes overlevelse og apoptose [9], [10]. MAPK’er kan inddeles i tre familier: ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK), c-Jun-NH2 kinase (JNK), og p38 MAPK [9], [10]. Ved stimulering af mitogen eller miljømæssig stress, er MAPK’er aktiveres via phosphorylering på deres tyrosin og threoninrester ved opstrøms MAP2K kinaser [9], [10]. Aktiverede MAPK’er phosphorylerer et spektrum af målsubstrater, herunder proteinkinaser og transkriptionsfaktorer, der er involveret i regulering af celleproliferation, differentiering, overlevelse og apoptose [9], [10]. På trods af eksistensen af ​​krydstale veje mellem forskellige MAPK’er, de fleste beviser støtter konceptet, at aktiverede ERK fremmer celleproliferation, overlevelse, og motilitet, mens JNK’erne og p38 MAPK’er negativt regulere cellecyklusprogression og inducere apoptotisk celledød som respons på miljømæssige stress [9] , [10].

Den dobbelte-specificitet phosphatase (DUSP) familie af proteiner består af 25 medlemmer [11]. DUSPs kan dephosphorylere både threonin /serin og tyrosinrester deres substrater og dermed fungere som negative regulatorer af MAPK’er [11]. DUSP1 /MKP-1 er et nukleart MAPK phosphatase, der er en direkte transkriptionel mål for p53, E2F-1, c-Jun og ATF2, og som induceres som reaktion på oxidativ stress, hypoxi og andre belastninger, såsom ernæringsmæssige afsavn og kemoterapeutiske lægemidler [12] – [14]. DUSP1 overudtrykkes i en række epiteliale tumorer, herunder PDAC, ikke-småcellet lungecancer, bryst-, ovarie-, gastrisk, og tidlig-fase prostatacancer [15] – [20], og denne overekspression er korreleret med dårlig patientoverlevelse i ovariecancer [18]. Den forøgede DUSP1 ekspression i brystcancer er omvendt korreleret med JNK aktivitet og markører for apoptose, hvilket tyder på en anti-apoptotisk rolle DUSP1 via sin indsats hen imod JNK [17]. Til støtte for denne konklusion, kræftceller, der overudtrykker DUSP1 er resistente over for kemoterapi og Fas ligand-induceret apoptose, mens reduktion af DUSP1 niveauer ved hjælp af en lille interfererende RNA øger følsomheden over for disse stoffer [21] – [23]. Omvendt i hepatocellulært carcinom (HCC) øgede DUSP1 niveauer korrelerer med bedre prognose [24]. Desuden DUSP1 regulerer negativt ERK-signalering i HCC-celler, og derved hæmmer deres proliferative potentiale, hvilket antyder, at DUSP1 er et tumorsuppressorgen i HCC [24]. Således er de skadelige konsekvenser af DUSP1 overekspression sandsynligvis cancer specifikke.

Vi rapporteret at DUSP1 overudtrykkes i PDAC, og at antisense-medieret suppression af DUSP1 ekspression reducerer tumorudvikling i nøgne mus [15]. Det vides ikke, imidlertid, om DUSP1 kunne være et mål for at forbedre respons på gemcitabin kemoterapi i PDAC. Vi demonstrerer nu, at gemcitabin aktiverer JNK og p38 MAPK, hvilket fører til øget apoptose og DUSP1 transskription. Omvendt shRNA-medieret inhibering af DUSP1 forbedrer gemcitabin-induceret JNK og p38 MAPK-aktivering og sensibiliserer PDAC celler til gemcitabin. Ved hjælp af en doxycyclin-inducerbar strategi til at undertrykke DUSP1 i etablerede ortotopisk pankreatiske tumorer, viser vi, at kombinere gemcitabin med DUSP1 inhibering forlænger overlevelse, dæmper angiogenese, og forbedrer apoptotisk celledød. Således kan DUSP1 være en potentiel terapeutisk mål for forbedring PDAC følsomhed over for gemcitabin.

Resultater

JNK og p38 MAPK signalveje er Aktiveret i Reaktion med gemcitabin-

Virkningerne af gemcitabin på PCC vækst blev vurderet ved anvendelse af MTT-assayet. I alle tre cellelinier, gemcitabin udøvede en dosisafhængig væksthæmmende virkning. AsPC-1 var mest modstandsdygtige over for gemcitabin, med en IC50 på mere end 100 ng /ml, hvorimod BxPC-3 og COLO-357-celler var mere følsomme over for gemcitabin, med IC50-værdier på 10 ng /ml og 5 ng /mL ( fig. 1A).

(A) AsPC-1, BxPC-3, og COLO-357-celler blev inkuberet i 48 timer i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af gemcitabin, og MTT-assays blev udført. Dataene er middel ± SEM af 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01 sammenlignet med kontrol. (B) AsPC-1, BxPC-3 og COLO-357-celler blev inkuberet i de angivne tidsrum med 100 ng /ml, 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin, henholdsvis og analyseret ved immunblotting. (C) BxPC-3-celler blev inkuberet i 48 timer med 10 ng /ml gemcitabin (G), i fravær eller nærvær af 10 uM SB203580 (SB) eller 10 uM SP600125 (SP), og analyseret ved immunblotting.

for at vurdere effekten af ​​gemcitabin på aktiveringen af ​​MAPK’er blev celler inkuberet med gemcitabin ved en koncentration tæt på deres respektive IC50 s. I BxPC-3 og COLO-357, gemcitabin inducerede phosphorylering af p38 MAPK og JNK, centrale kinaser i to store stress-aktiverede signaleringsveje (fig. 1b). Gemcitabin steg også niveauet af phospho-c-Jun i disse celler (fig. 1B). Da phospho-c-Jun er et fælles nedstrømsmål af p38 MAPK og JNK pathways, denne observation bekræftet aktiveringen af ​​p38 MAPK og JNK signalering. Desuden niveauerne af spaltet caspase 3 og spaltes PARP korreleret med p38 MAPK, JNK og c-Jun-aktivering, hvilket antyder at p38 MAPK og JNK pathways medierer apoptotisk celledød som respons på gemcitabin (fig. 1B). Derimod AsPC-1-celler var mere resistente over for gemcitabin, som vist ved fravær af p38 MAPK og JNK-aktivering og de lavere niveauer af spaltet caspase 3 og spaltes PARP, selv ved en koncentration så høj som 100 ng /ml (fig. 1B). For at bestemme om gemcitabin apoptose gennem p38 MAPK og JNK-aktivering, blev BxPC-3-celler inkuberet med gemcitabin i fravær eller nærvær af p38 MAPK (SB203580) eller inhibitorer JNK (SP600125). Niveauerne af spaltet PARP og spaltes caspase 3 blev reduceret med SB203580 og SP600125 ved tilsætning til gemcitabin (fig. 1C). Således i følsomme cellelinjer, gemcitabin aktiverer p38 MAPK og JNK signalering som inducerer apoptotisk celledød, hvorimod gemcitabin-modstand er forbundet med lavere niveauer af apoptose og markant svækket p38 MAPK /JNK aktivering.

Gemcitabin Aktiverer DUSP1 Transskription gennem JNK og p38 MAPK Signaling

i betragtning af at DUSP1 er en vigtig regulator af MAPK aktiviteter [11], vi næste undersøgt ekspressionen af ​​DUSP1 reaktion på gemcitabin og den underliggende mekanisme regulerer sit udtryk. I begge BxPC-3 og COLO-357-celler, blev DUSP1 mRNA og protein niveauer induceret ved 24 timer og 48 timer efter gemcitabin Desuden faldt sammen med aktiveringen af ​​p38 MAPK og JNK (fig. 2A). Derimod blev der ikke observeret nogen signifikante ændringer i DUSP1 niveauer i gemcitabin-resistent ASPC-1 celler, i overensstemmelse med de lave niveauer af apoptose og fraværet af p38 MAPK og JNK aktivering efter behandling (fig. 2A).

(A) AsPC-1, BxPC-3, og COLO-357-celler blev inkuberet i de angivne gange med 100 ng /ml, 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin, henholdsvis og DUSP1 niveauer blev vurderet ved Q- PCR og immunblotting. (B, c) BxPC-3 og COLO-357-celler blev inkuberet i 24 timer med 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin i henholdsvis fravær eller nærvær af 10 mmol /l U0126, 10 pmol /L SP600125, 10 pmol /l SB203580, eller begge SP600125 og SB203580, og Q-PCR (B) og RNA-polymerase II chip efterfulgt af Q-PCR for DUSP1 gen organ (C) blev udført. Alle data er middelværdier ± SEM af 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01, sammenlignet med kontrol

Som reaktion på forskellige stimuli, transkriptionsfaktoren AP-1 (c-Jun, c-Fos, ATF2), som er den største nedstrømsmål af p38 MAPK og JNK signalering, har vist sig at associere med DUSP1 promotoren og regulere transkription [14], [25]. For at bestemme om p38 MAPK og JNK signalering mediere induktion af DUSP1 ekspression ved gemcitabin blev BxPC-3 og COLO-357-celler behandlet med gemcitabin i fravær eller nærvær af SB203580, SP600125 eller deres kombination. SB203580 og SP600125 faldt induktion af DUSP1 mRNA-niveauer ved gemcitabin, mens deres kombination fuldstændigt blokeret denne induktion. Derimod ERK hæmning med U0126 undladt at ændre gemcitabin-medieret induktion af DUSP1, støtter den konklusion, at p38 MAPK og JNK stedet ERK signalering mægle DUSP1 induktion ved gemcitabin (Fig. 2B).

Stigningen i DUSP1 mRNA-niveauer kan skyldes forøget transskriptionel aktivitet eller posttranskriptionel mRNA-stabilitet. Derfor chromatin immunoprecipitation mod RNA-polymerase II, som er det vigtigste element i transkriptionsmaskineriet, blev næste udført, efterfulgt af Q-PCR for at kvantificere mængden af ​​RNA-polymerase II bundet til genet krop region DUSP1. Dette assay giver mulighed for direkte måling af den aktive forlængelsestrin og afspejler den transkriptionelle aktivitet af DUSP1 genet. Inkubering BxPC-3 og COLO-357 celler med gemcitabin i 24 timer øgede mængden af ​​RNA-polymerase II loading på gen- krop region DUSP1 med 6 gange og 12 gange (fig. 2C), hvilket tyder på transkriptionel aktivering af DUSP1 af gemcitabin . SB203580 og SP600125, men ikke U0126, inhiberede gemcitabin-inducerede stigning i mængden af ​​RNA-polymerase II forbundet med DUSP1 genet legeme (fig. 2C). Tilsammen indikerer disse resultater, at p38 MAPK og JNK signalering medierer DUSP1 transkriptionel aktivering med gemcitabin.

Afbrydelse af DUSP1 Negativ feedback Loop Forbedrer kemosensitivitet til gemcitabin og cisplatin

For at undersøge effekten af ​​lyddæmpende DUSP1 på MAPK aktiviteter og gemcitabin kemosensitivitet, AsPC-1, BxPC-3 og COLO-357-celler blev stabilt transduceret med lentivirus udtrykker shRNA mod DUSP1 eller ikke-targeting scramble kontrol og derefter inkuberet med forskellige gemcitabins koncentrationer. I alle tre cellelinier, DUSP1 knockdown anvendelse af to shRNAs øgede vækstinhiberende virkninger af gemcitabin. Således silencing DUSP1 flyttet IC50-værdierne for gemcitabin i AsPC-1, BxPC-3 og COLO-357 celler fra 500 til 10 ng /ml, fra 10 til 5 ng /ml, og fra 5 til 2,5 ng /ml, henholdsvis (fig. 3A). Disse resultater antyder, at DUSP1 knockdown forbedret gemcitabin kemosensitivitet, og at sensibiliserende virkning var mere markant i celler med høj kemoresistens.

AsPC-1, BxPC-3, og COLO-357-celler blev stabilt transduceret med lentivirus udtrykker shRNA mod scramble kontrol eller DUSP1. (A) Celler blev inkuberet i 48 timer i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af gemcitabin, og MTT-assays blev udført. Dataene er middel ± SEM af 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01 sammenlignet med kontrol. (B) AsPC-1, BxPC-3, og COLO-357-celler blev inkuberet i de angivne gange med 100 ng /ml, 10 ng /ml og 5 ng /ml gemcitabin henholdsvis og analyseret ved immunblotting.

anti-DUSP1 antistof rutinemæssigt afsløret 2 nært migrerer bånd på western blots (Fig. 2-3). Imidlertid DUSP1 knockdown med to meget specifikke shRNAs målretning DUSP1 specifikt tavshed ekspression af det nederste bånd (fig. 3B), hvilket indikerer, at det øvre bånd var ikke-specifik. DUSP1 knockdown med de samme stærkt specifikke shRNAs også potenseret gemcitabin-induceret apoptose, som det fremgår af forøgede niveauer af spaltet PARP og spaltes caspase 3 (fig. 3B). Højere niveauer af gemcitabin-induceret phospho-p38 MAPK og phospho-JNK blev også bemærket i DUSP1 knockdown celler sammenlignet med scramble kontrol, hvilket antyder, at silencing DUSP1 de-undertrykt p38 MAPK og JNK signalering, hvilket fører til forøget apoptotisk celledød som respons på gemcitabin (fig. 3B).

i betragtning af at gemcitabin kan anvendes sammen med cisplatin eller 5-fluoruracil til behandling lokalt fremskreden eller metastatisk PDAC [26], [27], vi næste søgt at fastslå, om målretning DUSP1 ville have lignende sensibiliserende virkninger på andre kemoterapeutiske stoffer udover gemcitabin. Til dette formål blev BxPC-3 og COLO-357-celler der stabilt udtrykker shRNA mod DUSP1 eller scramble kontrol behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin. I begge BxPC-3 og COLO-357-celler, DUSP1 knockdown faldt af IC50 fra 2 til 0,5 ug /ml, og også potenseret cisplatin-induceret apoptotisk celledød, som det fremgår af forøgede niveauer af spaltet PARP og spaltes caspase 3 (fig. 4A, 4B). Højere niveauer af cisplatin-induceret phospho-p38 MAPK og phospho-JNK blev også bemærket i celler med DUSP1 knockdown (Fig. 4B), og lignende resultater blev opnået med ASPC-1 celler (data ikke vist). Taget sammen tyder disse resultater på, at afbryde den negative feedback på p38 MAPK og JNK signalering ved at undertrykke DUSP1 kunne øge apoptose og forbedre kemosensitivitet af pancreascancer til flere kemoterapeutiske midler.

BxPC-3 og COLO-357-celler stabilt transduceret med lentivirus udtrykker shRNA mod scramble bekæmpelse eller DUSP1. (A) Celler blev inkuberet i 48 timer i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af gemcitabin, og MTT-assays blev udført. Dataene er middel ± SEM af 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01 sammenlignet med kontrol. (B) BxPC-3 og COLO-357 celler blev inkuberet med 2 ug /ml cisplatin for de angivne tider, og immunoblotting blev gennemført.

Knockdown af DUSP4, anden Nuclear DUSP, undlader at Øge kemosensitivitet

Dernæst har forsøgt at bestemme, hvorvidt øget kemosensitivitet er unik for DUSP1 dæmpning eller et fælles træk ved målretning mod DUSP familiemedlemmer. Derfor valgte vi at knockdown DUSP4 /MKP-2, på grund af sin lighed med DUSP1 med hensyn til subcellulær lokalisering og substratpræference [11]. AspC-1 og BxPC-3-celler blev stabilt transduceret med lentivirus kodning shRNA mod DUSP4 eller ikke-targeting scramble kontrol. Vellykket silencing af DUSP4 blev bekræftet med immunoblotting (fig. 5B). Imidlertid DUSP4 knockdown undladt at påvirke MAPK aktivering eller responset på gemcitabin i enten cellelinie (fig. 5A, 5B). Således DUSP1 er et potentielt terapeutisk mål for potensering stress-aktiverede MAPK’er signalering og forbedre gemcitabin kemosensitivitet, hvilket ikke nødvendigvis et fællestræk ved de alle DUSP familiemedlemmer.

aspC-1 og BxPC-3-celler blev stabilt transducerede med lentivirus udtrykker shRNA mod scramble kontrol eller MKP2. (A) Celler blev inkuberet i 48 timer i fravær eller nærvær af forskellige koncentrationer af gemcitabin, og MTT-assays blev udført. (B) AsPC-1 og BxPC-3-celler blev inkuberet i de angivne tider med 100 ng /ml og 10 ng /ml gemcitabin, henholdsvis og immunoblotting blev udført. Dataene er midlet ± SEM af 3 eksperimenter.

Gemcitabin og DUSP1 Knockdown Kombiner at forlænge overlevelsen, Dæmp tumorangiogenese og spredning, og Øge Apoptose

Vi næste forsøgt at vurdere effekten inhibere DUSP1 på gemcitabin kemosensitivitet i en ortotopisk musemodel. For at undersøge det terapeutiske potentiale målrette DUSP1 i fuldt etablerede pancreas tumorer, vi stabilt transduceres COLO-357 humane bugspytkirtelkræftceller med lentivirus udtrykker doxycyclin-inducerbare shRNA mod DUSP1 eller en ikke-targeting scramble kontrol, før injektion af celler i bugspytkirtlen af ​​immundefekte mus i en TET-OFF tilstand. To uger senere, celler, der udtrykker doxycyclin-inducerbar shRNA mod DUSP1 eller scramble kontrol dannede tumorer af tilsvarende størrelse, som let kunne palperes. Alle musene blev afbildet på dag 15 post-kirurgi, under anvendelse af en høj opløsning ultralyd, og tumorvolumener blev beregnet på grundlag af erhvervede 3-D billeder, der bekræfter, at begge grupper dannet tumorer i tilsvarende volumen (fig. 6). Begyndende på dag 18 efter kirurgi, blev doxycyclin kontinuerligt administreret i drikkevandet, og mus blev randomiseret i 2 grupper til at modtage vehikel eller gemcitabin (50 mg /kg, intraperitoneal injektion, to gange ugentligt). Gemcitabin alene eller DUSP1 silencing alene undladt at forlænge dyr overlevelse (fig. 7A). sammenligning af shRNA-scramble /gemcitabin gruppen og shRNA-DUSP1 /gemcitabin-gruppen viste imidlertid, at DUSP1 knockdown genereret en betydelig overlevelse fordel i tilstedeværelse af gemcitabin (p = 0,037) (fig. 7A). Stigningen i overlevelse var endnu større, når man sammenligner shRNA-DUSP1 /gemcitabin gruppe med shRNA-scramble /køretøj (p = 0,009), hvilket antyder, at DUSP1 lyddæmpning forbedret gemcitabin følsomhed

in vivo

(fig. 7A ).

COLO-357-celler blev stabilt transduceret med lentivirus udtrykker Tet-inducerbar kontrol shRNA (shScramble) eller DUSP1-targeting shRNA (shDUSP1). Celler blev injiceret i pancreas af immunsvækkede mus, og 15 dage senere blev tumorer afbildet under anvendelse af et Vevo2100 høj opløsning ultralyd. (A-B) Repræsentative høj opløsning ultralydsbilleder (A) og kvantificering af tumorvolumener hjælp af 3D abdominale scanninger (b) viser, at forud for Dox eller gemcitabin behandlinger, shScramble og shDUSP1 tumorer (T, angivet med pile) var ens i størrelse . Data i (B) er de midler ± SEM.

immundefekte mus, der bærer ortotopisk tumorer afledt af COLO-357 celler, som stabilt udtrykker doxycyclin-inducerbare shRNA mod scramble kontrol eller DUSP1 fik doxycyclin i drikkevandet og behandlet med vehikelkontrol (saltvand) eller gemcitabin (50 mg /kg, ip, to gange ugentligt). (A) Kaplan-Meier overlevelse. * P 0,05 sammenlignet med scramble behandlet med gemcitabin;

## p 0,01 sammenlignet med scramble behandlet med saltvand. (B) Q-PCR måling af DUSP1 mRNA-niveauer. (C) TUNEL-farvning og immunhistokemisk analyse af CD34, Ki67, og spaltes caspase 3. Scale, 20 pm. (D) Kvantificering. Dataene er middel ± SEM af 3 eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01, sammenlignet med scramble behandlet med saltvand

Efter aftale med

in vitro

fund, gemcitabin behandling steget DUSP1 mRNA niveauer i shRNA-kapløbet tumorer. De fleste af de shRNA-DUSP1 tumorer havde relativt lave niveauer af DUSP1, mens en tumor udviste høje DUSP1 niveauer, muligvis på grund af kortere doxycyclin eksponering eller kontaminering med tilstødende ikke-tumorvæv ved høst prøven. Disse resultater antyder, at doxycyclin held induceret shRNA ekspression. Men på grund af høj variation blandt hver mus, forskellen i DUSP1 niveauer blandt forskellige grupper var ikke statistisk signifikant (fig. 7B).

For at vurdere virkningerne af DUSP1 lyddæmpning og gemcitabin behandling på tumor angiogenese, spredning, og apoptose, blev tumorvæv næste analyseret ved immunhistokemisk farvning for CD34 (angiogenese) og Ki67 (proliferation), samt ved terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) og spaltes caspase 3 immunreaktivitet, som begge er markører for apoptose. Gemcitabin lidt svækket CD34 og Ki67 signaler, mens DUSP1 knockdown havde en markant hæmmende effekt på CD34-farvning og en mere moderat, men stærkt signifikant inhibitorisk virkning på Ki67-farvning (fig. 7C, 7D). DUSP1 silencing også ført til øget kløvet caspase 3 immunoreaktivitet og TUNEL signaler sammenlignet med scramble kontrol tumorer, hvilket indikerer, at der var en stigning i apoptotisk celledød efter DUSP1 knockdown. Stigningen i caspase 3 spaltning og DNA-fragmentering var endnu større, når man kombinerer DUSP1 silencing med gemcitabin (fig. 7C, 7D). Således målretning DUSP1

in vivo

ført til undertrykt angiogenese og cancercelleproliferation, og øget gemcitabin-induceret apoptose.

Diskussion

JNK1, -2, og -3 er kodet af

MAPK8

,

MAPK9

MAPK10

henholdsvis og alternativ splejsning giver anledning til mindst ti isoformer [9]. Derimod p38 MAPK-α, -β, -γ og -δ er kodet af

MAPK14

,

MAPK11

,

MAPK12

, og

MAPK13

henholdsvis og der er to alternativt splejsede isoformer af

MAPK14

[9]. Globalt, JNK og p38 MAPK stress aktiverede veje inducere apoptose i nogle tilfælde, men der kan forbedre overlevelse i andre, afhængigt af celletype-specifikke forskelle, intensiteten og varigheden af ​​signalering, og tilstedeværelsen eller fraværet af krydstale med andre signalveje [9].

i den aktuelle undersøgelse vi konstateret, at gemcitabin aktiveret JNK og p38 MAPK, og derved inducere apoptose i PCC’er. Mens rollen af ​​specifikke isoformer ikke blev evalueret, gemcitabin-aktiveret JNK og p38 MAPK signalering inducerede også DUSP1 transkription, hvilket fremgår af forøgede DUSP1 mRNA-niveauer og forøget RNA-polymerase II belastning ved DUSP1 gen krop. Desuden shRNA-medieret inhibering af DUSP1 forbedret gemcitabin-induceret JNK og p38 MAPK-aktivering og sensibiliserede PDAC celler til gemcitabin og cisplatin, hvilket fører til nedsat celleproliferation og øget PARP og caspase 3 spaltning. Disse resultater indikerer, at gemcitabin-medieret aktivering af JNK- og p38 MAPK fører til opregulering af DUSP1, hvilket igen bidrager til en negativ feedback loop der dæmper JNK og p38 MAPK aktiviteter og derved interfererer med de gavnlige virkninger af gemcitabin om stress veje og apoptose (fig. 8). Disse observationer hæve den mulighed, at DUSP1 kan være en potentiel terapeutisk mål til forøgelse PDAC overfølsomhed over for flere kemoterapeutiske midler. Desuden DUSP1 målrette fører til øgede niveauer af p-ERK1 og p-ERK2 [15], og ERK aktivering i bugspytkirtelkræftceller øger gemcitabin kemoresistens [28]. Således, gemcitabin-inducerede stigninger i JNK og p38 MAPK aktiviteter er afgørende for dets pro-apoptotiske aktioner.

Gemcitabin aktiverer JNK og p38 MAPK (p38) signalering, der medierer apoptotisk celledød. Aktiveret JNK- og p38 MAPK derefter opregulere DUSP1 transkription, hvilket negativt modulerer JNK- og p38 MAPK signaleringsaktivitet og svække gemcitabin-induceret celledød. Hæmme DUSP1 i kombination med gemcitabin behandling forbedrer kemosensitivitet af bugspytkirtelkræftceller markant.

nedregulering af DUSP1 undertrykker udtryk for angiogene faktorer, såsom SH2D2A og VEGF-C i ikke-småcellet lungecancer ( NSCLC) celler og funktionelle assays har bekræftet rolle DUSP1 at fremme tumor angiogenese [29]. Desuden i humane NSCLC prøver, DUSP1 co-lokaliserer med CD31-positive vaskulære strukturer, og en tæt sammenhæng mellem øget VEGF-C og DUSP1 udtryk er blevet påvist [29]. Disse resultater understøtter det koncept, at DUSP1 kan spille en vigtig rolle i tumorangiogenese. Selvom PDAC er kendetegnet ved markant desmoplasia og hypoperfusion, udviser også en høj tilbøjelighed til at metastasere via hæmatogene eller lymfatiske ruter, selv når den primære tumor er lille [30]. Desuden PDAC udviser foci af mikro-angiogenese og overudtrykke flere pro-angiogene faktorer og øget angiogenese, høje serum VEGF-A-niveauer og forøget VEGFR-2-ekspression er blevet korreleret med en dårligere prognose i PDAC patienter [30]. Tilsammen udgør disse rapporter understreger den potentielle betydning af afvigende angiogenese i PDAC og implicere DUSP1 for at bidrage til denne proces.

Brug doxycyclin-inducerbare knockdown af DUSP1 i etablerede ortotopisk pancreas tumorer, i nærværende undersøgelse, vi fastslået, at kombinere gemcitabin med DUSP1 hæmning langvarig dyr overlevelse og forbedret apoptotisk celledød, sammenlignet med gemcitabin alene. Desuden DUSP1 knockdown markant svækket PCC proliferation og tumorangiogenese. Vores anvendelse af immun deficiente mus til hinder for en vurdering af konsekvensen af ​​DUSP1 inhibering på immunsystemet eller på makrofag antal og aktivering i pancreas tumormasse. Eftersom DUSP1 er kendt for at modulere makrofag spredning og aktivering [31], studier med syngene eller gensplejsede musemodeller af PDAC vil være forpligtet til at tage dette aspekt af DUSP1 funktion i PDAC.

De mekanismer, der fører til øget DUSP1 ekspression i PDAC er ikke kendt. Det er blevet påvist, kan imidlertid hypoksi opregulere DUSP1 transkription [14], og PDAC er en yderst desmoplastiske tumor med en markant hypoksisk mikromiljø [5] – [7]. Endvidere i nærvær af oxidativt stress, E2F1 inducerer DUSP1 ekspression [13], og E2F1 opreguleres i PDAC som følge af RB dysfunktion og overdreven PI3K-aktivering [32], [33]. Sammen med de foreliggende resultater, disse observationer antyder, at PDAC kan være “primet” at udvise forøget aktivering DUSP1 som reaktion på gemcitabin, og foreslår, at målretning DUSP1 i PDAC kunne øge de gavnlige virkninger af gemcitabin ved at fremme apoptose og undertrykke bugspytkirtelkræft celleproliferation og tumor angiogenese

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Indiana University (Permit nummer: 10108).. Alle dyreforsøg beskrevet blev udført i overensstemmelse med accepterede standarder for human Dyrepleje og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cell Culture

ASPC-1 og BxPC-3 humane bugspytkirtelkræftceller var opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). COLO-357 celler en gave fra Dr. R. Metzger ved Duke University, og blev oprindeligt placeret i kultur ved Morgan,

et al

., [34] fra en patient med metastatisk PDAC. De er blevet anvendt i vid udstrækning [15], [35], [36] og blev bekræftet ved kromosomal analyse. AsPC-1 og BxPC-3-celler blev dyrket i RPMI 1640, og COLO-357 celler blev dyrket i DMEM. Medmindre andet er angivet, blev medier suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin (komplet medium).

3- (4,5-dimethylthiazol-2 yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay

MTT assay blev udført som beskrevet [35].

immunblotting

Immunoblotting blev udført som beskrevet tidligere [ ,,,0],35] under anvendelse af antistoffer mod følgende antigener: PARP, caspase-3, kløvet caspase-3 (Asp175), phospho-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, phospho-JNK (G9), og phospho-c-Jun ( Ser63) fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA; DUSP1 (C-19), MKP2 (S-18), JNK (FL) og ERK2 (C-14), fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.