PLoS ONE: Berberin Forhindrer Invasion og metastase af tyk- og endetarmskræft Cells via COX-2 /PGE2 Mediated JAK2 /STAT3 Signaling Pathway

Abstrakt

Berberin, udvundet fra kinesisk urtemedicin Coptis chinensis, har vist sig at have anti -tumor aktiviteter. Men de underliggende mekanismer er ikke blevet fuldt belyst. Vores nuværende undersøgelse viste, at Berberin inhiberede

in vitro

in vivo

vækst, migration /invasion af CRC-celler via dæmpning ekspressionsniveauerne af COX-2 /PGE

2, følgende ved at reducere phosphorylering af JAK2 og STAT3, samt MMP-2 /-9 ekspression. Vi yderligere præciseret, at en forøgelse af COX-2 /PGE

2 udtryk opveje den undertrykkende aktivitet af Berberin på JAK2 /STAT3 signalering, og en JAK2 inhibitor AZD1480 blokeret effekten af ​​COX-2 /PGE

2 på MMP- 2 /-9 ekspression. Sammenfattende Berberin hæmmede CRC invasion og metastase via nedregulering af COX-2 /PGE

2 JAK2 /STAT3 signalvejen

Henvisning:. Liu X, Ji Q, Ye N, Sui H, Zhou L, Zhu H, et al. (2015) Berberin Forhindrer Invasion og metastase af tyk- og endetarmskræft Cells via COX-2 /PGE

2 Mediated JAK2 /STAT3 signalvejen. PLoS ONE 10 (5): e0123478. doi: 10,1371 /journal.pone.0123478

Academic Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN

Modtaget: December 10, 2014 Accepteret: 18 februar 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81303103, 81473478, 81303102), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (13ZR1461000, 14140901402) og Program for Shanghai Municipal Education Kommissionen (13CG47, 13YZ045). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige menneskelige maligniteter, ranking den tredje for kræfttilfælde i verden [1]. På nuværende tidspunkt, kirurgi er den øverste valg til behandling af CRC, men den post-kirurgiske tumormetastaser fortsat høj, et resultat af invasion og migration af CRC celler til tumor omkringliggende væv og distale organer [2-3]. Derfor, for at blokere CRC celle fra metastase er en afgørende strategi til cancerterapi.

Berberin, et alkaloid isoleret fra traditionel kinesisk medicin Coptischinensis, har anti-inflammary, anti-infektiøse virkninger og har været anvendt til behandling af diabetes og hypertension [4-6]. Senest Berberin viste sig at have anti-tumor-aktivitet, gennem at påvirke MMP-2 /-9 udtryk [7-8], men den underliggende molekylære mekanisme stadig vanskeligt at definere.

Tidligere undersøgelser har vist, at, over- ekspression af COX-2 korrelerer med CRC tumorigenese, ikke kun gjorde det fremmer tumorcelleproliferation og inhiberer apoptose, men også forbedre tumorangiogenese, tumorcellebinding samt migration /invasion [9]. Prostaglandin E2 (PGE

2), den vigtigste katalyseret produkt af COX-2 fra arachidonsyre, spiller en central rolle i CRC tumorgenese [10]. JAK2 /STAT3 signalvejen vedvarende er aktiveret i CRC, opregulering ekspressionsniveauerne af nedstrøms gener, såsom MMP-2 /-9 resulterer i øget cancer cellemigration /invasion og tumormetastase [11-12]. Selv om beviser indsamlet i prostata, lunge kræft og cholangiocarcinom dokumenteret en tæt sammenhæng mellem aktiverede COX-2 /PGE

2 og JAK2 /STAT3 signalveje [13-15], sådan korrelation og dens betydning i CRC stadig mangler at blive belyst . Vores nuværende undersøgelse undersøgte mekanismen for den hæmmende virkning af Berberin på CRC invasion og metastase, og afslørede en betydelig rolle i JAK2 /STAT3 og COX-2 /PGE

2 signalering i disse processer.

Materialer og Metoder

Cell kultur og reagenser

Den menneskelige kolorektal cancer SW620 og LoVo celler blev købt fra ATCC (Manassas, VA, USA). SW620-celler blev dyrket i L-15-medium og LoVo celler i F12K-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 g /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, ved 37 ° C, 5% CO

2, og høj fugtighed. Berberine blev købt fra Aldrich-Sigma (St. Louis, MO, USA), ADZ1480, en JAK2-inhibitor, fra Selleck (Houston, TX, USA). For

in vitro

undersøgelser, Berberin blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) og fryses i alikvoter ved -80 ° C. For

in vivo

eksperimenter, Berberin blev suspenderet i vand suppleret med 0,5% carboxymethylcellulose-natrium (CMC-Na) og opbevaret ved 4 ° C. Endvidere blev DMSO og CMC-Na anvendt som vehikelkontrollen i vores hele undersøgelsen. Antistofferne mod COX-2, s-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9, β-actin, og HRP-gede-anti-kanin IgG, HRP-gede-anti-muse-IgG blev indkøbt fra Cell Signaling (Beverly, MA, USA).

Kliniske tilfælde

Menneskelige kolorektal karcinom prøver og den matchede ikke-tumorer kolon vævsprøver blev indsamlet på tidspunktet for kirurgisk resektion på Shuguang Hospital, Shanghai University of traditionel kinesisk medicin. Al forskning med menneskelige deltagere er blevet godkendt af den etiske komité af Shuguang Hospital, Shanghai University of traditionel kinesisk medicin, og alle kliniske undersøgelser er udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen. Alle patienter skal have “skriftligt informeret samtykke” til at deltage i denne undersøgelse.

Cell levedygtighed analyser

Menneskelig CRC-celler (5 x 10

3) blev udsået plade på 96 brønde i 100 gl dyrkningsmedier, efter fastgørelse, blev behandlet med Berberin i doser på 0, 5, 10, 20, 40 og 80 uM. 24, 48, 72 timer efter behandling blev cellelevedygtighed målt ved anvendelse CCK-8 kit (Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, CCK-8 reagens blev tilføjet på celler og inkuberes i 4 timer, absorbans (OD) blev kvantificeret ved 490 nm med en referencebølgelængde på 630 nm. Cellernes levedygtighed = (ODN-OD

0) /(ODC-OD

0) × 100%, OD

0:. Blank, ODC, ubehandlet kontrol, ODN, Berberin behandlet

xenograft musemodel

Male BALB /C nøgne mus, alder 4-6 måneder, vejede 18 ± 2 g, blev købt fra SLAC Lab Animal Co., Ltd (Shanghai, Kina, licens nr. SCXK 2012-0002) og blive under patogenfrie betingelser for undersøgelserne. Alt dyr arbejde er blevet udført i overensstemmelse med Institutional Animal brug og Omsorgsudvalget af Shanghai University of traditionel kinesisk medicin, og al den forskning blev godkendt af Shanghai Medical Experimental Animal Care Kommissionen og i overensstemmelse med bestemmelserne og generel henstilling af kinesiske forsøgsdyr Administration Lovgivning. Som tidligere beskrevet [16], CRC-celler (1 x 10

6, i 0,2 ml PBS) blev subkutant injiceret i flankerne af nøgne mus at initiere tumorvækst. Når tumorer nå en gennemsnitlig størrelse på 100 mm

3, blev musene randomiseret i 5 grupper (6 mus pr gruppe): Gruppe 1-mus: kontrol (CMC-Na); gruppe 2, 3, 4: oral tvangsfodret Berberin, ved 50, 100, 200 mg /kg /d, henholdsvis; gruppe 5: intraperitonealt injiceret 5-FU, 50 mg /kg /2d. Kropsvægten af ​​dyrene, og de to vinkelrette diametre (a og b) blev registreret hver 2 dage og tumorvolumenet (TV) blev estimeret som: TV = ab

2/2. Musene blev aflivet efter 4 ugers behandling og tumorerne blev udskåret og vejet. Tumoren inhibering blev beregnet som: (1-gennemsnitlig tumor vægt af behandlede mus /gennemsnitlig tumor vægt af kontrolmus) x 100%. I mellemtiden, blod blev opsamlet til analyse af alanin transaminase (ALAT), aspartat transaminase (AST), kreatinin (CT), urea nitrogen (FN) ved hjælp af ELISA-kit (Bogoo, Shanghai, Kina) i henhold til producentens anvisninger.

CRC lunge metastase musemodel

Eksperimentelle lungemetastaser af CRC blev induceret af injektioner af en enkelt-cellesuspension af CRC-celler (1 x 10

6 i 0,2 ml PBS) i den laterale halevene af nøgen mus, som blev randomiseret i 5 behandlingsgrupper som beskrevet i de xenografundersøgelser [17]. Musene blev aflivet efter 4 ugers behandling blev organer lunge fjernet, fastsættes af formalin og paraffin indlejret til yderligere analyse.

Histologi og immunhistokemi (IHC)

The organer og tumor var fjernet, fikseret med formalin, indlejret med paraffin og sektioneret [18]. IHC af COX-2 og p-STAT3 blev udført på de 5-um snit ved anvendelse af antistoffer fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Billeder blev analyseret og kvantificeret for den samlede værdi af optisk densitet (IOD) for IHC positivitet af Image pro-plus 6,0 Software.

Cell migration og invasion analyser

En 24-godt Transwell plade (8-mm porestørrelse, Corning, NY, USA) blev anvendt til at måle hver cellelinie er vandrende og invasiv evne, som vi tidligere beskrevet [19]. CRC-celler blev behandlet ved Berberin i 48 timer, inden de blev trypsiniseret og podet i den øvre transwell kammer (2,5 x 10

4) i 1% FBS dyrkningsmedier, med det nedre kammer indeholdende 600 pi medium med 15% FBS og 10 ug /ml fibronectin. Fireogtyve timer senere blev de migrerede cellerne fikseret med 95% alkohol, farvet med krystalviolet-farvning, analyseret ved mikroskop (Ti-E, Nikon, Tokyo, Japan). For invasion assay, 100 pi fortyndet matrigel (100 ug /ml, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) blev først tilsat til bunden af ​​Transwell kammer, følgende procedure var den samme som migration analyse, bortset fra de invasive celler, der analyseres efter 48 timer.

Western blot-analyse

cellelyse, proteinekstraktion og Western blotting-analyser blev udført som tidligere beskrevet [20]. Proteinprøver (20 ug) blev underkastet 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese, overført til en polyvinylidenedifluoride membran. Membranerne blev blokeret i 5% fedtfri mælkepulver buffer (10 mmol /l Tris, pH 7,5, 100 mmol /l NaCl, 0,1% Tween 20), før den blev inkuberet med primære og senere, sekundære antistoffer, og auto fotograferet. Data fra de vestlige blot eksperimenter blev analyseret af Bio-Rad Mængde One 1D Analysis software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Luciferase Reporter Assay

Brug vores etablerede protokol [ ,,,0],21], blev pGL3-Basic-COX-2-promotoren og en kontrol vektor pRL-SV40 transficeret i CRC-celler. Fireogtyve timer efter transfektion blev forskellige doser af Berberin tilsat på cellerne i yderligere 48 timer. Derefter målingerne af ildflue og

Renilla

luciferaseaktiviteter i cellelysater blev udført under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, USA). Data blev præsenteret som forholdet mellem ildflueluciferaseaktivitet, til

Renilla

luciferaseaktiviteten i hver prøve udført tre gange ± SD.

ELISA

Efter at være blevet behandlet med forskellige koncentrationer af Berberin i 48 timer, blev CRC cellerne igen podes på plader med 24 brønde (5 x 10

4 i 0,5 ml dyrkningsmedium). Otteogfyrre timer senere blev de konditionerede medier opsamlet, centrifugeret (3000 rpm i 10 min), og målt for PGE

2-koncentration under anvendelse af et ELISA-kit (Bogoo, Shanghai, Kina) ifølge producentens instruktioner.

over-ekspression og knockdown af COX-2-genet

CRC-celler blev transficeret med pIRES2-COX-2 eller kontrolvektoren pIRES2 anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ved at følge producentens anvisninger, og de stabilt overekspression COX-2 eller kontrol vektor celler blev valgt med neomycin (G418, 1 mg /ml). For shRNA medieret gen knockdown, CRC-celler var Lipofectamine 2000 transficeret ved Pfu-GW-RNAi plasmider indeholdende COX-2-specifikke siRNA-sekvenser: 1: 5-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3, 2: 5-GCAGATGAAATACCAGTCTTT-3, eller scramble sekvens: 5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3, og de transficerede celler blev selekteret med neomycin. Effektiviteten af ​​gen knockdown blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR og western blot.

RNA-ekstraktion og real-time kvantitativ analyse

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Takara Bio Inc., Dalian, Kina) ifølge producentens instruktioner. Revers transkription blev udført under anvendelse PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Takara Bio Inc., Dalian, Kina). Følgende primere sekvenser blev anvendt til PCR-amplifikation: human COX-2 frem: 5′- GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 ‘, og revers: 5’TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′; TaqMan probe: 5’-FAM-TGGCAGGGTTGCTGGTGGTAG GA-3-TAMRA -3 ‘(Shine Gene, Shanghai, Kina); GAPDH fremad: 5’-CCACTCCTCCACCTTTGA C-3 ‘, og omvendt: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′; TaqMan sonde: 5’-FAM-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3 ‘(Shine Gene, Shanghai, Kina). Real time PCR blev udført i Applied Biosystems 7300 System ved hjælp Premix Ex Taq (Takara Bio Inc., Dalian, Kina).

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev afsluttet med SPSS (version 18) software, blev dataene præsenteret som betyder med standardafvigelse (SD), og den statistiske sammenligning blev udført under anvendelse af t-test, envejs ANOVA-analyse, Mann-Whitney-test eller Kruskal-Wallis test.

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultat

1.Berberin hæmmede cellevækst og migration /invasion af CRC in vitro og in vivo

Vi først testet den inhibitoriske virkning af Berberin på etablerede xenotransplantattumorer af humane CRC cellelinier SW260 og LoVo i mus. Som vist i fig 1A og 1B, Berberin inducerede en tumorinhibering på 25.83% og 30.66% i SW620 og LoVo tumorer hhv. Desuden har mus behandlet Berberin ikke have ændret kropsvægt og lever- og nyrefunktion forblev normale (S1 Fig og S1 tabel), hvilket tyder på ingen toksicitet af forbindelsen ved den testede koncentration. Dernæst viste, at Berberin undertrykt

in vitro

cellevækst af disse to CRC cellelinjer, med en IC50 på 54,41 uM for SW620 og 78,66 uM for LoVo, ved 48 timer efter behandling (fig 1C). Vi yderligere angivet, at Berberin reducerede lunge metastase af CRC-celler i en haleveneinjektion induceret musemodel, i en lægemiddeldosering-afhængig måde (figur 1D).

In vitro

transwell undersøgelser bekræftede, at Berberin, ved koncentrationer narkotika på 10, 20 og 40 uM, effektivt kan kompromitteret evne CRC celler til at migrere og invadere (Fig 1E).

A. Berberin hæmmer CRC xenograft tumorvækst. Subkutant implanterede tumorer i CRC cellelinje SW620 og LoVo blev behandlet med kontrol, 5-FU, og 3 doser af Berberin i 28 dage. Tumorvolumener hos forskellige grupper af mus blev registreret og fremlagt. B. xenotransplantattumorer udskåret fra mus behandlet med medicin og varighed er angivet i A. C. Berberin falder CRC cellernes levedygtighed

in vitro

. SW620 og LoVo-celler blev behandlet med varierende koncentrationer af Berberin for 24, 48 og 72 timer. Gennemsnitsværdien ± SE fra 5 replikater blev vist. D. Berberin falder CRC celle lunge metastase i mus. Mus med SW620 og LoVo celle lunge metastase blev behandlet med angivne variable Berberin doseringer. Overpanel: repræsentant HE farvede sektioner af mus lunge med CRC celle metastase foci. Underpanel: antal CRC lunge metastase foci i kontrol og Berberin behandlede mus. E. Berberin hæmmer migration og invasion af CRC celler. Cellemigration og invasion assayresultater af CRC cellelinier SW620 og LoVo, behandlet med Berberin eller kontrol. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Barerne og fejl søjler repræsenterer midler ± SE, og

P

-værdi blev beregnet ved hjælp af en uafhængig

t

-test. **

P

0,01, kontrol vs behandlet;

##

P

0,01, kontrol vs behandlet

2.Berberin nedreguleret ekspressionsniveauerne af COX-2 og PGE2 i CRC celler

.

Vi næste undersøgt de underliggende mekanismer for hæmning af CRC migration celle /invasion af Berberin. Vi startede med at fastslå, at i SW620 og LoVo celler, ekspressionsniveauerne af COX-2 og PGE

2 blev svækket ved Berberin i et lægemiddel dosisafhængig måde (Fig 2A, 2B og 2D). Disse data blev bekræftet af en COX-2-promotor luciferase reporter assay, hvilket indikerer, at aktiviteten af ​​COX-2-promotoren blev undertrykt af Berberin (fig 2C). For at understøtte vores hypotese, gennemførte vi COX-2 overekspression og knockout eksperimenter, der viser, at forhøjede niveauer af COX-2 protein up afkrydsede vandrende /invasive evne til CRC celler, mens COX-2-genet knockout af shRNA konstruktion nået modsatte virkning (fig 2E). Desuden kan tilsætning af PGE

2, downstream katalyseret produkt af COX-2, forhøjet også graderne af migration og invasion i CRC-celler (fig 2F).

A. og B. Ekstrakter fra SW620 og LoVo celler behandlet med Berberin ved angivne koncentrationer i 48 timer blev analyseret for COX-2. C. SW620 og LoVo-celler blev transficeret med en COX-2 reporterkonstruktion og en TK-

Renilla

konstruere (til transfektion /ladningskontrol) i 24 timer, behandlet med de angivne doser af Berberin i yderligere 48 timer, og blev lyseret og underkastet ildflue og

Renilla

luciferaseaktivitet målinger. Søjlerne viser fold induktion i forhold til kontrollen no-behandling (middel ± SE). D. Niveauer af PGE

2 i SW620 og LoVo celler behandlet ved angivne doser af Berberin i 48 timer blev målt ved ELISA (middel ± SE). CRC migration og invasion celle påvirkes ved E. Overekspression eller knockdown af COX-2-gen; F. PGE

2. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Barerne og fejl søjler repræsenterer midler ± SE, og

P

-værdi blev beregnet ved hjælp af en uafhængig

t

-test. **

P

0,01, kontrol migration vs behandlet;

##

P

. 0,01, invasion kontrol vs behandlet

3.Berberin hæmmede JAK /STAT3 signalering i CRC celler

For at afgrænse den mekanisme af den hæmmende virkning på CRC migration celle /invasion, vi afhørt indflydelsen af ​​Berberin på celle signalveje. Vi fandt Berberin faldt betydeligt phosphoryleringsniveauerne af JAK og STAT3 proteiner (pJAK2 og pSTAT3) i CRC celler (Fig 3A). Til sammenligning ved anvendelse af en JAK2 inhibitor (AZD1480), vi ligeledes modvirkede pJAK2 og pSTAT3, hvilket resulterer i de dæmpede cellulære migration /invasion niveauer af CRC-celler (Fig 3B og 3C).

A. Uddrag fra SW620 og LoVo celler behandlet med Berberin ved angivne koncentrationer i 48 timer blev analyseret for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 og beta-actin (som lastning kontrol). B. JAK inhibitor AZD1480 blokke JAK2 /STAT3 signalering. Uddrag fra SW620 og LoVo celler behandlet med AZD1480 (5 uM) blev analyseret for ekspressionen af ​​pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 og beta-actin. C. AZD1480 hæmmer migration og invasion af CRC celler. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Barerne og fejl søjler repræsenterer midler ± SE, og

P

-værdi blev beregnet ved hjælp af en uafhængig

t

-test. **

P

0,01, kontrol migration vs behandlet;

##

P

0,01, invasion kontrol vs behandlet

4.Elevated ekspressionsniveauer af COX-2 og pSTAT3 korreleret med tumor invasion og metastase i primære humane. CRC

immunhistokemisk (IHC) analyse af primære CRC prøver illustrerede, at ekspressionsniveauerne af COX-2 og pSTAT3 var signifikant højere i CRC væv sammenlignet med de hosliggende normale væv (fig 4A og tabel 1). Som det kan ses i tabel 2 og 3, var der en stærk korrelation mellem tilstedeværelsen af ​​COX-2 eller pSTAT3 med graden af ​​differentiering, omfanget af invasion og metastase, og Duke iscenesættelse. COX-2 og pSTAT3 positivitet på IHC korrelerede ikke med patientens alder, køn og tumorstørrelse. Overlevelsen var signifikant længere i COX-2-lave udtrykkende patienter mod COX-2-høje dem, men ingen sammenhæng mellem pSTAT3 niveauer og patientoverlevelse tiden (Fig 4B).

A. Eksempler på CRC tumorprøver farvet for COX-2 og pSTAT3 er vist. B. Expression niveauer af COX-2 og pSTAT3 ikke korrelerer med CRC patienternes overlevelse. Vejviser

5.COX-2 /PGE2 reguleret JAK2 /STAT3 signalering i CRC-celler

Vi næste overudtrykt COX-2-protein i CRC SW620 og LoVo-celler ved transfektion, og fundet forhøjede niveauer af pJAK2 og pSTAT3 og nedsat ekspressionsniveauer af MMP-2, MMP-9, som er transkriptionelt reguleres nedstrøms for JAK2 /STAT3 signalering; på den anden side shRNA konstruktion medierede COX-2-gen knockdown havde den modsatte virkning (fig 5A og 5B). Tilsætningen af ​​PGE

2-ligand til CRC-celler markant aktiveret JAK2 /STAT3 signaleringen og ekspression af MMP-2 /-9 (Fig 5C og 5D). Baseret på disse data, vi hypotese, at aktiveret COX-2 /PGE

2 akse forbedret JAK2 /STAT3 signalvejen, opreguleres ekspressionsniveauerne af MMP-2 /-9, hvilket fører til øget metastatiske potentiale CRC-celler.

A. og B. Uddrag af SW620 og LoVo celler transficeret med COX-2 overekspression eller shRNA konstruktion blev analyseret for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 og beta-actin. C. og D. Uddrag fra SW620 og LoVo celler behandlet med PGE

2 for angivne varigheder blev analyseret for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 og beta-actin.

6.Berberin hæmmede CRC celle invasion og metastase via undertrykke COX-2 /PGE2 /JAK2 /STAT3 signalering akse

Med vores data, der viser Berberin hæmme COX-2 /PGE

2 udtryk og JAK2 /STAT3 signalering samt COX-2 /PGE

2 regulerer JAK2 /STAT3 pathway, vi hypotese at mekanismen af ​​Berberin hæmmende virkning på CRC invasionsevne og metastatisk potentiale var dens negative indflydelse på signalering akse af COX-2 /PGE

2-JAK2 /STAT3. For at teste denne teori om vores, behandlede vi CRC celler under anvendelse JAK2 inhibitor AZD1480, og fundet ekspression af MMP-2 /-9 var “afkoblet” fra COX-2 og PGE

2, således at hverken overekspression af COX-2 eller tilsætning af ligand PGE

2 kunne øge proteinniveauer af MMP-2 /-9 (fig 6A og 6C). Omvendt med AZD1480 blokering JAK2 /STAT3 signalering, Berberin havde ingen virkning på MMP-2 /-9 ekspressionsniveauer (Fig 6B og 6D).

A. og B. Uddrag af SW620-celler behandlet med AZD1480 i 2 timer, transficeret med COX-2 over-ekspressionskonstruktion i 24 timer, behandlet med Berberin (40 uM) i 48 timer, blev analyseret for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP -2, MMP-9 og beta-actin. C. og D. Uddrag af SW620-celler behandlet med AZD1480 i 2 timer, behandlet med Berberin (40 uM) eller PGE

2 (5 uM) i 48 timer, blev analyseret for pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP- 2, MMP-9 og beta-actin.

diskussion

invasiv og metastase, karakteristika af maligne tumorer, er de vigtigste grunde til, at behandlinger mod kræft mod CRC mislykkes. At finde frem hidtil ukendte metastase-målretning antitumorlægemidler synes at være rimeligt at forøge overlevelsesraten for CRC patienter. Bliver brugt mere og mere i klinikken, har traditionel kinesisk medicin (TCM) vist sig at være et vigtigt alternativ behandlingsmulighed for CRC, foruden kirurgi og kemoterapi [22]. Med akkumulere dokumentation for, at TCM er meget effektiv behandling af kræft, er det i stigende grad vigtigt og nødvendigt at studere mekanismerne bag anti-tumor aktiviteter TCM og deres komponenter. Berberin, et alkaloid isoleret fra TCM urt Coptis chinensis, har vist sig at have anti-tumor virkning ved behandling af CRC, lever, bryst, prostata og lungekræft [23-27]. I vores aktuelle undersøgelse, vi præsenterede

in vitro

in vivo

data afgrænser Berberin induceret hæmning af CRC cellevækst, migrering /invasion og metastase desuden vi udforskede understreger mekanisme.

Tidligere undersøgelser har vist, at COX-2, det hastighedsbegrænsende enzym katalyserer omdannelsen af ​​arachidonsyre til PGE

2, over-udtrykker i tumorvæv af multiple maligniteter, herunder CRC. Som den nedstrøms effektor af COX-2, PGE

2 fremmer tumorangiogenese, cellevækst, migrering /invasion, og immun unddragelse. Derfor PGE

2 fortsat en vigtig faktor tumorigenese. Epidemiologiske undersøgelser har antydet, at langvarig, kan rutinemæssig udtagning af COX-2-hæmmer såsom NSAID (steroide anti-inflammatoriske lægemidler) falde 50% af CRC forekomst [28-29]. Vores resultater viste, at Berberin inhiberede ekspressionsniveauerne af COX-2 og PGE

2 i CRC-celler, i overensstemmelse med data Singh et al fundet i melanom celler behandlet med Berberin [30]. Således vil Berberin være så effektiv som de NSAID at reducere CRC incidens? Dette vil være en meget interessant emne for de fremtidige undersøgelser, især på den mekanisme, som Berberin værker i CRC celler.

JAK2 /STAT3 signalvejen er vedvarende aktiveret i lunge, brystkræft og i CRC [31-32 ]. Under normale fysiologiske tilstand, JAK2 /STAT3 signalvejen transient aktiveret. Vækstfaktorer og cytokiner binder til deres receptorer på celleoverfladen til aktivering JAK2, som igen phosphorylerer tyrosinresten 705 (Tyr705) af STAT3-protein for at aktivere den (pSTAT3). pSTAT3 danner homodimerer eller heterodiers, translokerer ind i kernen, transaktiverer ekspressionsniveauerne af cyclin D1, VEGF og MMP-2 /-9 gener [33-36], hvis proteinprodukter er involveret i reguleringen af ​​tumorcellevækst, apoptose, angiogenese og metastase. Det blev allerede vist ved undersøgelserne i nasopharyngeal cancer og diabetisk sygdom, Berberin blokerede JAK2 /STAT3 signalering [37-38], og vores nuværende data har tilføjet en anden bevis hævde den hæmmende virkning af Berberin på JAK2 /STAT3 aktivering samt udtryk for dens downstream målgener MMP-2 /-9 i CRC -. dette sandsynligvis er en del af den biologiske mekanisme af Berberin anti-tumor effekt

Da foreslog vores data, at Berberin påvirket både COX-2 /PGE

2 og JAK2 /STAT3 signalveje, vi yderligere undersøgt protein niveauer af COX-2 og pSTAT3 i primære CRC prøver, og forhørt enhver sammenslutning og lovgivningsmæssige sammenhæng mellem disse 2 vigtige aktører. I overensstemmelse med andre forskeres observation af en tæt forbindelse mellem aktiverede COX-2 /PGE

2 og JAK2 /STAT3 signalveje i prostata, lungekræft og cholangiocarcinom [13-15], opdagede vi, i humane CRC væv, højere beløb af COX-2 og pSTAT3, som i væsentlig grad korreleret med hinanden, og samlet begge var forbundet med højere grad af tumorindtrængen og metastase. Næste vores in vitro-undersøgelser afsløret, at COX-2 /PGE

2 reguleres CRC cellemigration /invasion proces gennem JAK2 /STAT3 signalering, og overekspression af COX-2 og PGE

2 vendt hæmmende virkning af Berberin på JAK2 /STAT3-aktivering og cancerceller mobilitet. Desuden afslørede vi, at AZD1480, en JAK2 inhibitor /STAT3-aktivering blokker [39-40], frakobles COX-2 /PGE

2 og Berberin påvirker ekspressionsniveauerne af MMP-2 /-9. Disse fund af os belyst COX-2 /PGE

2-JAK2 /STAT3 signaleringskaskade som målet lægemiddel til Berberin at mediere dens virkning på CRC invasionsevne og metastase. Sammenfattende Berberin reducerer COX-2 /PGE

2 niveauer, til gengæld dæmper JAK2 /STAT3-aktivering, hvilket fører til nedsat ekspression af downstream målgener MMP-2 /-9, hvilket resulterer i mindre invasionsevne og metastase i CRC (Fig 7 ). Denne rapport af os har givet en vigtig sæt af præ-kliniske data for den fremtidige omfattende brug af Berberin i behandling CRC.

PGE2, det vigtigste katalyseret produkt af COX-2 fra arachidonsyre, kunne binde til EP receptor på cellemembranen, hvorved aktivering af JAK2, efterfulgt af phorphorylating af STAT3 i Tyr705 site. Den aktiverede p-STAT3 danner homo- eller heterodimerer, der translokerer til kernen, binder til den nedstrøms målgen MMP-2, MMP-9, og fremskynde tumorprogression. Hæmme COX-2 /PGE2 medieret JAK2 /STAT3 signalvejen, kunne være en af ​​mekanismerne i den hæmmende virkning af Berberin på invasionen og metastase i kolorektal cancer.

Støtte Information

S1 fig. Berberin hæmmer CRC cellevækst og metastase.

Kropsvægt af mus, kontrol

vs

Berberin gruppe. Behandling med Berberin har ringe effekt på musenes kropsvægt. Ingen signifikant forskel mellem dyr behandlet med Berberin ved en dosis på 200 mg /kg per dag og kontroldyrene. Data, der er vist som middel ± SD. B. Repræsentative leverprøver fra kontrol- og Berberin mus blev behandlet og farvning af HE. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123478.s001

(TIF)

S1 tabel. Effekt af Berberin på lever- og nyrefunktion (betyder ± SD)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123478.s002

(DOC)