PLoS ONE: Intravesikal ALT-803 og BCG behandling Reducerer Tumor Burden i en Kræftfremkaldende Induced blærekræft Rat Model; En rolle for cytokinproduktion og NK-celle Expansion

abstrakt

Intravesikal Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er blevet vist at fremkalde en specifik immunologisk respons (

dvs.

, aktivering af IL-2 og effektor T-celler), mens prækliniske studier ved hjælp af ALT-803 (muteret IL-15 analog kombineret med IL-15Ra-Fc fusion) har vist lovende resultater ved at forlænge agentens halveringstid og stimulerende CD8 + T-celler. Baseret på disse resultater, vi den hypotese, at den intravesikal administration af ALT-803 sammen med BCG vil generere en immunologisk respons fører til betydelig blære tumor byrdereduktion. Ved hjælp af en veletableret carcinogen-induceret rotte non-muskel invasiv blærekræft (NMIBC) model, studerede vi effekterne af intravesikal ALT-803 med og uden BCG. Rottevæv blev evalueret for at dokumentere behandlingsrespons. Intravesikal ALT-803 var sikkert og veltolereret alene og i kombination med BCG. Som en enkelt behandling agent, ALT-803 reducerede tumor byrde med 35% i forhold til kontrol mens BCG alene kun reduceret tumor byrde med 15%. Kombinationen af ​​ALT-803 plus BCG reducerede tumorbelastning med 46% sammenlignet med kontrol. Immunovervågning foreslog, at antitumorresponset blev knyttet til produktion og sekretion af IL-1α, IL-1β og RANTES, hvilket igen inducerede proliferation og aktivering af NK-celler. Endelig blev tumorale svarene fra multikombinerbare behandling forbundet med 76% reduktion i angiogenese, som er betydeligt højere end ved undersøgelse ved hvert middel alene. Den forbedrede terapeutiske indeks set med denne duplet giver begrundelse for udviklingen af ​​dette regime for fremtidige kliniske forsøg

Henvisning:. Gomes-Giacoia E, Miyake M, Goodison S, Sriharan A, Zhang G, Du L, et al. (2014) Intravesikal ALT-803 og BCG behandling Reducerer Tumor Burden i en Kræftfremkaldende Induced blærekræft Rat Model; en rolle for cytokinproduktion og NK Cell Expansion. PLoS ONE 9 (6): e96705. doi: 10,1371 /journal.pone.0096705

Redaktør: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, USA

Modtaget: Januar 14, 2014 Accepteret: April 10, 2014; Udgivet: 4 Jun 2014

Copyright: © 2014 Gomes-Giacoia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af James og Esther kong Biomedical Team Science Project 1KT-01 (CJ Rosser). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Følgende forfattere EGG, MM, SG, AS, GZ, ASP, KXC og CJR har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. LY, JOE, PRR og HCW er medarbejdere i Altor BioScience Corp. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Blærekræft (BCA) er den femte mest almindelige malignitet i USA, at blive diagnosticeret i cirka 74.690 patienter resulterer i cirka 15.580 dødsfald i 2014 [1]. Halvfjerds til firs procent af patienter med BCA stede med ikke-muskel invasiv blærekræft (NMIBC), som er cancer begrænset til slimhinden i blæren [2], [3]. NMIBC behandles ved transuretral resektion af tumorerne efterfulgt af administration af adjuverende intravesikal kemoterapi eller intravesikal Bacillus Calmette-Guérin (BCG), som kan mindske tilbagefald satser og forlænger progressionsfri interval [2] – [4]. På trods af dette, ca. 50-60% af NMIBC patienter, der gennemgår resektion og intravesikal terapi vil opleve en tumor tilbagefald [5]. Desuden af ​​dem, der oplever en gentagelse, vil ca. 30% fremskridt og bukke under for deres sygdom over en periode på 15 år, mens en anden 50% vil undergå radikale cystektomi i et forsøg på at kontrollere deres sygdom [6]. Som sådan et centralt emne i marken forbliver behovet for bedre terapeutiske alternativer til at reducere tilbagefald satser, forbedre overlevelsesrater og fjerne behovet for radikale operation.

Den nøjagtige virkningsmekanisme, hvorved intravesikal BCG udøver sin anti -tumorigenic virkninger er ikke kendt. Det er imidlertid klart, at BCG-aktivitet er afhængig af induktion af inflammatoriske reaktioner, der involverer aktivering af multiple typer af immunceller. Oprindeligt intravesikal BCG binder til urothelial foring og derefter internaliseres og behandles af normale og maligne celler, der udløser en kompleks proinflammatoriske respons kendetegnet ved frigivelse af IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α og GM-CSF [ ,,,0],7], [8]. Efterfølgende viste en række af immunceller, herunder T-celler, naturlige dræberceller (NK) -celler, neutrofile og makrofager migrerer til blæren, hvor de bliver aktiveret og producerer yderligere proinflammatoriske cytokiner og chemokiner [9], [10]. Dette er karakteriseret ved fremkomsten af ​​forskellige leukocytter og cytokiner i urinen fra BCG-behandlede patienter. Mens den særlige rolle, at forskellige celletyper og cytokiner spiller i urothelial carcinoma behandling ikke er helt klare, urin Th1 cytokiner (

f.eks

, IFNy, IL-2 og IL-12) er blevet forbundet med BCG respons , mens høje niveauer af Th2-cytokiner (

f.eks

, IL-10 og IL-6) korrelere med BCG svigt [9] – [16]. Samlet set evne intravesikal BCG at interagere med urothelium og stimulere brede, holdbare Th1- typen immunresponser er sandsynligvis kritisk for dets effektivitet. Som følge heraf er det blevet foreslået, at tilsætningen af ​​immunstimulerende midler, såsom cytokiner, der BCG terapi kunne forøge disse immunreaktioner og i højere grad og /eller mere holdbare antitumorvirkninger. Men til dato har fase 3 kliniske undersøgelser af intravesikal BCG i kombination med IL-2 eller IFN-a2b været begrænsede, med kun én forsøg rapporteret, som ikke demonstrere fordel i forhold BCG monoterapi [17]. Således vil optimale strategier for at maksimere immunoterapeutiske effekt af intravesikal behandling af NMIBC sandsynligvis kræve nye tilgange.

IL-15 er en kritisk faktor i udvikling, spredning og aktivering af effektor naturlige dræberceller og CD8

+ T-celler [18], [19] og har været opført som den mest lovende middel blandt tolv immunterapi lægemidler med et stort potentiale til brug i behandling af human cancer [20]. Vi har for nylig isoleret en hidtil ukendt IL-15 mutant med en 4-fold stigning i biologisk aktivitet [21]. Farmakokinetikken (PK), biodistribution og biologisk aktivitet af denne IL-15 superagonist (IL-15N72D) er blevet yderligere forbedret gennem interaktion med det opløselige domæne af IL-15-receptor α protein (IL-15RαSu) for at oprette IL-15N72D /IL-15RαSu-Fc-fusion kompleks (benævnt ALT-803). Dette kompleks har mindst 25 gange den

in vivo

biologiske aktivitet af nativt IL-15 [22], [23]. Vi har for nylig vist, at systemisk ALT-803 behandling inducerer holdbare og beskyttende immun celle-medieret antitumor reaktioner i flere musemodeller for blodkræftsygdomme [22], [23]. ALT-803 står som en potent immunostimulant, der er i stand til samtidig at aktivere de medfødte og adaptive arme af immunsystemet til at fremkalde både hurtig og langvarig beskyttende responser mod infektiøse eller neoplastiske udfordringer til værten [24].

Motiveret af de tvingende prækliniske data relateret til IL-15, vi testede den terapeutiske virkning af intravesikal ALT-803 alene og i kombination med BCG i en veletableret gnaver kræftfremkaldende induceret NMIBC model. Konkret har vi observeret, at a) intravesikal ALT-803 var sikkert og veltolereret alene og i kombination med BCG, b) ALT-803 plus BCG reducerede tumorbelastning med 46% sammenlignet med kontrol, som var højere end med hvert middel alene, c ) immunovervågning foreslået, at antitumorresponset set med kombinationen af ​​ALT-803 plus BCG blev knyttet til produktion og sekretion af IL-1α, IL-1β og RANTES, hvilket igen inducerede proliferation og aktivering af NK-celler og d ) tumorale reaktioner er set med kombinationen af ​​ALT-803 og BCG var forbundet med en betydelig reduktion i angiogenese. De opmuntrende resultater, der præsenteres i denne rapport vil støtte vores overvejelser for yderligere udvikling af denne roman terapeutiske duplet i behandlingen af ​​patienter med NMIBC.

Materialer og metoder

Dyr, reagenser, og tumor model

Halvfems Sprague Dawley-rotter, seks til otte uger gamle, blev opnået fra Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Animal pleje var i overensstemmelse med anbefalingerne fra

Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

(National Research Council) og godkendt af vores lokale IACUC på University of Central Florida. N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN) blev købt hos TCI America (Portland, OR), alikvoteret og opløst i 1% Tween. ALT-803 (IL-15N72D:IL-15RaSu /Fc) blev dannet som tidligere [21] beskrevet og fortyndet med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). PBS tjente som negativ kontrol. Frysetørret BCG blev købt fra Sanofi Pasteur Limited (Toronto, CA) og rekonstitueret som pr instruktioner med sterilt PBS og tjente som positiv kontrol. Efter at have ladet dyr at akklimatisere til vores anlæg i en uge, alle dyr, bortset fra fem modtog 0,05% BBN i deres drikkevand kontinuerligt i otte uger inducerer dannelsen af ​​NMIBC, hvilket er en veletableret gnaver carcinogen-induceret BCA model [25] – [ ,,,0],30] med markante molekylære ændringer svarende til human BCA [31]. Efter 8 ugers BBN eksponering, genoptog dyrene vand uden tilsætning af BBN. ​​

Intravesikal behandling

Efter BBN eksponering (uge 9) blev rotter randomiseret til en af ​​fire behandlingsgrupper (kontrol- PBS; ALT-803 ved 1 ug /dosis; BCG på 1,35 mg /dosis [26], [27], eller ALT-803 ved 1 ug /dosis plus BCG 1,35 mg /dosis). Hver gruppe indeholdt 20 dyr. Indledende forsøg med ALT-803 noterede a) terapeutisk respons med en intravesikal dosis på 1 ug og b) forbedret terapeutisk respons med samtidig administration af ALT-803 plus BCG forhold til sekventiel administration af disse to midler (data ikke vist). Alle blære instillationer blev udført i 200 pi sterilt PBS. Rotter blev bedøvet med isofluran derefter en 22-gauge Teflon angiokateter (transurethral kateter) blev anbragt i blæren via urinrøret og urin blev fuldstændig drænet fra blæren [32]. Derefter blev PBS, BCG, ALT-803, eller en kombination af ALT-803 plus BCG-terapi leveret af transurethral instillation gennem transurethral kateter og fik lov til at bo i blæren i 1 time ved okklusion af urinrøret med en tobaksposesutur. Efter 1 time blev tobaksposesutur fjernet, og rotterne blev stimuleret til at udvise blære indhold [32]. Den intravesikal terapi blev indgivet ugentligt i i alt seks uger at efterligne intravesikal BCG terapi hos mennesker [33]. To uger efter afslutning af intravesikal behandling blev dyrene aflivet, og væv (

f.eks.

, Fuldblod, serum, urin, blære og milt) blev høstet og forarbejdet til efterfølgende analyse. Figur 1 illustrerer forsøgsbehandlingen skema.

Behandling med PBS, BCG, ALT-803, eller ALT-803 plus BCG påbegyndt én uge efter afslutning af otte uger udsættelse for 0,05% N-butyl-N- ( 4 hydroxybutyl) nitrosamin i drikkevandet. Rotter blev randomiseret i fire grupper og behandlet ugentligt i seks på hinanden følgende uger i henhold til tidsplanen. Rotter blev aflivet og obduceret to uger senere. CTRL, kontrol.

Ultralyd billeddiagnostiske undersøgelser

Gennem undersøgelsen blev intravesikal tumor byrde overvåget

in situ

ved transabdominal ultralydsscanning hjælp af Vevo 2100 imaging system med en MS550D 22-55 MHz håndholdte Microscan transducer (Visualsonics, Toronto, ON, Canada). Kort fortalt blev rotter bedøvet med isofluran derefter 200 pi sterilt PBS blev inddryppet ind i blæren som beskrevet ovenfor for at tilvejebringe et ensartet billede af alle blærer visualiseret. Intraluminale tumorer blev observeret og digitale billeder fanget. Blærevæggen tykkelse (i mm), et surrogat for tumorbyrde, blev målt med målingen funktionen Vevo 2100.

Histopatologi af tumorsektioner

operativt fjernede blærer blev indledningsvis vejet derefter 12 blærer fra hver gruppe blev fyldt med 200 pi 10% neutral pufret formalin. Blæren halse blev ligeret og hele prøver anbragt i 10% neutral pufret formalin. Blærer i formalin blev indlejret i paraffin, snittet (5 um) og anbragt på Superfrost plus Micro objektglas (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). De resterende otte blærer i hver gruppe blev fyldt med 200 pi O.C.T. indlejring forbindelse (Andwin Scientific, Schaumburg, IL) og blære hals blev ligeret. De blærer blev nedsænket i Tissue-Tek O.C.T. Forbindelse (Ted Pella, Inc., Redding, CA) i cryomolds og frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Blærer frosset i O.C.T. blev snittet (5 um), opvarmes ved stuetemperatur i 5 minutter, fikseret i iskold methanol i 10 minutter og vasket med PBS forud for immunhistokemisk farvning. Afparaffiniseret og frosne snit fra hver rotte blev underkastet hematoxylin og eosinfarve til histologisk evaluering. Derudover blev deparaffinerede objektglas behandlet med 1% hydrogenperoxid i 100% methanol for at blokere endogen peroxidaseaktivitet efterfulgt af citronsyre antigen-genvinding. Objektglas blev inkuberet natten over med antistoffer mod CD3

+ (BD Biosciences, G4.18, mus monoklonalt antistof, fortynding 1/250), CD8a

+ (BD Biosciences; OX-8, mus monoklonalt antistof, fortynding 1 /10), CD161

+ (AbDSerotec, 10/78, mus monoklonalt antistof, fortynding 1/100) (påvisning af NK-celler), CD163

+ (AbDSerotec; ED2, mus monoklonalt antistof, fortynding 1/50) ( afsløre makrofager), Ki-67 (Dakota North America Inc .; MIB-5, mus monoklonalt antistof, fortynding 1/50), eller kløvet caspase 3 (Cell Signaling Technology, 5A1E, kanin monoklonalt antistof, fortynding 1/1 500). Frosne snit blev inkuberet natten over med antistoffer mod CD4

+ (BD Biosciences; OX-35; muse monoklonalt antistof, fortynding 1/250) eller CD31 (Santa Cruz Biotechnology; H3, monoklonalt muse-antistof, fortynding 1/250). Dernæst blev deparaffinerede og frosne snit inkuberet med biotinyleret anti-mus eller anti-kanin IgG (H + L) antistoffer ved 10 ug /ml (Vector Laboratories INC., Burlingame, CA). Efterfølgende blev snit farvet ved anvendelse af Ultra-Sensitive ABC Mouse IgG-farvning kit (EMD Millipore, Billerica, MA) eller biotin /streptavidin immunfarvning kit (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Alle farvede sektioner blev filmede med et Nikon Eclipse E400 lysmikroskop (Nikon Inc., Melville, NY) med QIClick digitale CCD-kamera (QImaging, Surrey, BC, Canada) og Nikon NIE-Elements Basic Research imaging software.

Detaljeret histopatologisk analyse af neoplastisk respons på intravesikal terapi blev udført i hvert blære af to erfarne, uafhængige observatører (mM og AS). Kort fortalt CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-celler, NK-celler og makrofager blev talt i mindst fire tilfældigt udvalgte felter pr højstyrkefelt (HPF) i hver prøve. Resultater blev scoret ved at beregne antallet af infiltrerende immunfarvning celler.

Endvidere blev tumor angiogenese undersøgt på objektglas farvet med anti-CD-31 monoklonalt antistof og mikrokar densitet (MVD, mikrokar /mm

2) blev vurderet som tidligere beskrevet af Weidner

et al.

[34]. Single endotelceller eller klynger af endotelceller var positive for CD-31 blev betragtet som et fartøj. Fire områder med den højeste mikrokar koncentration fra hver prøve blev identificeret ved 4 × forstørrelse og billeder blev taget til kvantificering af MVD på 200 ×. De to uafhængige observatører talte antallet af mikrokar i hvert histologisk område. MVD af prøven blev estimeret som en middelværdi af skibe i mindst fire histologiske felter. Desuden farvende dias med det monoklonale antistof rettet mod Ki-67 vurderes proliferation. Ki-67 immunfarvning blev talt i mindst fire tilfældigt udvalgte felter fra hver behandlingsgruppe ved 200 ganges forstørrelse. Celler med tvivlsom nukleare farvning blev diskonteret. Observatørerne scoret resultaterne ved at estimere procentdelen af ​​tumorceller, som viser den karakteristiske nukleare farvning (proliferative indeks). Endelig farvende dias med det monoklonale antistof rettet mod spaltet caspase-3 vurderes apoptose. Spaltet caspase-3 immunfarvning blev talt i en minimal på 3000 celler fra hver behandlingsgruppe ved 200 ganges forstørrelse. De to observatører scoret resultaterne ved at estimere procentdelen af ​​tumorceller, der viser den karakteristiske cellulær farvning (apoptotisk indeks).

Flowcytometrisk analyse af PMBC og milt til T-celler, NK-celler og makrofager

mononukleære Rat perifere blodceller indsamlet fra fuldblodsprøver i EDTA-rør blev farvet direkte ved inkubation med fluorescensmærkede antistoffer CD3

+ (eBioscience), CD4

+ (BD Biosciences), CD8a

+ (eBioscience) , NKG2D-positive (eBioscience) (detektion NK-celler), F480-PE (eBioscience) (påvisning makrofager), eller isotypekontrol antistoffer (eBiosciences, San Diego, CA) i 30 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af lyse af røde blodlegemer under anvendelse af BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences, San Jose, CA) ved stuetemperatur i 3-5 minutter. Celler blev efterfølgende vasket to gange med PBS indeholdende 1% føtalt bovint serum. Farvede celler blev analyseret ved hjælp af en FACScan flowcytometer (BD Biosciences) og data blev indsamlet for 10.000 events /prøve. Analyse af de indsamlede blev udført ved hjælp af Cyflogic software (CyFlo LTD, Turku, Finland) data. Desuden blev enkeltcellesuspensioner af rotternes miltene genereret ved forsigtigt at homogenisere væv i en petriskål og derefter passage gennem en Cellector Tissue Sieve (Bellco Glass, Vineland, NJ). Røde blodceller blev fjernet fra rotte splenocytter med BD FACS lyseringsopløsning ved inkubation i 3-5 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af centrifugering ved 1.200 rpm i 5 minutter. De pelleterede splenocytter blev vasket to gange med PBS indeholdende 1% kalvefosterserum efterfulgt af direkte immunfluorescensfarvning som beskrevet ovenfor.

urin- og serum inflammatoriske cytokin ELISA-assay

udtømt urin fra hver rotte blev opsamlet i et rør på is indeholdende en koncentreret urin stabilisator opløsning (2 M Tris-HCI [pH 7,6], 5% BSA, 0,1% natriumazid, og en komplet mini proteaseinhibitortablet (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)). Urin blev centrifugeret, og supernatanten blev opbevaret ved -80 ° C. Tilsvarende serum blev opsamlet i rør indeholdende EDTA, centrifugeret ved 10.000 x g i 15 minutter og opbevaret ved -20 ° C. Urin- og serumprøver blev underkastet profilering af 12 inflammatoriske cytokiner under anvendelse af et ELISA-assay (RAT Cytokine multi-analyt ELISArray, SABiosciences, San Diego, CA). Kort fortalt blev urin- og serumprøver inkuberet i mikroplader med 96 brønde belagt med anti-rotte primære antistoffer mod 12 inflammatoriske cytokiner (IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL -12, IL-13, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF og RANTES) og derefter fremkaldt med sekundære antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase. Efter tilsætning af substrat og stoppe løsning blev Fluostar Optima Reader (BMG LABTECH, Ortenberg, Tyskland), der anvendes til at måle absorbansen ved 450 nm.

Statistik

Eksperimentelle data blev udtrykt som gennemsnit ± SEM , medmindre andet er angivet. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af ikke-parametrisk Kraskal-Wallis test efterfulgt af post hoc Dunnet test for blære vægt, blære vægtykkelse, immunfarvning af blæren, vandladningsproblemer cytokiner og serumcytokiner. Parametrisk ANOVA test efterfulgt af post hoc Bonferroni test blev udført for de data relateret til lymfocytter i milten og lymfocytter i perifert blod. En

s

0,05 blev betragtet som signifikant. Alle statistiske analyser og tal blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-software 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Resultater

Antitumoraktivitet af BCG, ALT-803 og ALT- 803 plus BCG i NMIBC-bærende rotter

i en gnaver kræftfremkaldende induceret NMIBC model, blev rutinemæssige overvågning af tumorer udført af seriel ultralydsscanning med Vevo 1200-systemet. Tumorer var påviselige så tidligt som 3 uger efter eksponering til 0,05% N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) nitrosamin i drikkevand. Som påvist ved ultralydbilleddannelse og bekræftet på histologisk undersøgelse, blev 100% af dyrene sig at udvikle tumorer. Ingen dyr havde håndgribelige, avancerede tumorer. For at bestemme om ultralydbilleddannelse kunne anvendes til at overvåge og vurdere tumorbelastning, blev blærer afbildet og blære vægtykkelse (et surrogat for tumorbyrde rapporteret i millimeter) blev bestemt. Efterfølgende blærer blev resektion, vejet og histopatologisk undersøgt. Vi bemærkede en positiv korrelation (Spearman R = 0,55,

s

0,0001) mellem blære vægtykkelse og blære vægte /blære tumor, så vi rapporterer for første gang, at den ikke-invasive

in situ

overvågning af gnaver blære tumor kan anvendes til at a) bekræfte tumor tage og b) rapporterer terapeutisk reduktion tumor-byrde.

Rotter bærer blæretumorer blev behandlet intravesikalt i 6 på hinanden følgende uger med PBS, BCG, ALT -803 eller ALT-803 plus BCG. Andre end den sparsomme hæmaturi bemærkede (måske fra kateterisation og /eller BCG), blev intravesikale behandlingsformer veltolereret uden mærkbare toksiciteter noteret.

I overensstemmelse med udviklingen af ​​

in situ

tumorer, blære vægte steg med 49% i dyr, der modtog BBN sammenlignet med normale (ingen BBN) kontroldyr (data ikke vist). Men efter seks ugers intravesikal behandling med BCG, ALT-803 eller ALT-803 plus BCG nedsatte signifikant tumorbelastning i blærer af BBN-behandlede rotter (fig. 2). Blære vægt (gennemsnit +/- SEM) blev rapporteret til at være: PBS 0,2 +/- 0,012 gram, BCG- 0,17 +/- 0,012 gram, ALT-803- 0.15 +/- 0,0091 gram og ALT-803 plus BCG- 0.14+ /-0.0054 gram. Ud forud for at blive offer ved uge 16, blev 200 pi sterilt PBS instilleres i hvert blæren for at sikre ensartethed i størrelse og en række tværgående og sagittale ultralydsbilleder blev opnået. Blære godstykkelse (gennemsnit +/- SEM) blev rapporteret til at være: PBS 1 +/- 0,11 mm, BCG- 0,7 +/- 0,05 mm, ALT-803- 0,65 +/- 0,077 mm og ALT-803 plus BCG- 0,54 +/- 0,083 mm. Således fra disse billeder, vi bemærkede med BCG behandling en reduktion på 30% i gennemsnitlig blære vægtykkelse, hvilket svarede til en reduktion på 15% i blære vægtændring i forhold til PBS behandling. ALT-803 behandling alene blev bemærket at have en 25% reduktion i gennemsnitlig blære vægtykkelse og en tilsvarende reduktion i blære vægtændring 35% i forhold til PBS behandling. Interessant nok blev den største reduktion i blære vægtykkelse og blæren vægt ses, når ALT-803 blev kombineret med BCG fører til en reduktion i blære vægtykkelse 30% og en tilsvarende reduktion i blære vægtændring 46% i forhold til PBS-behandling (fig. 2a 2C). Alle resultater blev efterfølgende bekræftet ved detaljeret histologisk undersøgelse (figur 2d.), Hvori H 0,05, **,

s

0,01, ***,

s

. 0,001

Intravesikal ALT-803 plus BCG fremmer en unik lymfatisk infiltration

De blærer af behandlede rotter blev også farvet for immun celle (CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-celler , NK-celler og makrofager) infiltrater (fig. 3 og tabel S1). Antallet af CD3

+ T-celler var signifikant forøget i ALT-803 alene sammenlignet med PBS og BCG alene. Kombination af ALT-803 plus BCG ikke forbedrer antallet af infiltrerende CD3

+ T-celler sammenlignet med ALT-803 alene, men sammenlignet med BCG alene, antallet af infiltrerende CD3

+ T-celler var signifikant højere i kombination gruppen. CD4

+ T celler blev ikke påvirket i nogen gruppe i forhold til PBS (

data ikke vist

). CD8a

+ T-celler blev forøget betydeligt i BCG alene, ALT-803 alene og ALT-803 plus BCG i forhold til PBS. Kombinationen af ​​ALT-803 og BCG ikke havde en større virkning end BCG alene eller ALT-803 alene. Dernæst blev antallet af NK-celler ikke øget i BCG alene eller ALT-803 alene sammenlignet med PBS, men antallet af NK-celler blev forøget, når ALT-803 blev tilsat til BCG. Endvidere kombinationen af ​​ALT-803 plus BCG resulterede i forøgede infiltrerende NK-celler sammenlignet med BCG alene eller ALT-803 alene. ændrer Ingen betydeligt i makrofag infiltration blev observeret i nogen behandlingsgruppe.

tumorale infiltration af celler positive for CD3

+, CD8a

+, CD161 (NK-celle), eller CD163 (makrofag) (200 ×) blev noteret. Ingen ændringer blev noteret i CD4

+ T-celler (

data ikke vist

). ALT-803 alene øget tumorale CD8a

+ udtrykkende celler, hvorimod ALT-803 plus BCG øget tumoral udtryk for NK-celler (se tabel S1).

Indsæt

, venstre panel positiv kontrol fra rotte milt og højre panel negativ kontrol fra rotte milt uden primære antistof.

PBMC i fuldblod fra rotter behandlet på denne protokol blev indsamlet umiddelbart efter blev dyrene aflivet og underkastet flowcytometrianalyse for tilstedeværelsen af ​​CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-celler, NKG2D-positive celler og makrofager. Ingen nævneværdige ændringer blev noteret for CD3

+ og CD4

+ T-celler, mens CD8a

+ T-celler blev noteret for at være signifikant forhøjede kun i BCG alene gruppen. Alle grupper (BCG alene, ALT-803 alene og ALT-803 plus BCG) viste en signifikant stigning i NKG2D-positive celler sammenlignet med kontrol. Endelig blev antallet af cirkulerende makrofager væsentligt reduceret i ALT-803 alene og ALT-803 plus BCG, men ikke i BCG alene (fig. 4a). Lignende resultater blev opnået ud fra analysen af ​​rotte miltvæv. Konkret blev der ikke nævneværdige ændringer noterede sig med CD3

+, CD4

+ og CD8a

+ T-celler blandt behandlingsgrupperne. Imidlertid blev antallet af NKG2D-positive celler steg betydeligt i milten fra rotter i alle grupper (BCG, ALT-803 og ALT-803 plus BCG) sammenlignet med kontrol. Kombination af ALT-803 plus BCG ikke bemærke en stigning i antallet af NKG2D-positive celler sammenlignet med BCG alene eller ALT-803 alene. Endvidere blev antallet af makrofager i milten signifikant reduceret i ALT-803 alene, når det blev sammenlignet med PBS og BCG alene. Antallet af makrofager returneret til baseline, når ALT-803 blev sat til BCG (fig. 4b). Disse data giver overbevisende tegn på, at kombinationen af ​​ALT-803 plus BCG er forbundet med stimuleringen af ​​NKG2D-positive celler, hvilket sandsynligvis var effektorcellen mediering tumorregression under intravesikal kombination immunterapi.

A) Perifert blod mononukleære celler (PBMC) blev isoleret og analyseret ved flowcytometri til ekspression af CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-celler, NKG2D- positive (NK-celler) og F480 ekspressionsceller (makrofager). ALT-803 alene, samt, ALT- 803 plus BCG resulterede i en stigning i NKG2D-positive celler og et fald i makrofager sammenlignet med PBS. B) Splenocytter blev isoleret og analyseret ved flowcytometri til ekspression af CD3

+, CD4

+, CD8

+, NKG2D-positive og F480 ekspressionsceller. Svarende til PBMC resultater, ALT-803 alene, samt, ALT-803 plus BCG resulterede i en stigning i NKG2D- positive celler og et fald i makrofager sammenlignet med PBS. *,

s

0,05, **,

s

0,01, ***,

s

. 0,001

Intravesikal administration af ALT-803 plus BCG lettet enestående cytokinprofil

Sera fra rotter behandlet på denne protokol blev opsamlet og straks opbevaret ved -80 ° C. For cytokin-analysen blev serumprøver optøet og derefter underkastet analyse med rotte inflammatoriske cytokiner multi-analyt ELISArray assay. Sammen med proliferation og aktivering af NK-celler nævnt ovenfor blev det intravesikal administration af ALT-803 i kombination med BCG forbundet med forøgede serumniveauer af de inflammatoriske og immune response cytokiner, IL-1a og IL-1p med 52% og 52%, sammenlignet med den for PBS kontrolgruppen. Endvidere stigningen i IL-1α og IL-1β blev opretholdt, når ALT-803 plus BCG blev sammenlignet med BCG alene og ALT-803 alene (fig. 5a). Dernæst urin fra rotter behandlet på denne protokol blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C umiddelbart efter dyrene blev aflivet. Når den er klar til analyse, blev urinprøver optøet og underkastet rotten inflammatoriske cytokiner multi-analyt ELISArray assay. Endnu en gang blev cytokinerne, IL-1α, IL-1β og RANTES steg med 437%, 437% og 196%, henholdsvis i urinen af ​​ALT-803 plus BCG behandlede rotter sammenlignet med PBS-kontrol gruppen.