PLoS ONE: Curcumin Undertrykker Crosstalk mellem Colon Cancer Stamceller og Stromal fibroblaster i Tumor mikromiljø: Potentiel rolle EMT

Abstrakt

Målsætning

Interaktion af stromale og tumorceller spiller en dynamisk rolle som initiativtager og styrke carcinogenese. I denne undersøgelse undersøgte vi krydstale mellem colorectal cancer (CRC) celler med stromale fibroblaster og de anti-cancer virkninger af curcumin og 5-fluorouracil (5-FU), især på cancer stamceller (CSC) overlevelse i en 3D-co -kultur model, der efterligner

in vivo

tumormikromiljøet.

Metoder

coloncarcinomaceller HCT116 og MRC-5-fibroblaster blev co-dyrket i et monolag eller høj densitet tumormikromiljøet model

in vitro

med /uden curcumin og /eller 5-FU.

Resultater

Monolagskulturer tumormikromiljøet co-kulturer understøttede intensiv krydstale mellem kræftceller og fibroblaster og forbedret op -forordning af metastatiske aktive adhæsionsmolekyler (β1-integrin, ICAM-1), transformerende vækstfaktor-β signalmolekyler (TGF-β3, p-Smad2), proliferation associerede proteiner (cyclin D1, Ki-67) og epithelial-til- mesenkymale overgang (EMT) faktor (vimentin) i HCT116 forhold til tumor mono-kulturer. High density tumormikromiljøet co-kulturer synergistisk forøget tumorfremmende faktorer (NF-KB, MMP-13), TGF-β3, begunstiget CSC overlevelse (karakteriseret ved opregulering af CD133, CD44, ALDH1) og EMT-faktorer (øget vimentin og Slug, nedsat E-cadherin) i HCT116 sammenlignet med høj massefylde HCT116 mono-kulturer. Interessant nok var dette synergistiske krydstale endnu mere udtalt i nærvær af 5-FU, men faldt dramatisk i nærvær af curcumin, inducere biokemiske ændringer mesenchymale-epithelial overgang (MET), hvorved sensibiliserende CSCS til 5-FU behandling.

Konklusion

Berigelse af CSCS, bemærkelsesværdige aktivering af tumorfremmende faktorer og EMT i høj tæthed co-kultur fremhæver, at krydstale i tumor mikromiljø spiller en væsentlig rolle i tumor udvikling og progression, og dette samspil synes at være medieret mindst til dels af TGF-β og EMT. Modulation af denne synergistiske krydstale ved curcumin kan være en potentiel behandling for CRC og undertrykke metastaser

Henvisning:. Buhrmann C, Kraehe P, Lueders C, Shayan P, Goel A, Shakibaei M (2014) Curcumin Undertrykker Krydstale mellem Colon Cancer stamceller og Stromal fibroblaster i Tumor mikromiljø: Potentiel rolle EMT. PLoS ONE 9 (9): e107514. doi: 10,1371 /journal.pone.0107514

Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: Juni 26, 2014, Accepteret: August 13, 2014; Udgivet: 19 September, 2014

Copyright: © 2014 Buhrmann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inkluderet i papiret

Finansiering:.. Forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform i verden og udgør store kliniske problemer på grund af sin høje metastaser og tilbagefald sats [1], [2]. Akkumulerende tyder på, at udviklingen og progressionen af ​​kolorektal cancer skyldes genetiske og epigenetiske forandringer, der er resultatet af komplekse vekselvirkninger transformerede celler med deres mikromiljø [1], [3]. Tumormikromiljøet betragtes som tumor bed, som består af residente komponenter, såsom stromaceller og de faktorer, der er stabile i miljø i stroma, og ikke-hjemmehørende komponenter såsom forskellige immun cellepopulationer, som påvirker tumorinvasion og metastase [4]. Den synergistiske virkning af mikromiljø på inflammatoriske responser og tumorprogression er nu anses for at være et vigtigt element i carcinogenese [1], og der er stigende interesse for identifikation af midler, som specifikt retter sig mod vejen samspil mellem tumor og stromale celler [5 ].

det er blevet foreslået, at CRC dannelse skyldes en lille sub-population af selvfornyende tumor stamceller beliggende inden for colon krypten [6], [7]. Faktisk CRC stamceller (CSC) udviser egenskaber svarende til fysiologiske stamceller og er ansvarlige for tumor progression [7], [8]. For nylig er det blevet foreslået, at CSCS er den unikke celletype i tumormikromiljøet at opretholde mikromiljø og forbedre cancermetastase og invasion [4], [9]. Endvidere har det vist sig, at CSC direkte eller indirekte kan interagere med flere immuncellepopulationer i tumormikromiljøet, som menes at markant indflydelse tumorprogression [4].

identifikation af midler, der er i stand til at undertrykke krydstale mellem cancer og stromale celler i tumoren mikromiljø kan være et vigtigt terapeutisk mål for at undertrykke metastatiske potentiale CSCS. For at udvikle nye behandlingsmetoder strategier for CRC, er det derfor vigtigt at studere nærmere samspillet mellem CSCS med

bosiddende

og

ikke-hjemmehørende

komponenter i deres mikromiljø at belyse den detaljerede mekanismer, som CRC udvikling og progression kontrolleres.

som en stor del af CRC’er er relateret til miljømæssige faktorer [1], nutraceuticals tilbyde sig selv som ideelle kandidater til at modulere tumor mikromiljø og dermed understøtter kemoterapi. Faktisk er det vigtigt som mere end 15% af patienter udvikler resistens over for konventionelle /strøm kemoterapi med 5-fluoruracil (5-FU) og mere end 50% af patienterne udvikler tilbagefald [10]. Vi og andre har tidligere vist, at nutraceuticals, såsom curcumin, kan direkte påvirke CRC stamceller ved at øge deres kemosensitivitet til kemoterapeutisk behandling, således markant stigende positiv terapeutisk resultat [11] – [13]. Afledt fra jordstængler af planten

gurkemeje longa

, curcumin (diferuloylmethane) er et naturligt forekommende gul polyfenol som formidler dens virkninger ved modulation af flere vigtige molekylære mål, herunder transkriptionsfaktorer (NF-KB, AP-1, β catenin), enzymer (fx Cox-2, MMP’er), pro-inflammatoriske cytokiner (f.eks TNF-a, IL-1 og IL-6) og celleoverflade adhæsionsmolekyler (f.eks cadheriner, Integriner) [14] – [ ,,,0],16]. Modulering af matrixmetalloproteinase (MMP) ekspression i tumoren (mikro) -Miljø er vigtigt, da MMP’er er kendte markører for CRC progression [17] – [19]. Tumormetastase og invasion er endvidere påvirket af tumorceller interaktion med epitel- og endotelceller. Adhæsions- og signalmolekyler, såsom integriner spiller en vigtig rolle under CRC progression og metastase [20], [21]. Yderligere intracellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) er blevet vist, at forbedre tumorcelleproliferation og invasion og er blevet identificeret som ansvarlige for endothelial adhæsion af cancerceller, hvilket således kraftigt påvirke metastatisk potentiale [22], [23]. Tumormikromiljøet endvidere inducerer NF-KB-aktivering som er kendt for at regulere adskillige gener involveret i tumor initiering, promotion, og metastase [24], [25], og inducere Wnt aktivitet, som spiller en kritisk rolle i biologi CRC stamceller [ ,,,0],26].

transformerende vækstfaktor-β (TGF-β) er et multifunktionelt polypeptid, der spiller en væsentlig rolle i differentiering, proliferation og fosterudvikling i normale væv. Vævsceller syntetisere og secernere TGF-β i mikromiljøet hvor det binder til specifikke TGF-p-receptorer for parakrin og autokrin signalering. Denne ligand og receptor kompleks stimulerer intracellulære signalering kaskader, der omfatter den kanoniske Smad2 signalvejen [27], som danner komplekser med Smad4 og akkumuleres og translokerer ind i kernen. I kernen, aktiverede Smad komplekser regulerer transkriptionen af ​​specifikke gener og i sidste ende regulerer cellecyklus og vævsreparation [27]. Det er kendt, at TGF-β er en tumorsuppressor i normale vævsceller og i tidlige stadier af tumorprogression. I tumorceller den vækstinhiberende virkning af TGF-β-signalering er fejlreguleret og den skifter fra tumor suppressor til tumor fremmende faktor i forskellige organer [27], [28]. Endvidere er det blevet rapporteret, at stimulering af TGF-β på stromaceller forårsager sekretion af IL-11 og øger evnen til metastase af CRC-celler, hvorimod dyr behandlet med en specifik inhibitor af TGF-β-receptor 1 er modstandsdygtige over for metastasedannelse [ ,,,0],29]. Interessant nok er det blevet rapporteret, at sekretion af cytokiner og vækstfaktorer ved stromale celler i en tumor mikromiljø udløser en epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), som understøtter medikamentresistens, tumor tilbagefald, invasion og metastase af neoplastiske celler [30]. Endvidere E-cadherin ekspression nedreguleres under EMT og dette kan blokeres med zinkfinger transskriptionelle suppressorer, såsom Slug og denne proces er reversibel [31] – [34].

Karakterisering af molekylære mekanismer involveret i tumoren fremme rolle af TGF-β-signalering og EMT i en tumor mikromiljø mellem fibroblaster og tumorceller kan bidrage til at udvikle terapeutiske strategier mod tumorudvikling såsom CRC. Derfor er formålet med den præsenterede studiet var at undersøge mere detaljeret interaktionen af ​​CRC-celler med stromale fibroblaster, aktivering af kræft-fremme inflammation proteiner, parakrine mediatorer og modulerende virkninger af curcumin og 5-FU, især på CRC stamceller og EMT i en

in vitro

cancer mikromiljø co-kultur, som simulerer de

in vivo

tumor mikromiljø.

Materialer og metoder

Antistoffer

monoklonalt anti-ALDH1 blev opnået fra Acris Antistoffer GmbH (Herold, Tyskland). Monoklonalt anti-CD133 og anti-CD44 blev indkøbt fra Abcam PLC (Cambridge, UK). Anti-β-actin, anti-cyclin-D1, anti-ICAM-1, anti-vimentin, anti-E-cadherin, anti-Slug, anti-TGF-β3, anti-TGF-β3R og anti-p-Smad2 var opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-MMP-1, anti-MMP-9 og anti-MMP-13 blev indkøbt fra R HVIS: immunofluorescens; Forstørrelse 400 ×; bar = 30 nm.

Curcumin og /eller 5-FU påvirker kraftigt celle integritet i høj tæthed tumormikromiljøet co-kulturer Salg

Dernæst vi evaluerede høj densitet tumormikromiljøet co-kulturer , HCT116 i høj densitet samdyrket med MRC-5 i monolag, der efterligner

in vivo

situationen at undersøge indflydelsen fra parakrine terapeutiske midler på krydstale mellem cellerne og på tumorcelleproliferation, tumorfremmende faktorer, invasion og dannelsen af ​​tumor kugler, en fremtrædende del af cancer stamceller. Faktisk er det blevet rapporteret, at normale fibroblastceller er i stand til at inducere differentiering af tumorceller, såsom af en human coloncarcinom-cellelinie [38], [39]. Virkningerne af 5-FU og /eller curcumin på cellulær integritet og colonosphere dannelse i tumormikromiljøet kulturer blev evalueret i HCT116-celler efter 10 dage. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af curcumin eller 5-FU (0, 0,1, 1, 5 og 10 uM) og colonosphere dannelse blev evalueret ved lysmikroskopi som beskrevet i Materialer og Metoder. Den individuelle IC

50 af curcumin eller 5-FU var ca. 5 uM eller 3.5μM (p 0,05). For at evaluere effekten af ​​kombineret behandling blev HCT116-celler forbehandlet med 5 uM curcumin i 4 timer og derefter co-behandlet med forskellige koncentrationer af 5-FU (0, 0,1, 1, 5 og 10 uM) i 10 dage. Interessant forbehandling med curcumin reducerede IC

50 værdier for 5-FU til 0,1 uM i HCT116 (p 0,05) (fig 2A.). Dette antyder, at curcumin sensibiliserer HCT116 celler til 5-FU. Endvidere Toluidinblåtfarvning i kontrolkulturer viste, at celler, der er dannet veludviklet sfæroide kolonier under dyrkningsperioden (Fig 2B: a.). Behandling af HCT116 kulturer med 5-FU (5 uM) eller curcumin (5 uM) alene eller med curcumin og 5-FU (5 uM /0,1 uM) blev vist at være yderst effektiv til inhibering colonosphere dannelse og øge opløsningen af ​​høj densitet tumor sfærer sammenlignet med de tilsvarende kontroller (fig 2B: a.). Denne virkning var højere i med curcumin eller curcumin /5-FU behandlede co-kulturer (Fig 2B: a.). Dernæst undersøgte vi den cellulære optagelse af curcumin ved HCT116 i tumormikromiljøet co-kulturer med fluorescerende mikroskopi. Resultaterne viste klart, at curcumin blev taget op af alle HCT116 celler i curcumin behandlet microenvironment co-kulturer (Fig 2B: b.). For at undersøge, hvorvidt monolag MRC-5-celler i mikromiljøet co-kulturer overlever behandling med 5-FU, curcumin eller /og 5-FU, vi farves cellerne med toluidinblåt. Som vist i fig. 2C: a, MRC-5 celler er godt farves som er et tegn på vitalitet. Endvidere curcumin blev taget op af alle MRC-5-celler i curcumin behandlet tumormikromiljøet co-kulturer (Fig 2C: b.).

A: Kvantificering af antallet af colonosheres blev opnået ved at tælle antallet af sfæroide kolonier fra 10 mikroskopiske felter i høj tæthed microenvironment co-kulturer. Kulturer blev enten efterladt ubehandlede (Co) eller blev behandlet med 5-FU (0,1, 1, 5 eller 10 pM), curcumin (0,1, 1, 5 eller 10 uM) eller blev forbehandlet med curcumin (5 uM) i 4 timer, og derefter udsat til 5-FU (0,1, 1, 5 eller 10 uM) i 10 dage og bedømt ved lysmikroskopi. Værdier blev sammenlignet med kontrolgruppen og statistisk signifikante værdier med

s

0,05 blev betegnet med en stjerne (*) og

s

0,01 blev udpeget af en stjerne (**). Toluidinblåtfarvning profil (2B /C, a) og cellulær curcumin optagelse (2B /C, b), HCT116 (B) i høj densitet og i MRC-5 (C) i monolag co-kultur. Tumormikromiljøet co-kulturer blev enten efterladt ubehandlede (Co) eller blev behandlet med 5-FU (5 uM) (5-FU), curcumin (5 uM) (nuværende) eller blev forbehandlet med curcumin (5 uM) i 4 timer, og derefter udsat til 5-FU (0,1 uM) (Cur + 5-FU) i 10 dage og vurderet under et lys eller fluorescerende mikroskop. Billeder viste er repræsentative for tre uafhængige forsøg. F = Filter. (*) = HCT116 colonosheres. Forstørrelse 4B, 4ca: 200x, 4CB: 400x; bar = 30 nm.

Colon CSCS i CRC cellepopulationer er målrettet i high density tumormikromiljøet co-kulturer med 5-FU, curcumin og den kombinerede behandling

Det er blevet rapporteret at tumormikromiljøet spiller en vigtig rolle i fastholdelsen af ​​den CSCS fremme i påvirket af stroma, inflammatoriske celler, cytokiner og vækstfaktorer udskilles af stromale fibroblaster [26], [40]. Derfor undersøgte vi adfærd CSCS i CRC cellepopulationen, blev høj densitet mono-kulturer af HCT116 celler efterladt ubehandlet. Tumormikromiljøet co-kulturer af HCT116 /MRC-5-celler var enten ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (5 uM) eller forbehandlet med curcumin (5 uM) i 4 timer og derefter udsat for 5-FU (0,1 uM) i 10 dage. Kulturerne blev underkastet immunofluorescens mærkning med primære antistoffer for CSC markør (CD133). Svag ekspression af CD133 blev påvist i basale kontrol mono-kulturer (Fig. 3A). Interessant nok i modsætning hertil CD133-positive celler fra HCT116 celler i microenvironment co-kulturer var højere sammenlignet med den i kontrol mono-kultur (fig. 3A), hvilket indikerer den vigtige synergistisk rolle krydstale mellem HCT116 og MRC-5-celler i at støtte tumorpromotion. Endvidere viste CD133-positive celler fra HCT116 cellelinien population signifikant forøget overlevelse efter behandling med 5-FU sammenlignet med curcumin eller /og 5-FU (fig. 3A). I nærvær af curcumin eller /og 5-FU, udviste de markant nedregulering af CD133-positive celler (fig. 3A og 3B), hvilket viser den prominente kemosensibiliserende virkning curcumin på CSCS. Ved kvantificering, bekræftede vi, at antallet af CD133-mærkede celler steg i HCT116 mikromiljø co-kulturer sammenlignet med kontrol tumor mono-kultur (fig. 3A), og CD133-positive celler steg i overlevende cellepopulation ved behandling med 5-FU , men ikke med curcumin eller kombineret behandling (fig 3B.)

A:. High density mono-kulturer af HCT116 celler blev efterladt ubehandlet (A, Co.HD-mono-kultur), high density tumor mikromiljø samdyrkning af HCT116 /MRC-5-celler var enten ubehandlede (A, Co.Microenv-HD-Co-kultur), eller behandlet med 5-FU (5 uM) (A, 5-FU-Microenv-HD-CO- kultur), curcumin (5 uM) (A, Cur-Microenv-HD-Co-kultur) eller forbehandlet med curcumin (5 uM) i 4 timer, og derefter udsat for 5-FU (0,1 uM) (A, Cur + 5FU -Microenv-HD-Co-kultur) i 10 dage. Immunmærkning blev udført med primære antistoffer for colon CSC markør (CD133) efterfulgt af inkubation med rhodamin-koblede sekundære antistoffer og kontrastfarvning med DAPI at visualisere cellekerner. Billeder viste er repræsentative for tre forskellige eksperimenter. Forstørrelse 400 ×. bar 30 nm. B: For at kvantificere mængden af ​​CD133-positive celler i høje densitet kulturer beskrevet ovenfor, blev 100 celler fra 15 mikroskopiske felter talt. Undersøgelsen blev udført tredobbelt, og resultaterne er angivet som middelværdier med S.D. fra tre uafhængige forsøg. Værdier blev sammenlignet med kontrolgruppen og statistisk signifikante værdier med

s

0,05 blev betegnet med en stjerne (*) og

s.

0,01 blev udpeget af en stjerne (**)

Curcumin har potent chemosensitization effekt på tyktarmskræft stamceller i CRC cellepopulationer i høj tæthed tumormikromiljøet co-kulturer

Dernæst CSC markører (CD133, CD44 og ALDH1) udtryk blev undersøgt for kapacitet tumordannelse og chemosensitization effekt af curcumin på CSC markører i HCT116 3D high density tumormikromiljøet co-kulturer. De co-kulturer blev enten efterladt ubehandlet, behandlet med curcumin (5 uM), 5-FU (1, 5, og 10 uM) alene eller blev forbehandlet i 4 timer med curcumin (5 uM) efterfulgt af behandling med 5-FU (0,1, 1 , 2, 3 uM) i 10 dage (fig. 4). Derudover er der i et andet sæt eksperimenter blev HCT116 celler inkuberet i høj densitet mono-kulturer, uden fibroblaster som basal kontrol. Kontrol- høj densitet mono-kulturer af HCT116 viste basal ekspression af CSC markører (Fig 4:. A, b, c). I modsætning hertil viste immunoblotting analyse af hele cellelysater markeret opregulering af CD133, CD44 og ALDH1 i HCT116 i kontrol og i 5-FU-behandlede høj densitet tumormikromiljøet co-kulturer i en koncentrationsafhængig måde (fig. 4 : a, b, c). Men interessant forbehandling med curcumin efterfulgt af behandling med 5-FU signifikant nedreguleret CSC markør ekspression i en koncentrationsafhængig måde på HCT116 celler i høj tæthed tumor co-kulturer (Fig 4:. A, b, c). Densitometrisk analyse af typiske western blot eksperimenter viser nedregulering af CSC markører i HCT116-celler i kulturer behandlet med enten 5-FU, curcumin eller /og 5-FU curcumin (Fig 4:. A, b, c). Taget sammen indikerer disse resultater, at den parakrin interaktion mellem tumor og stromaceller er afgørende for at fremme CSCS og at der er en stærk kemosensibiliserende effekt af curcumin på colon CSC i høj tæthed tumormikromiljøet co-kulturer.

HCT116 høj densitet mono-kulturer blev enten ubehandlet (HCT, Co.) eller blev co-dyrket med MRC-5 i tumor mikromiljø. Tumormikromiljøet co-kulturer blev enten efterladt ubehandlede (Co.), behandlet med curcumin alene (5 uM), 5-FU alene (1, 5, og 10 uM) eller blev forbehandlet i 4 timer med curcumin (5 uM) efterfulgt af behandling med 5 -FU (0,1, 1, 2, 3 uM). Efter 10 dages dyrkning blev de samlede cellelysater af HCT116 høj densitet kulturer fremstillet og analyseret ved western blotting og kvantitativ densitometri for CSC markør ALDH1 (a), CD133 (b) og CD44 (c). Densitometrisk evaluering af proteinekspression som afsløret ved western blot-analyse blev udført tre gange. Rengøring protein β-actin tjente som en belastning kontrol i alle eksperimenter. Værdier blev sammenlignet med kontrolgruppen og statistisk signifikante værdier med

s

0,05. Væsentlige værdier er markeret med (*).

Curcumin og /eller 5-FU blande sig i synergistisk krydstale mellem CRC- /CSC-celler og fibroblaster i high-density tumormikromiljøet co-kulturer

for at undersøge interaktionen mellem CRC- /CSC-celler og fibroblaster og at vurdere effekten af ​​curcumin og /eller 5-FU på denne synergistiske crosstalk på tumorcelleproliferation, invasion og tumorfremmende faktorer (MMP, NF -κB) ekspression i flere detaljer, udførte vi western blotting analyse af høj densitet tumormikromiljøet co-kulturer.