PLoS ONE: Hæmning af Hedgehog-Meldefunktioner Driven gener i prostata cancer celler ved Sutherlandia frutescens Extract

Abstrakt

Sutherlandia frutescens

(L) R. Br. (Sutherlandia) er en sydafrikansk botanisk, der traditionelt anvendes til behandling af en række helbredsmæssige forhold, infektioner og sygdomme, herunder kræft. Vi hypotese Sutherlandia kunne handle gennem Gli /Hedgehog (Hh) -signaling i prostatacancerceller og brugte RNA-Seq transskription profilering for at profilere genekspression i TRAMPC2 murine prostatacancerceller med eller uden Sutherlandia ekstrakter. Vi fandt 50% af HH-responsive gener kan undertrykt af Sutherlandia ethanolekstrakt, herunder de kanoniske Hh-responsive gener

Gli1

Ptch1

samt nyligt adskiller Hh-responsive gener

Hsd11b1

Penk

Henvisning:. Lu Y, Starkey N, Lei W, Li J, Cheng J, Folk WR, et al. (2015) Hæmning af Hedgehog-Meldefunktioner Driven gener i prostata cancer celler af

Sutherlandia frutescens

Uddrag. PLoS ONE 10 (12): e0145507. doi: 10,1371 /journal.pone.0145507

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

Modtaget: 9 oktober, 2015; Accepteret: December 4, 2015; Udgivet: December 28, 2015

Copyright: © 2015 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Datasættet er lagret i NCBI-GEO, tiltrædelsen nummer er GSE75760

Finansiering:. Denne publikation eller projekt blev muliggjort delvist af Grant nummer P50AT006273 fra National center for komplementær og Integrativ Health (NCCIH), Office of Dietary Kosttilskud (ODS), og National Cancer Institute (NCI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mere end 200.000 nye tilfælde af prostatakræft (PCA) er diagnosticeret, og næsten 30.000 mænd dør af denne sygdom hvert år i USA [1]. Prostatatumorer, behandles traditionelt med hormonale antagonister, androgen ablation og /eller kemoterapi. Imidlertid fornyet prostatatumorer er hyppig og erhvervet resistens over for traditionelle behandlinger er vanskelig at kontrollere. Nye tilgange, der effektivt kan målrette og blokere signalveje, der fører til en gentagelse, er der behov for lægemiddelresistens og kræft progression [2-4].

unormalt aktiverede Hedgehog (Hh) signalvejen fører til avancerede PCa og metastase, og er også vigtig for andre kræftformer, såsom medulloblastom, basalcellekræft, småcellet lungekræft, tarmkræft og bugspytkirtelkræft [2,3,5-7]. Blokering af aktiverede Hh-signalering pathway i en prostata cancer xenograft model fuldstændigt undertrykt vækst af den aggressive PCa tumoren. Inhibering af Hh-signalering pathway i andre cancere har vist sig at være et effektivt middel til behandling af kræft. Vismodegib, en Hh-signalering inhibitor, er for nylig blevet godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) for basalcellekræft behandling [3,8-10].

Patched (ptch) og Smoothened (SMO) er to vigtige membranproteiner i Hh-signalering pathway. Ptch undertrykker Smo aktivitet, når den ikke er bundet af sin ligand Hh. Når Hh ligand binder til ptch, er hæmningen frigivet og Smo aktiveres. Aktiveret Smo fører til en signaleringskaskade hvis nedstrøms virkninger omfatter translokationen og aktivering af Gli familien af ​​transkriptionsfaktorer og transskriptionen af ​​pathway målgener, såsom

gli1

ptch1

.

Blokering Hh-signalering anvende planten sekundær metabolit cyclopamin (eller RNA-interferens af Gli) undertrykker proliferation af adskillige humane prostatacancercellelinjer [11]; dog cyclopamin s kraftig inhiberende virkning er ikke terapeutisk gunstig, på grund af sin hurtige clearance, uspecifik toksicitet og ustabilitet samt ikke-tilsigtede virkninger ved høje koncentrationer [3,12]. Derfor identificerer nye inhibitorer af Hh vej kaldes for at hæmme prostatakræft proliferation og tumorigenese.

Sutherlandia frucescens

(

S

.

frucescens

eller Sutherlandia) er en medicinsk plante Sydafrika, at der er almindeligt kendt som “kræft bush” på grund af dens anvendelse i cancerbehandling [13-15]. Ekstrakter af Sutherlandia har vist anti-spredning og apoptotisk effekt i brystkræftceller, livmoderhalskræft celler og ovarieceller fra kinesiske hamstre [16-19]. Men er ikke blevet identificeret mål og mekanismer for disse effekter. Tidligere undersøgelser i vores laboratorium afslørede adskillige botaniske forbindelser, der potentielt forebygge prostatakræft via Hh-signalering pathway inhibering [20,21], og vi antager, at den anti-cancer virkning Sutherlandia skyldes hæmningen af ​​Hh-signalvejen. Brug af næste generation sekventering, vi undersøgte de Hh-signalering nedstrøms genekspression ændringer, samt Sutherlandia ekstrakt responsive gener i murine prostatacancercellelinie TRAMPC2. Da Sutherlandia ekstrakt blev påført TRAMPC2 celler med aktiveret Hh-signalering, observerede vi undertrykkelse af et stort antal Hh-signalering målgener, hvilket indikerer

S

.

frutescens

indeholder stærke anti-Hh signalering forbindelse (r). Derfor

S

.

frutescens

måske et potentielt nyttigt supplerende behandling for avanceret PCa og andre Hh-signalering drevne kræftformer.

Materialer og metoder

Udarbejdelse af ethanol ekstrakt af

S

.

frutescens

Ground

S

.

frutescens

pulver blev købt fra Big Tree Nutraceutical (Fish Hoek, Sydafrika) og karakteriseret som tidligere beskrevet [22]. Til fremstilling af ethanol ekstrakt af

S

.

frutescens

, 10 g jord

S

.

frutescens

blad blev blandet med 250 ml 95% ethanol natten over. Supernatanten blev derefter høstet, centrifugeret, steriliseret og opbevaret ved -80 ° C. Før brug,

S

.

frutescens

ethanolekstrakt [23] blev tørret ned ved hjælp speed-vakuum, og resuspenderes i en tyvendedel volumen af ​​DMSO med en endelig ekstrakt koncentration på 84 mg /ml.

Cell kultur og reagenser

mus TRAMPC2 prostatacancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i komplet RPMI 1640 medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS), insulin, og DHT.

Hh peptid Konditioneret medium (Hh-CM) blev genereret fra HEK293 cellelinie overudtrykker Shh-N-terminale peptid (HEK293-ShhN, en slags gave fra Dr. Phillip Beachy, Stanford University) [24]. HEK293-ShhN celler blev dyrket til 80-90% konfluens i DMEM medium indeholdende 10% FBS, 1% Pen /Strep og 40 mg /ml G418. Mediet blev derefter erstattet med DMEM indeholdende 2% FBS, 1% Pen /Strep. Efter 24-30 timer blev Hh-konditionerede medium opsamlet og filtreret gennem 0,22 um filtre og opbevaret ved -80 ° C.

Reverse Transcription and real time PCR

Samlet RNA blev isoleret og oprenset fra TRAMPC2 celler under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen). 1000 ng af total RNA blev anvendt til at skabe cDNA-biblioteker under anvendelse af Superscript III bagside Transciptase (Invitrogen) med tilfældige primere og oligodT. Real time PCR blev præfabrikerede hjælp SYBR Green qPCR (iQ Supermix, BioRad) på ABI7500 system. qPCR tilstand: 95 grader, 30 sekunder; 60 grader, 40 sekunder; 72 grader, 40 sekunder. Primersekvenser er angivet i S4 tabel. Hver qPCR assay blev gentaget 3 gange på to biologiske replikater. T-test blev udført på Hh-CM vs. kontrol og Hh-CM + SFE vs. Hh-CM sammenligninger, p-værdi cut-off er 0,05.

RNA-Seq, differentielt udtrykte gener, og Bioinformatik Analysis

TRAMPC2 celler blev behandlet med 8ug /ml og 80ug /ml SFE med eller uden Hh-CM i 24 timer, med hvert eksperiment gentaget to gange. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen) og RNA-koncentrationen blev kvantificeret. Kvaliteten af ​​total RNA blev analyseret ved anvendelse Bioanalyzer (RIN score 7,0). 2500ng totalt RNA fra hver af de to biologiske replikater af hvert forsøg blev anvendt til at generere sekventering biblioteker under anvendelse TruSeq Stranded mRNA Sample Forberedelse af posen (Illumina, CA). 50bp lange single-end dyb sekventering blev udført ved University of Missouri-DNA Core hjælp Illumina HiSeq 2000-system. De rå sekventering filer samt metadata, forelægges NCBI GEO. GEO tiltrædelse nummer: GSE75760. FASTX-Toolkit blev brugt til at fjerne adapteren sekvenser, trim og filtrere lav kvalitet basis opkald og lav kvalitet læser (https://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/). Filtreret kort sekventering læser blev kortlagt til det murine genom (UCSC MM9) ved hjælp TopHat2 og genekspression værdier blev kvantificeret ved hjælp Subreads pakke FeatureCounts funktion [25-27]. Genekspression værdier blev yderligere anvendt til at beregne for biblioteksstørrelse og datasæt dispersion til differentielt udtrykt gen analyse [28,29]. Kort fortalt råsekvens læser af hvert gen blev normaliseret til biblioteket størrelse af hver prøve og blev omdannet til kimtallet pr million (cpm). Gene differentiel ekspression blev testet under anvendelse R /BioConductor pakke edger [30]. Differentielt udtrykte gener bestemmes af Log

2 Fold Change (Log

2fc) og False Discovery Rate. (FDR, Log

2fc ≥1 eller ≤-1, FDR≤0.05)

gensæt funktionelle og pathway-analyse blev analyseret ved anvendelse Gene Ontology (GO) og Kegg pathway. De gen-id’er af interesse blev konverteret til EntrezID og indlæst til DAVID bioinformatiske værktøjer [31]. GO analyse og Kegg pathway-analyse blev derefter udført ved at sætte alle GO vilkår og Kegg pathway gener som baggrundsbilleder gener. Overrepræsenteret GO vilkår eller veje er bestemt af berigelse score (EASE≤0.1, gen count≥2).

Resultater

Sutherlandia ændret genekspression

Sutherlandia ethanol ekstrakt ( “LSU “) anvendes på celler på 8ug /ml resulterede ikke i nogen differentielt udtrykte gen, mødte vores statistiske cutoff (data ikke vist). Men anvendelse af 80ug /ml SFE ændret mRNA ekspressionen af ​​204 gener, med 66 gener nedreguleret, og 138 gener up-reguleret (Fig 1A, S1 tabel). Gene Ontology (GO) analyse og Kegg pathway analyse af disse ændrede gener pegede på mulige mål af SFE. Den opregulering af

IL6

,

IL15

,

IL18BP

,

CXCL9

,

CXCL10

,

cxcl13

og

TLR3

foreslå mål for at være immune og inflammatoriske relateret (fig 1B) og sti analyse understregede NF-KB-signalvejen og JAK-STAT signalvej:

IL6

og

CXCL10

være transkriptionelle mål for NF-KB og cytokiner

Ifnb1

,

IL6

,

IL15

sammen med cytokiner receptor

Il12rb1

,

Il15ra

være neden for JAK-STAT signalering (fig 1C og 1D).

(A) differentielt udtrykte gener i respons på Sutherlandia ekstrakt behandling. Gener der er relateret til (B, C, D) er mærket. (B) Gene Ontology analyse af Sutherlandia responsive gener. (C, D) Kegg pathway analyse af Sutherlandia responsive gener.

Sutherlandia undertrykker Hedgehog-signalvejen

Hh ligand-beriget konditioneret medium (Hh-CM) behandling af TRAMPC2 celler til 24 timer førte til 110 differentielt udtrykte gener, med 80 gener opreguleres og 30 gener nedreguleret (S2 Table). Klassiske Hh-signalering målgener

gli1

ptch1

var opreguleret (figur 2; S1 Fig), og indikerer, at TRAMPC2 celler er Hh-responsive

TRAMPC2 celle. blev behandlet med enten Hh-CM eller co-behandlet med Hh-CM og 80 pg /ml SFE. Over 50% af Hh-responsive gener blev undertrykt af SFE behandling. Genekspression værdier blev repræsenteret af log2 forvandlet normaliseret RNA-seq læser (log2 tælle-per-million-læser) og farvekodet.

Co-behandling af SFE undertrykt 42 Hh-CM up-regulerede gener og stimuleret 10 Hh-CM nedreguleret gener (figur 2). HH-signalering ændrede gener, der kan undertrykt af SFE omfatter de klassiske Hh-signalering målgener

gli1

ptch1

, samt nyligt adskiller gener

hsd11b1

Penk Hotel (figur 3; S1 fig). Yderligere differentielt udtrykte gener var immune og inflammatoriske relaterede, herunder

IL6

,

IL15

,

CXCL9

,

CXCL10

,

CXCL11

,

ccl12

,

cxcl13

,

TLR3

,

tlr12

,

ifnb1

og

il12rb1

(S3 tabel).

Kvantitativ PCR for (A)

gli1

, (B)

ptch1

, og (C)

hsd11b1

blev udført på Hh ligand behandlet og Hedgehog ligand og SFE co-behandlede TRAMPC2 celler. Transkripter koncentrationer blev normaliseret til kontrol. * Angiver p 0,05. I den nederste figur, afskrifter koncentrationer af (A)

gli1

, (B)

ptch1

, og (C)

hsd11b1

repræsenteres af kvantificerede sekventering læser i form af tællinger-per-million-læser.

diskussion

Sutherlandia, også kendt som kræft busk, er en fremtrædende og udbredte urtemedicin i Sydafrika [32]. Dens mål og virkningsmekanismer mod kræftceller er stort set ukendt. I undersøgelser relateret til dette, har vi observeret Sutherlandia ekstrakt at være væksthæmmende i flere PCA cellelinjer og fandt administrationen af ​​Sutherlandia at tramp mus reducerer forekomsten af ​​dårligt differentieret karcinom [21].

Med den hypotese, at celleproliferation inhibering af SFE skyldes dens potentiale Hh-signalering pathway inhibering identificerede vi en gruppe af Hh-signalering responsive gener i TRAMPC2 celler, og fandt SFE var i stand til at undertrykke 50% af dem. Dette tyder på SFE har stærke Hh-signalering hæmmende effekt.

Interessant, fosterets binyrerne efter moderens indtagelse af

Veratrum californicum

, som indeholder Hh-signalering inhibitor cyclopamin, syntetiseret meget mindre cortisol, cortison og corticosteron end moderens binyrer, hvilket indikerer binyrebarkhormon biosyntese er også stærkt relateret til Hh-signalering aktivitet [33]. HH-ændrede gener fundet i TRAMPC2 celler såvel som Hh-ændrede gener i embryoniske fibroblastceller og prostataceller, omfattede cortisol-cortison konvertering enzym-kodende gen hydroxysteroiddehydrogenase 11 Beta 1 (

hsd11b1

).

Hsd11b1

svarede på Hh-signalering aktivering, mens Sutherlandia ekstrakt behandling, eller Smo inhibitor behandling, kan repressere Hh-signalvejen effekt på dette gen [34]. Vi konkluderer, at

hsd11b1

er en Hh-signalering lydhør gen, og vi foreslår, at nedsat cortisol og kortison koncentrationer i binyre af Cyclops fosteret kan skyldes

Veratrum californicum

græsning af mor får forbrugende Cyclopamin og hæmme Hh-signalvejen.

Hsd11b1

er til stede i PC3 og LNCaP humane prostata kræftceller, og HSD11B1 s 11-dehydrogenase aktivitet bevares, mens den 11-reduktase aktivitet er ikke [ ,,,0],35,36], hvilket indikerer HSD11B1 er vigtig for opretholdelse af koncentrationen af ​​glukokortikoid i prostata og prostatacancerceller. Dette resultat vedrører kraftigt prostata cortisol /cortison koncentration til Hh-signalvejen, tyder på, at cortisol /cortison koncentration ændring måske en vigtig faktor for prostatakræft udvikling, og at anti-Hh behandling kan vende disse skadelige ændringer.

En anden ny Hh-signalering responsiv gen vi fundet er Proenkephalin (

Penk

), et hormon ligand for opioid vækstfaktorreceptor (Ogfr) og en negativ regulator af celleproliferation og væv organisation. Når Penk syntetiseres og binder til nuklear beliggende Ogfr, er en intracellulær signalvej nedstrøms for Ogfr initieret og til sidst forårsager cellen til at indtaste G0 fase. Penk er en prostata stroma markør og genekspression analyse viste, at Penk koncentrationen er lavere i prostatacancer end ved normal prostata [37]. Det er overraskende at opdage, at Penk udtrykkes i TRAMPC2, mens DU145 er

Penk

null fra et andet genekspressionsprofilen fra vores laboratorium, indikator- TRAMPC2 celler har stromale funktioner, potentielt fra epithelial Mesenchymale Transition (EMT). Mere overraskende fandt vi

Penk

er Hh-responsive gen og Sutherlandia ekstrakt behandling falder enten basale niveau eller Hh-stimuleret Penk udskrift koncentration.

Selvom Sutherlandia ethanol ekstrakt viste undertrykkelse af et stort antal af Hh-respons gener, mener vi ikke, at SFE indeholder Smo inhibitor (er) ligesom cyclopamin, GDC0449 eller DY131, ellers ville det fortrænge alle HH responsive gener. Vi foreslår SFE indeholde en eller flere aktive bestanddele, der ændrer aktiviteten af ​​nedstrøms Hh-signalvej, som interagerer med andre signalveje, eller alternativt de fungerer på niveauet for Gli transkriptionsfaktor niveau i en promotor specifik måde.

Foruden opdagelsen af ​​Hh-signalering hæmning effekt, vi også fundet gener, der opreguleres af Sutherlandia behandling med eller uden Hh-signalering aktivering. GO-analyse viste, at hovedparten af ​​disse gener er immunrespons relateret, herunder CFB, CFH, Gbp2, Gbp4, GBP5, GBP10, CXCL9, CXCL10, CXCL11 Cxcl13, IL6, IL18BP, Oasl1, Rsad2, SP110, Tgtp1, Tgtp2, TLR3 , Tnfsf10 og Vnn1 (S1 og S3 tabellerne). Mens de fleste af de up-regulerede gener viser sig at være Hh-signalering uafhængig, afsløret af folden ændring lighed med eller uden Hh behandling, finder vi 5 gener, Agap2, Aw112010, Gda, CXCL11 og Npsr1, der stimuleres meget mere som reaktion på Sutherlandia når Hh-signalering er aktiveret, hvilket indikerer, at Hh-signalering letter disse gener reaktion på Sutherlandia.

sammenfattende vores genekspression undersøgelse af Hh-signalering responsive gener og Sutherlandia responsive gener i mus prostata cancer TRAMPC2 celler viste Sutherlandia ekstrakt har stærke Hh-signalering hæmning effekter som bedømt af antallet og procentdelen af ​​Hh responsive gener, der kan undertrykkes af Sutherlandia behandling. Vores RNA-seq resultater antyder, at Sutherlandia er en stærk anti-Hh lægemiddelkandidat med stærkt immunsystem boosting aktiviteter.

Støtte Information

S1 Fig. RNA-seq læser af Hsd11b1 og Penk

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s001

(PDF)

S1 tabel. 80ug /ml SFE responsive gener

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s002

(PDF)

S2 Table. Hh responsive gener

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s003

(PDF)

S3 tabel. Differentielt udtrykte gener mellem co-behandling af Hh og SFE, og Hh-CM behandling

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s004

(PDF)

S4 tabel. Primer sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145507.s005

(PDF)

Tak

Denne publikation eller projekt blev muliggjort delvist af Grant Number P50AT006273 fra National center for komplementær og Integrativ Health (NCCIH), Kontoret for kosttilskud (ODS), og National Cancer Institute (NCI). Dens indhold er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle udsigt over NCCAM, ODS, NCI, eller National Institutes of Health.