PLoS ONE: En Minimal Fragment af MUC1 medierer væksten af ​​cancerceller

Abstrakt

MUC1 protein afvigende udtrykkes på mange solide tumorer kræftformer. I modsætning til sin apikale grupperingen på raske epitelceller, er det jævnt fordelt over cancerceller. Imidlertid har en mekanistisk sammenhæng mellem afvigende udtryk og kræft været undvigende. Heri rapporterer vi, at en membranbundet MUC1 spaltningsprodukt, som vi kalder MUC1 *, er den dominerende form af proteinet på dyrkede cancerceller og på cancervæv. Yderligere viser vi, at transfektion af et minimalt fragment af MUC1, MUC1 *

1110 indeholder blot femogfyrre (45) aminosyrer af det ekstracellulære domæne, er tilstrækkelig til at give de onkogene aktiviteter, der tidligere blev tilskrevet den fulde -længde protein. Ved sammenligning af molekylvægt og funktion fremgår det, at MUC1 * og MUC1 *

1110 er omtrent ækvivalent. Beviser præsenteres der støtter kraftigt en mekanisme, hvorved dimerisering af det ekstracellulære domæne af MUC1 * aktiverer MAP kinase signaleringskaskade og stimulerer cellevækst. Disse resultater tyder på metoder til at manipulere denne vækst mekanisme for terapeutiske indgreb i kræftbehandling

Henvisning:. Mahanta S, Fessler SP, Park J, Bamdad K (2008) En Minimal Fragment af MUC1 medierer væksten af ​​kræftceller. PLoS ONE 3 (4): e2054. doi: 10,1371 /journal.pone.0002054

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: 17. december, 2007; Accepteret: 13 Mar 2008; Udgivet: 30 April, 2008

Copyright: © 2008 Mahanta et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er medarbejdere i en biotekvirksomhed og deltage i et aktieoptionsprogram

Introduktion

MUC1 er en type. jeg membranglycoprotein af mucin familie have et omfattende ekstracellulært domæne bestående af hundredvis af tandemgentagelse enheder, en enkelt transmembrant domæne og et C-terminalt cytoplasmatisk hale [1] – [5]. MUC1 udtrykkes normalt ved den apikale grænse af sunde epitel, som linje luftvejene, reproduktive og gastrointestinale skrifter. I skarp kontrast til den sunde ekspressionsmønster, der begrænser MUC1 til luminale overflader, cancervæv vise en afvigende ekspression mønster hvori MUC1 er ensartet fordelt over hele vævsoverfladen [6], [7]. Det anslås, at 75% af alle humane solide tumorer kræft afvigende udtrykke MUC1 protein [8].

Funktionen af ​​MUC1 i sund tilstand er fortsat uklart, mens beviser hurtigt akkumulere for sin rolle som oncoprotein . Indførelsen af ​​MUC1 i tidligere MUC1-negative celler resulterer i en forøget væksthastighed [9], muliggør forankringsuafhængig cellevækst [10] og gør celler resistente over for apoptose induceret af behandling med standard kemoterapeutika [8]. Interaktioner mellem MUC1 og medlemmer af ErbB familien er blevet rapporteret [11], [12]. MUC1 er involveret i flere intracellulære signalveje. Disse undersøgelser har fokuseret på MUC1 cytoplasmatiske hale (MUC1-CT), som måske er den bedst karakteriserede del af proteinet [13]. Den 72 aminosyrer hale bærer rester, der kan phosphoryleres af Zap70, PCKδ, GSK3p, ErbB1, c-Src, Lyn, og Lck. Desuden har signaltransduktion elementer AP-2, p53, ER-α, β-catenin og Grb2 blevet vist at binde til MUC1-CT, formentlig som en funktion af dens phosphorylering tilstand. Faktisk undersøgelser implicerer phosphorylering af MUC1-CT i aktiveringen af ​​MAP-kinase signalering pathway [12]. I en sådan undersøgelse [14], antistof stimulering af det ekstracellulære domæne af et kimært protein bestående af de ekstracellulære og transmembrane dele af CD8, men den cytoplasmatiske hale af MUC1, resulterede i phosphorylering af ERK 1/2. ERK-aktivering blev vist at være afhængig af phosphorylering af MUC1-CT og kunne afskaffes af en dominant negativ Ras mutant eller en MEK-inhibitor, således argumenterer at MUC1-CT medierer Grb2-SOS-Ras-MEK-ERK-signalering kaskade, som fører til celledeling.

Undersøgelser af MUC1 ekstracellulære domæne (ECD) kompliceres af dens forskydning størrelse (150-300 kDa), at det er stærkt glycosyleret, og at det består af et variabelt antal tandemgentagelser. Derudover proteinet kan spaltes, så drop fra celleoverfladen. kan detekteres Shed MUC1, består hovedsagelig af tandemgentagelser, i serum fra trin II brystkræftpatienter [15]. Tilsvarende Western blots af lysaterne af MUC1-positive dyrkede cancerceller viser to MUC1 arter: en høj molekylvægt arter (150-300 kDa), som reagerer med antistoffer, som binder til de tandemgentagelser og en lav molekylvægt (20-35 kDa), der reagerer med antistoffer, som binder til den cytoplasmatiske hale. Cellesupernatanter kun indeholde de højmolekylære MUC1 arter. Nogle undersøgelser dokumenterer, at MUC1 selv-spalter via en SEA-domæne i proteinet [16], [17]. Andre har præsenteret beviser for, at TACE (ADAM 17) og MMP14 (MT1-MMP) spalter MUC1 [18], [19]. Tidlige rapporter postuleret, at efter MUC1 spaltning, de frigivne, højmolekylære del re-forbinder med membranbundne lavmolekylære fragment, og dermed bliver den ligand for membranbundne receptor [20].

Denne rapport fokuserer på ekspressionen og funktionen af ​​lavmolekylære MUC1 spaltningsprodukt som forbliver membranbundet efter at størstedelen af ​​ekstracellulære domæne er blevet spaltet og frigives fra celleoverfladen.

Resultater Salg

Karakterisering af en roman MUC1 antistof

for at undersøge udtrykket mønstre af MUC1 og dens spaltning produkt samt deres respektive funktioner, vi havde brug for at udvikle antistoffer, som kunne adskille lavmolekylære spaltning produkt fra den fulde længde protein på intakte celler og vævsprøver. Antistoffer, der genkender de tandemgentagelse motiver (VU4H5, Santa Cruz) og den cytoplasmatiske hale (Ab-5, LabVision) er kommercielt tilgængelige (fig. 1A). Antistoffer, som genkender den ekstracellulære del af det membranbundne spaltningsprodukt er ikke. For at komplicere tingene, den nøjagtige site (s), hvor MUC1 spaltes på kræftceller er uklar. Adskillige spaltningssteder for MUC1 er rapporteret eller postuleret [21], [22]. Faktisk er en af ​​de enzymer, der spalter MUC1, MMP14, kan spalte sine substrater på flere steder [23]. ingen spaltningssted, der er blevet rapporteret eller foreslået, vil imidlertid have en membranbundet fragment med et ekstracellulært domæne kortere end femogfyrre (45) aminosyrer. Derfor har vi rejst et antistof mod femogfyrre (45) aminosyrepeptid (N-1110-1154-C), der er umiddelbart N-terminalt for det transmembrane domæne (fig. 1B). Vi ræsonnerede, at dette antistof ville genkende de membranbundne produkter af alle indberettede eller foreslået spaltningssteder. På grund af usikkerheden i den præcise position af MUC1 spaltning, heri, vi generisk henvise til alle membran-forankret MUC1 spaltningsprodukter som MUC1 *. Ligeledes henviser vi til antistoffer dannet mod femogfyrre aminosyrepeptid (N-1110-1154-C), mens anti-MUC1 *. Både polyklonale og monoklonale antistoffer blev dannet, og de væsentlige udføres tilsvarende.

A. Fuldlængde MUC1 proteinet består af et cytoplasmatisk hale (CT), et transmembrandomæne (TM), en selv-aggregering domæne (SAD), og hundredvis af tandemgentagelser (TRS). B. Spaltning produkt, MUC1 *, består af den cytoplasmatiske hale, transmembrane domæne, og mindst 45 aminosyrer af det ekstracellulære domæne (ECD). Selv om den nøjagtige site (s) af spaltning fortsat noget usikre, til vores viden, ingen spaltningssteder er blevet rapporteret, at efterlade mindre end en 45 aminosyre ECD. Bindingssteder for antistoffer VUH5, Ab-5 og Anti-MUC1 * er markeret. C. Western-analyse af hele cellelysater af MUC1-positive dyrkede cancerceller, banerne 1-6, sammenlignes med MUC1-negative celler, Lanes 7-9. En 6% gel (øvre) blev blottet med VU4H5 og en 12% gel (lavere) blev blottet med anti-MUC1 *. D. T47D, MUC1-positive dyrkede brystcancerceller, blev immunpræcipiteret med enten Ab-5 eller anti-MUC1 *. Prøver af helcellelysat (WCL), Bane 1, eller immunopræcipitaterne, bane 2 og 3, blev analyseret ved western blot. Geler blev probet med enten VU4H5 (øvre) eller anti-MUC1 * (lavere). E. Western analyse af tre MUC1-positiv brystkræft cellelinier før og efter deglycosylering og blottet med anti-MUC1 * viser, at den faktiske molekylvægt spaltet MUC1 er ca. 16-18 kDa. F. Tabellen opsummerer reaktivitet af antistoffer til enten fuld længde MUC1 (Hi MW) eller spaltede MUC1 (Lo MW).

Anti-MUC1 * antistoffer blev præget af western blot, FACS, og immuncytokemi. Figur 1C viser et western blot, hvor cellelysater fra et panel af MUC1-positive dyrkede cancerceller blev probet med enten VU4H5 (øvre gel) eller anti-MUC1 * (lavere gel). Som forventet VU4H5 farves med høj molekylvægt MUC1 arter fra alle MUC1-positive celler testet: T47D, ZR-75-1, ZR-75-30, BT474, DU145, og Capan 2. Anti-MUC1 * farvede en lavmolekylær 20-35 kDa protein band, der syntes at være specifik for MUC1. MUC1-negative celler, HCT116, 3Y1, og HEK293, reagerede ikke med hverken antistof. For at bekræfte, at de lavmolekylære forbindelser, der reagerede med anti-MUC1 * var faktisk MUC1 blev lysater fra MUC1-positive tumorceller immunpræcipiteret med enten Ab-5 (cytoplasmatisk hale-antistof) eller anti-MUC1 *, derefter analyseret ved Western blot ( fig. 1D). Anti-MUC1 * binder til de samme lavmolekylære arter, Ab-5 erkender, hvilket således bekræfter, at anti-MUC1 * binder til den lavmolekylære MUC1 spaltningsprodukt.

Som tidligere rapporteret, ved Western blot-analyse, med høj molekylvægt MUC1 arter kun omsat med antistoffer rettet mod de tandemgentagelser, og reagerede ikke med anti-MUC1 * eller Ab-5 (data ikke vist). Men begge antistoffer er i stand til svagt immunpræcipitere de højmolekylære arter (fig. 1D, øvre gel). I disse eksperimenter kan immunpræcipitation simpelthen nedlægge en ikke-kovalent associeret hetero-dimer af de to spaltningsfragmenter. Disse resultater kan også forklares ved den kendsgerning, at VU4H5 binder til en tandemgentagelse enhed, der gentages hundredvis af gange pr receptor mens Anti-MUC1 * og Ab-5 binder til ikke-gentagne sekvenser, som kun forekommer én gang pr receptor. Alternativt kunne disse resultater ganske enkelt forklares ved det faktum, at den største arter på cancerceller er det spaltede form MUC1 *. Tabellen ifølge figur 1 opsummerer antistofbinding data.

For yderligere at undersøge den faktiske størrelse af de lavmolekylære MUC1 arter, blev cellelysater deglycosyleret før Western blot-analyse. Figur 1E viser, at efter deglycosylering, den tidligere brede 20-35 kDa proteinbånd konvergerer mod et særskilt bånd, der kører med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 15-17 kDa. Vi bemærker, at den beregnede molekylvægt på et MUC1 spaltningsprodukt, trunacted efter ca. femogfyrre aminosyrer af det ekstracellulære domæne er ca. 16 kDa.

ekspressionsmønstre for MUC1 og dens spaltningsprodukt, MUC1 *, på dyrkede celler og på cancervæv Salg

Dyrkede cancerceller blev analyseret ved immuno-cytokemi at bestemme ekspressionsmønsteret for MUC1 og dens spaltningsprodukt MUC1 *. MUC1-positive brystcancerceller blev dobbelt farvet med VU4H5 der binder til tandemgentagelser enheder i høj molekylvægt fragment og Anti-MUC1 *, der binder til lavmolekylære, membranbundet spaltningsprodukt, MUC1 *. Fluorescerende billeddannelse afslørede, at MUC1 * er den fremherskende form af protein på dyrkede cancerceller og er ensartet fordelt over hele celleoverfladen. I modsætning hertil proteiner, der blev farvet ved VU4H5 var enten ikke til stede på alle eller var de mindre arter (figur 2A). VU4H5 farvning kunne indikere, at proteinet på overfladen er fuld-længde MUC1 eller at det er et ikke-kovalent bundet hetero-dimer bestående af begge spaltningsprodukter. Især er mønsteret for ekspression af fuld-længde MUC1 grupperet i et eller to punkter på celleoverfladen, som minder om tendensen til MUC1 på sund epitel at klynge på den apikale grænse.

A. Fluorescerende billeddannelse af dyrkede brystcancerceller viser, at spaltningsproduktet MUC1 * (rød) er de dominerende arter og er ensartet fordelt over hele celleoverfladen. Fuld længde MUC1 (grøn) er den mindre art og er grupperet. Celler blev dobbelt farvet med anti-MUC1 * (rød), som binder til en epitop i membranen proximale første 45 aminosyrer af det ekstracellulære domæne og VU4H5 (grøn) der binder til en epitop i tandemgentagelsesregionen domæne af fuld-længde proteinet . VÆRE. Par af sammenhængende dele af menneskelige vævsprøver fra ubehandlede patienter blev farvet med enten anti-MUC1 * (venstre) eller VU4H5 (til højre). Billeder blev fotograferet på 10 × eller 100 × forstørrelse. B. Et tværsnit af en ikke-kræft æggeleder viser MUC1 * overfladefarvning ved den luminale kant (nederst til venstre). Fuld længde MUC1 er cytoplasmatisk (nederst til højre). C. Brystkræft vævsprøver. D. Lung Cancer prøver. E. Colon cancer prøver. Pile peger på de mest involverede dele af cancervævet hvor alle cellulære arkitektur er blevet tabt og væv ikke farvet med VU4H5.

Vi kiggede ud på ekspressionsmønsteret for fuldlængde MUC1 versus MUC1 * sunde og cancrøse humane vævsprøver fra ubehandlede patienter. Serielle sektioner af en ikke-kræft æggeleder blev farvet med enten anti-MUC1 * eller VU4H5. Begge MUC1 antistoffer farves den luminale overflade af æggelederen, men ikke det omgivende væv (Fig. 2B, øvre paneler). 100 gange forstørrelse afslørede, at det spaltede form MUC1 *, udelukkende udtrykkes på

overflade

af de epitelceller, der beklæder røret, mens den fulde længde MUC1 proteinet synes at være begrænset til cytoplasmaet (fig. 2B, lavere paneler). Back-to-back sektioner af kræft bryst-, lunge-, og colonvæv blev tilsvarende undersøgt med de to antistoffer (fig. 2C-E, henholdsvis). I skarp kontrast til ekspressionsmønsteret for MUC1 på sunde væv, der var begrænset til den luminale kant, er MUC1 udtrykkes over hele overfladen af ​​cancervæv. Farvning med anti-MUC1 * viser, at ligesom på dyrkede kræftceller, den vigtigste form for MUC1 på kræft væv er MUC1 *. Forstørrede billeder viser, at MUC1 * udtrykkes på cellen

overflade

mens fuld-længde MUC1 synes at være cytoplasmatisk (fig. C, D, underpanel). Især Anti-MUC1 * produceret tungere farvning end VU4H5 trods af, at den tandemgentagelse antistof kan binde til hundredvis af epitoper pr receptor sammenlignet med den samme epitop, til hvilken anti-MUC1 * binder. Nogle af de cancervæv, vi testede ikke farvet positive med enten MUC1 antistof. Af ni (9) brystkræft prøver testet, kun én var en MUC1-negativ kræft, hvilket nogenlunde svarer til offentliggjorte rapporter, at ca. 90% af alle brystkræft er MUC1-positive kræftformer. Vi bemærker, at vævsprøver, der blev anset for at være MUC1-negative kræftformer viste normal apikale farvning med både MUC1 antistoffer i regioner uden for margenen for malignitet (data ikke vist) bekræfter, at analysen er udført korrekt, men at disse kræftformer ikke var præget af afvigende ekspression af MUC1.

det er vigtigt, vi bemærket, at nogle vævsprøver farves positivt for tilstedeværelsen af ​​MUC1 * men negative for fuld-længde MUC1. For eksempel blev en coloncancer prøve farvet med anti-MUC1 * med den mest intens farvning forekommer i de mest syge dele af prøven. I modsætning hertil VU4H5 let farvede områder tæt på margenen for malignitet, men gav ingen farvning i de mere syge regioner, er karakteriseret ved tab af cellulære arkitektur (fig. 2E). Disse resultater er konsistente med den ide, at de mest ondartede prøver kan synes at være MUC1-negativ, hvis probet med antistoffer mod fuldlængde protein alene. Tilsammen viser disse resultater, at de dominerende MUC1 arter på kræft væv, som på dyrkede kræftceller, er de spaltede arter, MUC1 *.

MUC1 * medierer cellevækst

Efter at have fastslået, at den store arter på overfladen af ​​cancerceller og væv er MUC1 * og ikke fuldlængde proteinet, besluttede vi at studere vækstkarakteristika af den spaltede form, sammenlignet med uspaltet. MUC1-negative celler, 3Y1 og HCT116 blev transficeret med enten fuld-længde MUC1 eller en konstruktion, MUC1 *

1110 hvis ekstracellulære domæne blev afsluttet efter femogfyrre (45) aminosyrer (N-1110-1255-C ) (fig. 1B). Stabile transfektanter viste sig at være utilstrækkelige til undersøgelsen, fordi de i fuld længde transfektanter hurtigt udviklet sig til en population domineret af det spaltede form MUC1 *, der frembyder lille eller ingen fuld-længde proteinet tilgængelige på celleoverfladen (data ikke vist). Af denne grund blev enkeltkolonier cellekloner genereres og anvendes i forsøgene beskrevet i den foreliggende undersøgelse. FACS, immunocytokemi og Western blot-analyse viste, at vores enkelt celle kloner af fuld længde MUC1 produceret fuldlængde protein, men også genereret spaltningsproduktet MUC1 * (fig. S1).

En klonogene assay blev udført for at vurdere vækstraten for MUC1 *

1110 versus fuld længde MUC1, der var blevet transficeret i rotte fibroblast 3Y1 celler. Celler udpladet ved lav densitet fik lov til at vokse i ni (9) dage. Resulterende kolonier blev visualiseret ved farvning med krystalviolet. MUC1 *

1110 kloner, 3Y1 MUC1 * 3 og 3Y1 MUC1 * 44, produceret flere, større og tættere kolonier end fuld længde kloner, 3Y1 MUC1 8 og 3Y1 MUC1 17 (fig. 3A). Ved udgangen af ​​ni dage, MUC1 *

1110 kloner producerede fem til ti gange flere celler end de i fuld længde kloner. Forskellen i vækst blev kvantificeret ved at måle mængden af ​​krystalviolet, der blev frigivet fra cellerne på hver plade (Fig 3A:. Søjlediagram). Imidlertid kan stigningen i antallet af celler har været på grund af en stigning i overlevelsesraten eller en stigning i vækstraten. Celleoverlevelse faktorer kan identificeres ved deres evne til at gøre celler modstandsdygtige mod kemoterapi-induceret død. Enkelt celle kloner af MUC1 eller MUC1 *

1110, der var blevet transficeret ind MUC1-negative celler (3Y1 eller HCT116) blev behandlet med AraC, cisplatin eller etoposid, derefter analyseret for at måle mængden af ​​celledød. Celler transficeret med enten fuld-længde MUC1 eller MUC1 *

1110 blev resistente over for apoptose induceret af disse kemoterapeutiske midler. Et repræsentativt eksperiment er vist i figur 3B. Disse resultater hævder, at MUC1 eller MUC1 * stigning celle overlevelse. For at bestemme om de øger også cellevækst, blev en cellecyklusanalyse eksperiment udført. FACS blev anvendt til at måle antallet af celler i G2 /M-fase (en indikator for celledeling) i forhold til antallet i G1-fasen. Forholdet af celler i G2: G1 blev målt for HCT116 celler transficeret med enten fuld-længde MUC1 eller MUC1 *

1110 (figur 3C.). Indførelsen af ​​enten MUC1 *

1110 eller fuld-længde MUC1 kørte flere celler i G2 /M-fasen end kontrollen transfektion af tom vektor. Imidlertid transfektion MUC1 *

1110 steg forholdet mellem G2:G1 mere end transfektion af fuldlængde proetin. Husk på, at selv om celler transficeret med fuld-længde protein, en betydelig mængde proteolyseres til MUC1 * formularen.

A. En klonogene assay blev udført på en enkelt celle kloner af MUC1-negative 3Y1 celler, som var blevet transficeret med enten en tom vektor, fuld længde MUC1 eller MUC1 *

1110. Et fotografi af Petri-skåle indeholdende celler udpladet ved 1000 celler pr 100 mm, der dyrkes i 9 dage, derefter farvet med krystalviolet. Søjlediagram kvantificerer væksten af ​​hver klon. Crystal violet absorberet af cellerne på hver plade blev frigivet, og absorbans ved 590 nm blev målt på et spektrofotometer. Absorptionsmålinger blev normaliseret til mængden af ​​krystalviolet frigivet fra tom vektor klonen. Nomenklatur for vores enkelt celle kloner er “forælder celle navn /konstruktion /klon #”. B. Resistens mod celledød induceret af kemoterapi narkotika AraC testes i en enkelt celle kloner af enten tom vektor, fuld længde MUC1 eller MUC1 * transficeres til 3Y1 celler. C. Cellecyklusanalyse blev udført på enten tom vektor, fuld længde MUC1 eller MUC1 * transficeret ind MUC1-negative cellelinie HCT116. Forholdet mellem procentdelen af ​​celler i G2 til G1-fasen er plottet som funktion af serumkoncentration. Forholdet mellem% G2:% G1 for de tomme vektor transfektanter er blevet normaliseret til 1. D. Væksten af ​​MUC1-positive brystcancerceller, ZR-75-30, stimuleres ved tilsætning af bivalente (bv) Anti-MUC1 * og inhiberes ved tilsætning af monovalente (mv) Fab. Tilsætningen af ​​bivalent antistof frembringer den klokkeformede vækstkurve som er karakteristisk for receptordimerisering. Væksten i MUC1-negative HEK 293 celler blev ikke påvirket af hverken den bivalente eller monovalent Anti-MUC1 *. E. Stimulering af vækst ved tilsætning af bivalente Anti-MUC1 * testes under anvendelse stabilt transficeret siRNA at undertrykke MUC1 ekspression i brystcancer-cellelinie T47D. Bivalent Anti-MUC1 stimulerede væksten i celler transficeret med kontrol siRNA, men ikke signifikant påvirker væksten i MUC1 undertrykte celler. Western blot-analyse (indsæt) viser, at MUC1 siRNA undertrykt MUC1 ekspression med omkring 90%. F. MUC1-positive brystcancerceller, T47Ds, behandles med enten bivalent anti-MUC1 * eller monvalent Fab, derefter analyseret ved Western for tilstedeværelsen af ​​phosphoryleret ERK1 /2. Blots viser induktion af ERK2 phosphorylering med bivalent Anti-MUC1 * og hæmning af basal ERK1 /2 phosphorylering efter to dage (2 d) behandling med monovalente Fab.

Således har etableret en forbindelse mellem MUC1 * og vækst, vi spekulerede at det kan fungere som en vækstfaktorreceptor. Uden en kendt ligand for MUC1 eller MUC1 *, ville det være vanskeligt at teste hypotesen. Imidlertid klasse I vækstfaktorreceptorer udløse cellevækst via dimerisering af det ekstracellulære domæne af receptoren. Vi havde en bivalent antistof mod MUC1 *

1110-ECD (ekstracellulære domæne) portion, som kunne anvendes til at simulere dets ligand. Andre har tidligere rapporteret, at stimulering af denne klasse af vækstfaktorreceptorer med dimeriserende antistoffer frembragt klokkeformede vækstkurver [24] – [26]. Dette skyldes cellevækst stiger med stigende antistofkoncentration indtil maksimal vækst opnås, når ét antistof dimeriserer hver to receptorer. Men efterhånden som koncentrationen af ​​antistof går til overskud, hvert antistof binder til en receptor, så ingen dimerisering sker, og cellevækst falder af. Vi udførte lignende forsøg ved at behandle MUC1-positive cancerceller samt MUC1 og MUC1 *

1110 transficerede celler med anti-MUC1 *. Som en negativ kontrol behandlede vi cellerne med den monovalente Fab af anti-MUC1 *, som ikke ville være i stand til at dimerisere receptorerne. For hver MUC1-positive eller MUC1 *

1110-positive cellelinie, som vi testede, den bivalent antistof stimulerede cellevækst og produceret den forventede klokkeformet kurve vækst. I stærk kontrast, ikke kun den monovalente Fab ikke stimulere cellevækst, men det inducerede celledød. Resultaterne af en sådant eksperiment er vist i figur 3D, hvor væksten af ​​MUC1-positive brystcancerceller, ZR-75-30s, stimuleres af anti-MUC1 * og inhiberet af den monovalente Fab. MUC1-negative HEK293 celler er upåvirket af enten antistof. Kontrol- antistoffer, også bivalente eller monovalent, havde ingen virkning på væksten af ​​MUC1-positive tumorcellevækst (fig. S2). For at bekræfte, at antistof-stimulering af cellevækst specifikt blev medieret af MUC1, blev forsøgene gentaget under anvendelse MUC1-positive brystcancerceller, at T47Ds, som var blevet stabilt transficeret med siRNA knockdown MUC1 ekspression. T47D cellevækst stimuleres ved tilsætning af bivalente Anti-MUC1 * og karakteristikken klokkeformede vækstkurve produceres. Men i celler, hvori MUC1 ekspression er blevet undertrykt med mindst 90%, har antistoffet ingen stimulerende effekt (fig. 3E). Endelig viste eksperimenter, at stimulering af MUC1-positive celler med bivalent anti-MUC1 * inducerede phosphorylering af ERK1 /2. I modsætning hertil monovalente Fab-fragment af anti-MUC1 * undertrykt basale niveauer af phosphoryleret ERK1 /2 (fig. 3F). Phosphorylering af ERK1 /2 er et vigtigt skridt i aktiveringen af ​​MAP-kinase signalering kaskade. Tilsammen disse resultater er i overensstemmelse med tanken om, at MUC1 * er en vækstfaktor receptor eller co-receptor, der medierer cellevækst via dimerisering af det ekstracellulære domæne, hvorefter MAP kinase signalvejen er aktiveret.

MUC1 * aktiverende ligander

Hvis MUC1 eller MUC1 * fungerer som en vækstfaktorreceptor, der aktiveres af dimerisering af det ekstracellulære domæne, så følger det, at MUC1-positive cancerceller kan udskille et dimeriserende ligand (er). Vi designede en nanopartikel eksperiment for at screene cancer cellelysater og supernatanter for tilstedeværelsen af ​​denne ligand. MUC1 *

1110-ECD peptider (N-1110-1054-C: jf. Figur 1B) blev bundet til guld nanopartikler via et C-terminalt histidinmærke og lysat /supernatantprøver tilsattes [27]. Hvis et dimeriserende ligand var til stede, ville den samtidigt binde til et første peptid på en første nanopartikel og en anden peptid på en anden nanopartikel, således forårsager hovedparten tværbinding af nanopartikler og peptider. På grund af en iboende egenskab af guld nanopartikler, tværbinding forårsager en farveændring fra den karakteristiske lyserøde til en lilla /blå [28]. Tilsætningen af ​​lysatet /supernatant blandinger til MUC1 *

1110-ECD peptid-bærende nanopartikler forårsagede opløsningen til at vende lilla /blå. Hastigheden af ​​farveændring, svarer stort set til den mængde MUC1, at hver cellelinie produceret. Ingen farveskift resulterede da lysatet /supernatant blandinger blev tilføjet til nanopartikler, der bærer en kontrol peptid (fig. 4A).

A. Lysat-supernatant blandinger fra et panel af MUC1-positive brystcancerceller blev testet for tilstedeværelsen af ​​en ligand, som kan dimerisere et MUC1 *

1110-ECD peptid (membranproximale 45 aminosyrer af det ekstracellulære domæne: 1110-1155) . Lysat-supernatant blandinger blev inkuberet med nanopartikler bærer enten en kontrol peptid eller et MUC1 *

1110-ECD peptid, histidin-mærket ved C-terminalen. En nanopartikel løsning farveændring fra lyserød til en lilla /blå indikerer, at en art i blandingen samtidig har bundet sig til to eller flere MUC1 *

1110-ECD peptider. B. Bivalent (bv) Anti-MUC1 * (0,77 ug) til nanopartikler, der bærer enten en kontrol peptid (række A) eller MUC1 *

1110-ECD, peptider (række B). Antistofbinding til to peptider på separate nanopartikler forårsager nanopartikel aggregation og opløsningen farveændring fra lyserød til lilla /blå. I række A, brønde 3-5, er denne aggregering inhiberes ved tilsætning monovalent Anti-MUC1 * Fab (mv Fab). C. NM23 på 0,05, 0,1 eller 0,2 uM, (Rækker A, B og C) til nanopartikler bærer MUC1 *

1110-ECD peptider (Kolonner 2-5). Tilføjet NM23 inducerer en farveændring, formentlig som NM23 dimerer binder til nanopartikel-immobiliserede MUC1 *

1110-ECD peptider. Tilsætningen af ​​monovalente anti-MUC1 * (mv Fab), i kolonne 3-5, inhiberer farveændring. D. Konditionerede medier fra MUC1-positive brystcancerceller, T47Ds og MUC1-negative rottefibroblaster, 3Y1s, blev blandet med perler forsynet med MUC1 *

1110-ECD peptid. Immunopræcipiterede arter blev derefter analyseret ved western, hvor gelen blev blottet med et anti-NM23-antistof. Den vestlige blot viser, at T47Ds udskiller NM23 mens 3Y1s ikke gør. E. overfladeplasmonresonans (SPR) blev anvendt til at detektere direkte binding mellem NM23 (15 nM) og MUC1 *

1110-ECD peptider. Sensogrammet viser, at 1044 jernbanevirksomhederne af NM23, injiceret ved 15 nM, bundet til en overflade bærende MUC1 *

1110-ECD peptider (optrukket linje), men ingen NM23 bundet til en kontrol pladens et irrelevant peptid (stiplet linie). F. Stimulering af T47D brystcancercellevækst af NM23 er afhængig af MUC1 ekspression. Eksogene NM23 tilføjet til T47D-brystcancerceller stimulerer vækst og producerer klokkeformet kurve indikerer receptordimerisering. Væksten er stærkt reduceret i celler, der stabilt udtrykker MUC1-specifikke siRNA, sammenlignet med celler, der udtrykker en kontrol siRNA. Western blot kvantificerer siRNA undertrykkelse af MUC1.

For at identificere, hvad der syntes at være en MUC1 * ligand (r), perler bærer MUC1 *

1110-ECD peptider blev anvendt til at immunpræcipitere de ukendte proteiner fra lysatet /supernatant blandinger fra MUC1-positive cancerceller. Eluaterne blev separeret ved SDS-PAGE og visualiseret ved hjælp af sølvfarvning metoder. Der var væsentlige kun to bands, der blev udfældet ved MUC1 *

1110-ECD peptid og ikke udfældet af en kontrol peptid: en fremtrædende 23 kDa bånd og en svagere 17 kDa bånd (Fig S3.). Proteinbåndene blev udskåret fra gelen og analyseret ved anvendelse af N-terminal mikrosekventering, som identificerede dem som NM23, isoformer H1 og H2 hhv. NM23 er normalt findes i cytoplasmaet af alle celler, men er ofte udskilles af cancerceller [29], som angiver, at det kunne være en ligand for den ekstracellulære del af MUC1 *. Cellesupernatanter blev immunfældet med MUC1 *

1110-ECD peptider bundet til perler, derefter analyseret ved western blot. Supernatanterne fra MUC1-positive cancerceller, men ikke de kontrolcellerne, skabt en stærk proteinbånd ved ca. 23 kDa, der reagerede med anti-NM23H1 (fig. 4B). Dette bekræftede, at proteinerne i kræftcellen supernatanter der blev immunfældet med MUC1 *

1110-ECD peptider var faktisk NM23.

For at påvise en direkte binding mellem NM23 og MUC1 *

1110-ECD peptider og for at bekræfte specificiteten, et andet nanopartikel eksperiment udført. Rekombinant human NM23 blev tilføjet til MUC1 *

1110-ECD-peptid-bærende nanopartikler eller nanopartikler, der bærer en kontrol peptid. Tilføjelsen af ​​NM23 til nanopartikler bærer MUC1 *

1110-ECD, forårsagede en løsning farveændring fra lyserød til lilla /blå og graden af ​​farveændringen var en funktion NM23 koncentration. Den monovalente Fab af anti-MUC1 * inhiberede kompetitivt binding mellem partikel-immobiliserede MUC1 * peptider og NM23 (fig. 4C). For yderligere at demonstrere specificiteten af ​​nanopartikel analysen selv, blev bivalent Anti-MUC1 tilføjet til MUC1 *

1110-ECD-peptid-bærende nanopartikler, der som forventet resulterede i pink til blå farveskift. Denne binding blev også kompetitivt inhiberet af den monovalente Fab (fig. 4D).