PLoS ONE: Early Growth Reaktion 3 (Egr3) er stærkt overudtrykt i Non-Recidiverende prostatakræft, men ikke i recidiverende Prostata Cancer

Abstrakt

Medlemmer af den tidlige vækst respons (EGR) familie af transkriptionsfaktorer spille forskelligartede funktioner som respons på mange cellulære stimuli, herunder vækst, stress og inflammation. Egr3 er gået relativt unstudied, men her ved brug af de specs (strategiske partnere for Evaluering af Predictive underskrifter prostatakræft) Affymetrix hele genomet genekspression database vi rapportere, at Egr3 mRNA er signifikant overudtrykt i prostatacancer sammenlignet med normal prostata væv (5 gange). Det humane protein Atlas (https://www.proteinatlas.org), en database over væv microarrays mærket med antistoffer mod over 11.000 humane proteiner, blev anvendt til at kvantificere Egr3 proteinekspression i normale prostata og prostatacancerpatienter. Efter aftale med de specs data, fandt vi, at Egr3 protein øges betydeligt i prostatakræft. Specs databasen har den fordel af omfattende klinisk opfølgning for patienter i prostata cancer. Analyse af Egr3 mRNA-ekspression i forhold til tilbagefald status afslører, at Egr3 mRNA-ekspression er forøget i tumorceller af ikke-recidiverende prøver (n = 63) sammenlignet med normale prostataceller, men er betydeligt lavere i recidiverende prøver (n = 38) sammenlignet til ikke-tilbagefald. Observationerne blev bekræftet ved hjælp af en uafhængig datasæt. En liste af gener korrelerer med denne unikke ekspressionsmønster blev bestemt. Disse Egr3-korrelerede gener blev beriget med Egr bindingssteder i deres initiativtagere. Genet liste indeholder inflammatoriske gener, såsom IL-6, IL-8, IL1β og COX-2, som har omfattende forbindelser til prostatacancer

Henvisning:. Pio R, Jia Z, Baron VT, Mercola D, UCI NCI SPECIFIKATIONER konsortium af de strategiske partnere for Evaluering af Cancer signaturer, prostatakræft (2013) Tidlig vækst reaktion 3 (Egr3) er stærkt overudtrykt i Non-Recidiverende prostatakræft, men ikke i recidiverende prostatacancer. PLoS ONE 8 (1): e54096. doi: 10,1371 /journal.pone.0054096

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: December 13, 2011; Accepteret: December 10, 2012; Udgivet: januar 14, 2013 |

Copyright: © 2013 Pio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af USPHS tildeler U01 CA1148102 (NIH /NCI SPECIFIKATIONER konsortium) og U01 CA152738 (NIH /NCI EDRN), og ved University of California i Irvine Faculty Karriereudvikling Award (til Dr. Z. Jia). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. D. mercola er en oplagrer Proveri Inc. i San Diego, en bioteknologisk starte -up virksomhed, der udvikler prostatakræft relaterede tests. Dr. Baron er en konsulent for PellFiCure Pharmaceuticals, Inc., en start-up virksomhed, der udvikler en kombinationsbehandling af prostatakræft. Der er ingen markedsførte produkter at erklære. En verserende patentansøgning er: Michael McClelland, Yipeng Wang, Daniel mercola: Materialer og metoder til bestemmelse diagnose og prognose for prostatakræft. September 2011: US 20110236903. Proveri udvikler en multiplex immunhistokemi prostatakræft diagnose test baseret på materiale af den verserende patent. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Alle de menneskelige væv array-data citeret i dette manuskript er tilgængelig for offentligheden som der henvises til i teksten.

Introduktion

Den tidlige vækst respons (EGR) transkriptionsfaktorer har længe været involveret i flere cellulære processer vigtige for cancer, herunder apoptose, differentiering, proliferation, væksthæmning og inflammation [1] – [5]. EGR transkriptionsfaktorer induceres hurtigt og transient som respons på forskellige stimuli, såsom vækstfaktorer, cytokiner, phorbolestere (TPA) og ioniserende stråling, og regulere et mangfoldigt array af gener som reaktion på disse stimuli [1], [6] – [ ,,,0],8]. EGR-familien består af EGR1, Egr2, Egr3, og Egr4 [9] og alle familiemedlemmer binder til den samme EGR respons DNA-element (ERE), GCGG /TGGGCG, gennem tre konserverede zinkfinger-DNA-bindende domæner [10].

EGR1 er den bedst undersøgte medlem af transkriptionsfaktoren familien. Talrige undersøgelser har detaljerede sine tumor suppressor funktioner og dermed dets nedregulering i bryst-, lunge- og glia kræft [11] – [13]. Interessant EGR1 har vist sig at virke som et onkogen i prostatacancer. Flere forskere har rapporteret overekspression af EGR1 mRNA og protein i prostatacancer [14] – [15]. Vagabonden og CR2-T-Ag musemodeller for prostatakræft blev udnyttet til yderligere at undersøge den funktionelle rolle EGR1 i initiering og progression af sygdommen. EGR1-null mus, der blev krydset med enten kræft model viste forsinket progression fra prostata intraepitelialneoplasi (PIN) til invasiv karcinom [16].

På trods af de godt karakteriserede funktioner EGR1, langt mindre om den anden transskription faktorer i EGR familien såsom Egr3. Adskillige undersøgelser detalje funktion Egr3 i neural udvikling, specielt muskel spindel udvikling, sympatisk neuron differentiering og reaktion på miljømæssige stress (lyd, håndtering, og nye situationer) [17] – [20]. Egr3-mangel mus udviser sympatisk dysautonomi og alvorlige sensoriske ataksi [17], [20], mens EGR1-manglende mus udviser nogen tilsyneladende adfærdsmæssige eller udviklingsmæssige problemer [21]. Egr3 knockout-mus er endnu ikke blevet anvendt til at undersøge den rolle af transkriptionsfaktoren i cancer, men nylige rapporter har brugt cellekulturmodeller og genekspression data til at studere Egr3 funktion på flere områder vigtig for kræft. Således Egr3 er opreguleret af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) i humane navlevene-endotelceller (HUVECS) [22], [23], og knockdown af Egr3 i disse celler resulterer i en reduktion af VEGF-induceret proliferation, migration og tubulogenesis [23]. Ud over sin rolle i angiogenese, har adskillige rapporter undersøgt rolle Egr3 i brystcancer, hvor det viste sig at være en østrogen-responsive gen, hvis immunoreaktivitet er positivt forbundet med østrogen-receptor α (ERa) status, lymfeknude-status, og fjernmetastaser [24], [25].

Meget arbejde stadig skal gøres, men om at udrede rolle Egr3 i andre typer af kræft. Baseret på vores viden om EGR1 og de fælles DNA-bindende karakteristika for alle EGR transkriptionsfaktorer, vi hypotesen, at Egr3 faktisk spiller en rolle i enten dannelsen eller progression af prostatacancer. Her rapporterer vi overekspression af Egr3 mRNA og protein i prostatacancer sammenlignet med normale prostatavæv. Ud over at studere den overekspression af Egr3, vi brugte også de omfattende prostata genekspression datasæt fra University of California-Irvine SPECIFIKATIONER program til at undersøge udtryk mønster af Egr3 hos patienter med prostatacancer med kendt tilbagefald status, og fandt, at Egr3 udtryk i tumorceller er lavere i tumorer, der tilbagefald sammenlignet med tumorer, der ikke tilbagefald. Dette ekspressionsmønster: lav Egr3 mRNA i normal prostata versus høj ekspression i cancer, og skelnen mellem tilbagefald og ikke-tilbagefald, blev bekræftet med prostatacancer genekspression datasæt fra University of Pittsburg [26] – [28]

Brug af humant protein Atlas, vi også detaljer et unikt in-silico metode til at undersøge overekspression af Egr3 protein i prostatakræft. De kombinerede resultater indikerer, at Egr3 er en biomarkør for dårligt resultat prostatacancer. Desuden er en kohorte af stærkt korrelerede gener udviser et lignende udtryk mønster, og medlemmerne af denne kohorte er kandidat Egr3-regulerede gener.

Materialer og Metoder

Prostata vævsprøver

Prostata prøver blev erhvervet af informeret samtykke i henhold til University of California, Irvine Institutional Review Board (IRB) -godkendte og HIPAA-kompatible protokoller. Tissue købet var en del af NCI-SPECS program på University of California, Irvine. Prostata cancer væv blev indsamlet på tidspunktet for prostatektomi, revideret af en patolog, og snap-frosset i flydende nitrogen. Tissue sporing ark blev opretholdt til at registrere den forløbne tid fra operation til frysning (gennemsnit 2,8 timer). Normale prostata prøver blev enten lynfrosset i flydende nitrogen fra friske biopsi fyldning eller snap-frosset efter samling fra den hurtige obduktionen programmet på Sun Health Research Institute (Sun City, AZ), et SPECIFIKATIONER konsortium medlem. Dataene består af 19 normale prostata prøver fra 13 personer (12 fra normal biopsi og 7 fra hurtig obduktion) og 108 prostatakræft prøver fra 84 individer (tabel 1). Outcome parametre og relevante kliniske data, herunder en omfattende historie blev akkumuleret over en 11 års periode og vedligeholdes i specs relationel database med en data ordbog på over 250 poster. Resultatet parameteren “tilbagefald” henviser til biokemisk tilbagefald, stigningen i PSA-niveauer i løbet af 0,2 ng /ml efter en forudgående post-op PSA, der lå under den grænse for testen. Ikke-tilbagefald betyder, at ingen biokemisk tilbagefald blev observeret i patienten under den kliniske opfølgning tidsramme. Bemærk, at alle tumor prøver blev opsamlet på tidspunktet for prostatektomi, så tilbagefald status blev bestemt efter, at prøverne allerede blev opsamlet. Relevante kliniske og demografiske værdier er opsummeret i tabel 1.

Affymetrix genekspression arrays og Statistical Analysis

RNA fra prostata vævsprøver blev analyseret ved anvendelse Affymetrix genekspression arrays. RNA blev fremstillet ud fra frisk frosset væv ved sektionering vævsblokke med en kryostat og oprensning total RNA direkte fra de akkumulerede frosne snit. Oprenset RNA blev hybridiseret til enten Affymetrix U133 Plus2.0 eller U133A genekspression arrays, og arrayene blev forarbejdet i overensstemmelse med Affymetrix protokol. De data, intensitet der anvendes her er tilgængelig fra offentlige kilder (GEO GSE17951 og Geo GSE8218 henholdsvis).

Normaliseret Affymetrix intensitet værdier blev brugt til at sammenligne Egr3 (Affymetrix sonde ID 206115_at) udtryk i hele prøver af normal prostata og prostata kræftvæv. Normaliserede værdier af de to prøvetyper blev sammenlignet under anvendelse af en t-test. LIMMA (Lineære Modeller for Microarray data) analyse fra BioConductor blev implementeret i R miljø til at detektere differentielt udtrykte gener [29].

For at analysere den celletype specificiteten af ​​ekspressionen af ​​Egr3 og korrelerende gener, brugte vi en multipel lineær regression (MLR) model til at beskrive forholdet mellem den observerede Affymetrix genekspressionsniveau og celletype sammensætning til fire celletyper i recidiverende og ikke-tilbagefald tilfælde: (1) hvor er skæringspunktet, er procentdelen af ​​celletypen j som bestemt af et panel af patologer, er koefficienten for bidraget fra celletype, er afvigelsen eller ændring af for celletype når sygdommen tilbagefald. er indikatoren variabel for tilbagefald status. hvis emnet gennemgår tilbagefald, og ellers. er den tilfældige fejl med antaget fordeling. Denne MLR modellen blev brugt til at tilpasse dataene til at anslå udtrykket koefficienterne, og, hvor er celletype-specifik ekspression koefficient og γ er forskellen i celletype-specifik ekspression mellem tilbagefald og ikke-tilbagefald tilfælde. Således

β

j måler ekspressionen af ​​et gen ved celletype j af ikke-recidiverende tilfælde og

γ

j er ændringen i

β

j i tilbagefald tilfælde. For MLR, β

0 er gennemsnittet af ekspression af alle generne for alle celletyper og resultatet status (RS). Derfor β

j koefficienter 0 indikerer, at ekspression af genet j i en given celletype er mindre end den gennemsnitlige β

0, mens β

j koefficienter 0 indikerer forøget ekspression sammenlignet med p

0. Tilsvarende γ

j 0 indikerer, at ekspression af genet j reduceres i recidiverende prostatacancer sammenlignet med ikke-recidiverende prostatacancer henviser γ

j 0 indikerer, at ekspression af genet j øges recidiverende prostatacancer sammenlignet med ikke-recidiverende sygdom. Betydningen af ​​γ

j blev bestemt ved t-test, baseret på fejl σ

j af γ

j. Nøjagtigheden af ​​celle typespecifikke udtryk bidrag koefficienter, β, er valideret [30].

humant protein Atlas

Immunhistokemi billeder blev hentet fra den offentligt tilgængelige humant protein Atlas (HPA) ( https://www.proteinatlas.org). HPA version 8.0 er en database af væv microarray (TMA) billeder mærket med antistoffer mod 11.250 humane proteiner [31]. Vævet microarrays består af snit fra 46 normale humane væv og 20 forskellige typer af human cancer. Der er et maksimum på 24 prostatakræft billeder (fra 12 patienter) og 3 normale prostata-billeder (fra 3 donorer) pr antistof, selv om billedet antal kan variere afhængigt af den analyserede antistof. HPA billeder analyserede var prostata sektioner mærket med enten Egr3 (HPA006206), PSMA (CAB001451, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland), eller PRLH (HPA014768) antistoffer.

HPA billeder blev analyseret og mærkning intensitet blev kvantificeret med Aperio ImageScope software (Vista, CA) (figur S1 og S2). Den positive Pixel Count Algoritme-version 9.1 blev anvendt til at kvantificere mængden af ​​antistof binding og for at opnå pseudocolored TMA billeder. For at kvantificere mærkning af bestemte strukturer såsom stroma eller tumor acini blev intensitet grænseværdier fastsat af Aperio software, der anvendes, i overensstemmelse med producentens forslag.

Pixel defineres som et mål for lysstyrke pixel, eller mængden af ​​lys, der transmitteres gennem slæden. Jo lavere intensitet værdi er, jo mørkere farvningen skyldes øget absorbans A = -log I

obs /I

ref, hvor I

obs indikerer transmitteret lysintensitet og I

ref er indfaldende lysintensitet. tærskler intensitet blev sat til 220, 175, 100, og -1 for de svage, medium, stærk og “negative” pixels hhv. Pseudocolors af blå, gul, orange og rød blev anvendt til den negative, svag, middel, og stærke pixels hhv.

Normalt prostata og prostatakræft væv blev analyseret med den positive pixel count algoritme. At sammenligne densiteten af ​​farvning i normale og prostatakræft væv blev NSR (antal stærke positive pixels ratio) anvendes. Antallet af stærkt mærkede positive pixels divideres med det samlede antal positive pixels til at normalisere hver prøve til området under overvejelse, hvorved der tilvejebringes mærkning intensiteten af ​​en udvalgt celletype per arealenhed af væv.

Den positive pixel tælle algoritme blev også anvendt til at sammenligne proteinekspression i de stromale og epiteliale komponenter af prostatavæv. En mus-guidet pen værktøjet blev brugt til at skitsere 10 stromale og 10 kirtel områder per TMA sektion. De 10 prøvetagningsområder blev valgt tilfældigt når det er muligt, inden for de begrænsninger væv størrelse og sammensætning

Begrænsninger i væv størrelse:. Det samlede væv området blev kun 1 mm i diameter, og kanterne af hvert vævssnit blev undgået fordi farvning i disse områder har tendens til at blive påvirket af behandlingen af ​​TMAs. Derudover brugte vi prøvetagningsområder der ikke rører hinanden

Begrænsninger i væv sammensætning:. Nogle vævssnit indeholdt mange kirtler, og når dette var tilfældet prøveudskillelsesfiltrene områder blev valgt tilfældigt. Andre afsnit indeholdt langt færre kirtel områder, hvilket reducerer vores valg til de kirtler, der var til stede. De stromale sektioner, på den anden side, blev alle udvalgt tilfældigt, da vævssnit havde talrige stromale områder.

Et øjebliksbillede blev taget af hver prøve tilfældigt udvalgt og brugt til at kontrollere, at de anvendte prøver til analyse var repræsentative for hele afsnittet.

resultatet blev midlet og anvendes til bestemmelse af signifikante forskelle i forhold til normal prostata væv.

Egr3-korrelerede Gener

Pearsons korrelationskoefficient (r ) samt sandsynligheden og hældning blev beregnet i R-miljø for korrelationen af ​​ekspression af hvert gen på Affymetrix arrayet platform med ekspressionen af ​​Egr3. Generne med

s

værdier ≤0.001 baseret på Pearsons korrelationsanalyse og en Pearson korrelationskoefficient ≥0.45 blev udvalgt som definere Egr3-korrelerede gener. Egr3-korrelerede gener for de vigtigste SPECS Affymetrix U133 Plus2.0 datasæt (127 prostataprøver) anvendt i denne undersøgelse, og Egr3-korreleret gener for en Yderligere specifikationer genekspression datasæt (136 prostataprøver) baseret på Affymetrix U133A platform, blev beregnet . Den overlappende gener mellem datasæt, der opfyldte betydning cutoff værdier blev taget som den endelige liste over Egr3-korrelerede gener. Hældningen af ​​regressionslinjen blev også brugt til at karakterisere overholdelse af hver korrelation til Egr3 udtryk og er rapporteret i tabel S1.

Statistisk Simulation

Flere simuleringerne er foretaget for at vurdere tilfældig hændelse. Generelt hyppigheden af ​​forekomsten af ​​kandidat probesæt i en klasse blev sammenlignet med hyppigheden af ​​forekomsten af ​​tilfældig udvælgelse af et tilsvarende antal probesæt fra resten af ​​arrayet, dvs. fra alle probesæt undtagen kandidat- probesæt anvendelse af R program. Tilfældig udvælgelse blev gentaget 10.000 gange, og den gennemsnitlige tilfældige hyppighed i forhold til den observerede frekvens af kandidatlandene probesæt blev anvendt til at fastslå sandsynligheden for tilfældig forekomst.

transskriptionsfaktorbindende stedet og Gene Network Analysis

Genomatix (München, Tyskland) Matlnspector software blev anvendt til at bestemme transkriptionsfaktor bindende sites for promotorregioner 1500 baser opstrøms til 1000 baser nedstrøms for transkriptionsstartstedet (TSS). Den transkriptionsfaktorbindingssites (vægt matricer) bibliotek og vertebrate generel core promotorelementer (0,75 /optimeret) matrix gruppe blev anvendt til at beregne bindingssteder for hver promotor. Baseret på Matlnspector baggrund model for forekomster af V $ EGRF (Transfac annotation for hvirveldyret Egr Familiemedlemmer EGR1, Egr2, Egr3, CKROX, og WT) bindingssteder, en 10.000 × simulering blev udført i R-miljø til at sammenligne den procentvise baggrund (62,7%) af V $ EGRF bindingssites som bestemt ved Matlnspector til den observerede procentdel (99%).

s

værdi = det antal gange den forventede var større end den observerede /10.000 hjælp Genomatix. Simuleringen

s

-værdi giver et estimat for falsk opdagelse.

MetaCore (Thomson Reuters, New York, NY) pathway analyse software blev anvendt til at analysere forbindelser mellem Egr3-korrelerede gener. Transkriptionsfaktor berigelse analyse og proteinfunktion berigelse analyse blev beregnet ved MetaCore under falsk opdagelse sats (FDR) på 0,05 og en baggrund model af rapporterede protein-protein- eller protein-DNA-interaktioner. Alle

s

-værdier rapporteret for MetaCore analyse kommer direkte fra MetaCore beregninger baseret på en hypergeometriske fordeling. Den web-baserede gen ontologi program DAVID [32], [33] (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) blev også anvendt til at analysere funktionelle forbindelser mellem Egr3-korrelerede gener.

ekstern validering dataset

offentligt tilgængelige GEO datasæt GDS2545 blev brugt som en ekstern validering af Egr3 og Egr3-korrelerede gener identificeret i de specs datasæt. GDS2545 består af 18 prøver af normal prostata fra donorer, 63 prøver af normal prostata tilstødende til tumor, 65 prøver af primær prostatacancer, og 25 prøver af metastatisk prostatacancer. Alle prøver blev hybridiseret på Affymetrix U95A arrays. Chandran et al. [27] og Yu et al. [26] Rapporten Affymetrix Egr3 udtryk værdier i supplerende oplysninger og i tabeller af genekspression værdier. Egr3-korreleret gen analyse blev udført under anvendelse af dette datasæt. Toppen 150 Egr3-korreleret probe sæt som bedømt af Pearsons korrelation

s

-værdi består af 121 unikke gener, som blev sammenlignet med de 80 unikke Egr3-korreleret gener er identificeret i de specs datasæt giver et overlap på 43 unikke gener. En 10.000 × simulering blev udført i R miljø til at bestemme sandsynligheden for dette overlap forekommer tilfældigt (

s

= 0,0001).

Cell Culture

M12 human prostatacancer celler blev holdt i serumfrit RPMI-medium suppleret med L-glutamin, 10 ng /ml epidermal vækstfaktor, 0,1 uM dexamethazon, 5 ug /ml insulin, 5 pg /ml transferrin, 5 ng /ml selen, 0,05 mg /ml gentamicin og 2,5 ug /ml amphotericin B, som beskrevet i [34].

Stabil Knockdown af Egr3 ekspression i M12 celler

M12-celler blev udpladet dagen før transfektion med en tæthed på 750.000 celler /brønd i 6-brønds plader, i antibiotikum-frit vækstmedium indeholdende 2% kalvefosterserum. Celler blev transficeret med 3 ug shRNA scramble plasmid (shSCR) eller shEgr3 plasmid (SA Biosciences, Valencia CA) med 6 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA) ifølge producentens instruktioner. Puromycin (1 ug /ml) blev tilsat tre dage senere til selektion af transficerede celler. Single cellekloner blev isoleret under anvendelse af standardmetoder. Stabilt transficerede celler (shSCR-M12 og shEgr3-M12) blev derefter holdt i M12-vækstmedium suppleret med puromycin.

Western blot-analyse Salg

Celler blev vasket to gange i phosphatbufret saltvand og lyseret i RIPA buffer i nærværelse af proteaseinhibitorer. Lysatet blev sonikeret kortvarigt og klaret ved centrifugering ved 13.200 rpm ved 4 ° C. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af BioRad Protein Assay. Proteiner blev underkastet SDS-PAGE-elektroforese, efterfulgt af overførsel til PVDF-membran. Membraner blev blokeret i 5% mælk (vægt /volumen) i Tris-bufret saltvand indeholdende Tween-20 0,5% (TBST) i 2 timer. Egr3 antistof (sc-191 Santa-Cruz Technology, Santa Cruz CA) blev inkuberet natten over ved 4 ° C, efterfulgt af 3 vaske i TBST. Membranerne blev inkuberet med HRP-konjugerede antistoffer i 1 time ved stuetemperatur (RT). Efter 3 vaske i TBST blev membranerne inkuberet med HyGlo-HRP Chemiluminescent kit (Denville Scientific, Metuchen NJ). Membraner blev strippet og testet igen med anti-actin-antistoffer (Santa-Cruz).

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra shSCR-M12 (scramble kontrol) eller shEgr3-M12-celler under anvendelse af RNeasy Plus kit (Qiagen, Valencia CA) ifølge instruktionerne, og resuspenderet i vand. RNA integritet blev vurderet ved elektroforese på formaldehyd agarosegel. Et ug RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af Quanta qScript cDNA Super-mix (5 min ved 25 ° C; 30 min ved 42 ° C; 5 minutter ved 85 ° C) i en thermocycler. Real-time qPCR blev udført på ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, CA) ved anvendelse af standard parametre. Hver prøve blev kørt i fire replikater med dissociationskurve analyse. Forskelle i mRNA-niveauer blev analyseret ved anvendelse af 2

-ΔΔCT metode. GAPDH blev anvendt til at normalisere prøver. Primer sekvenser er tilvejebragt i figur S4.

Reporter Assay

Den menneskelige IL8 promotor (baserne -262 til -55) klonet ind i pGL3 luciferase plasmid og kontrollen pRL-SV40 Renilla luciferase plasmid var en slags gave fra Dr. Carlotta Glackin (City of Hope, Los Angeles, CA) og er blevet beskrevet i Li et al. [35]. IL6-pGL3 Luciferase plasmid indeholdende IL6-promotoren var en gave fra Dr. Steve Cole (UCLA, CA) og er blevet beskrevet i Eickelberg et al. [36]. De shSCR-M12-celler og shEgr3-M12-celler blev udpladet ved en densitet på 20.000 celler /brønd i en hvid plade med 96 brønde dagen før transfektion og dyrket i antibiotika-fri, phenolrødt-frit vækstmedium. Celler blev transficeret med IL6-pGL3 eller IL8-pGL3 plasmider og renilla luciferase plasmid (at normalisere for effektivitet af transfektion og celletal). FuGene transfektionsreagens (Promega, Madison, WI) blev anvendt i henhold til fabrikantens anvisninger med 160 ng pGL3-plasmidet, 40 ng pRL plasmid og 0,6 pi FuGene. To dage senere blev Dual-Glo Luciferase Reagent (Promega) tilsat til vækstmediet (01:01 volumen /volumen) og inkuberet i 10 min RT. Pladerne blev aflæst under anvendelse af en Dynatech ML-3000 luminometer. Reaktionen blev standset ved tilsætning af Dual-Glo Stop Glo reagens, som også initierer renilla luciferase reaktionen i 10 minutter ved stuetemperatur før aflæsning. Forholdet mellem Firefly til Renilla luminescens blev beregnet for hver brønd.

Resultater

Cell type-specifikke RNA Ekspression af Egr3 øges i prostatakræft

Vi analyserede Affymetrix hele genomet ekspressionsdata fra normale og cancerøse prostatavæv at bestemme, om Egr3 udtrykkes differentielt. Affymetrix U133 Plus2.0 genekspression data består af 19 normale prostata prøver (opnået fra 13 donorer) og 108 prostata tumorprøver (opnået fra 84 patienter med prostatakræft, flere prøver fra de samme patienter var til stede i genekspression datasæt). Patient demografiske oplysninger for de 84 kræftpatienter og de 13 normale vævsdonorer er opsummeret i tabel 1. Analyse af de normaliserede udtryk data fra de 127 prostataprøver afslørede, at Egr3 (probe sæt 206115_at) er signifikant overudtrykt i prostatacancer sammenlignet med normal prostatavæv. Mean udtryk i prostatakræft er 5.35 gange højere end i normalt prostata væv og en t-test (

s

= 2 × 10

-15) bekræftede, at denne forskel er stærkt signifikant. Analyse af median ekspressionssystemer værdier afslører også en væsentlig forskel i Egr3 ekspression mellem normale prostata og prostatakræft prøver (data ikke vist). Et histogram af Egr3 ekspression på tværs af alle patienter er vist i figur 1. Egr3 ekspressionssystemer værdier vises som Affymetrix intensitetsværdier stedet afbildes på en log 2 skala til bedre vise deres rækkevidde. Da de gennemsnitlige alder for de tumor-bærende sager adskiller sig fra de normale tilfælde (tabel 1), blev Affymetrix udtryk forskel for Egr3 forhold til listen over tidligere bestemte aldersrelaterede ændringer i Jia et al. [37] baseret på en sammenligning af udtryk data for 15 normale prostata biopsiprøver med en gennemsnitsalder på 54 år til dem, for de 13 hurtige obduktion prøver med en gennemsnitsalder på 84 år. Af de 3400 probe sæt der giver signifikante forskelle identificeret i denne sammenligning blev probe sæt til Egr3 ikke inkluderet. Disse resultater viser, at øget ekspression af Egr3 ikke er forbundet med aldersforskellen mellem normale donorer og prostatacancerpatienter og er forbundet med en eller flere egenskaber specifikke for tumorbærende prostatavæv.

Affymetrix ekspression er afbildet på en lineær skala, hvor den anti-log

2 i hver patients Egr3 ekspression værdi afbildes på y-aksen. Den stiplede linje ved 1292 betegner middelværdien Egr3 intensiteten værdi for alle prøver.

Validering på proteinniveauet med en ekstern datasæt

Selvom Egr3 er opreguleret på mRNA niveau kan det være den Egr3 proteinniveauet, der er vigtig for funktionen af ​​Egr3 i prostatacancer. Som supplement til genekspression data vi udnyttet en

i silico

tilgang til at analysere Egr3 protein niveauer i prostata væv. Det humane protein Atlas (HPA) er en samling af væv microarray data for 20 forskellige typer af cancer og 46 normale væv (https://www.proteinatlas.org). Tissue morfologi og protein ekspressionsmønstre for HPA patientprøver de blev kontrolleret af en bord-certificeret patolog. HPA giver en indikation af protein-ekspression i cancer sammenlignet med normale væv modstykker. HPA billeder blev hentet til yderligere kvantitativ analyse. De tilgængelige prostata væv immunhistokemi billeder til Egr3 farvning består af 20 prostatakræft prøver fra 11 patienter og 3 normale prostata prøver fra 3 donorer.

Vi brugte Aperio ImageScope positive pixel algoritme til at kvantificere intensiteten af ​​Egr3 farvning ( HPA006206). Pseudocolors blev påført som beskrevet i Fremgangsmåder og er vist i figur 2. Selv om kun fire tærskelværdier blev anvendt, de pseudocolored billeder viser klart, at Egr3 farvningsintensitet adskilt epitel-holdige kirtelstrukturer fra andre funktioner såsom stroma (figur 2), hvilket indikerer, at den simple tærskling metoden tilstrækkeligt adskilt glandulær elementer fra alt andet. Stroma var hovedsagelig blottet for Egr3 farvning. For både normale og tumorprøver, det fremherskende anti-Egr3 farvningsmønster var ensartet epitel. Inden epitelceller blev Egr3 farvning observeret i cytosol- membran rum og svagt i kernen

A-B:. HPA normal prostata, patienter 2098 og 2472, hhv. C-D: HPA prostatacancer prøver, patienter 3303 og 3744, hhv. Alle ekstra tilgængelige HPA tilfælde er vist i tillægget oplysninger. E:. Histogram af stærkt positivt pixel-forhold (NSR) for normalt og prostatacancerpatienter

Selv kan forventes transkriptionsfaktorer at lokalisere det meste til kernen, dette farvningsmønster er ikke enestående for Egr3 i humant protein Atlas. Som et eksempel, så vi på farvningen af ​​en velundersøgte transkriptionsfaktor, c-fos. Farvning for c-fos (HPA018531) er for det meste nukleare, men synes også på en cytoplasmatisk-membran lokalisering i fire ud af ti prostatakræft væv, farves positive for c-fos.

Det er også muligt, at Egr3 lokalisering ændres ved patologiske tilstande, som det er tilfældet for transkriptionsfaktoren og tumor suppressor p53, f.eks. Faktisk vildtype p53 akkumuleres i cytoplasmaet af tumorceller i inflammatorisk brystcancer eller neuroblastom, hvilket fører til dets funktionelle inaktivering [38] – [40]. Det kunne være interessant, i fremtiden, for at bekræfte cytoplasmatiske /membran lokalisering af Egr3 og dets relevans.

For at kvantificere Egr3 farvning vi valgt et gennemsnit på 10 kirtel og 10 stroma regioner i hver patientprøve. Hver af de 10 regioner blev afgrænset under anvendelse af et muse-styrede pointer, således at kun regioner af ren histologisk træk såsom kirtler og kirtel-lignende tumor formationer blev medtaget. Den software anerkendt kirtel lumen og pseudolumen trofast og udelukket pixels i disse regioner, så længe pleje blev taget for at udelukke lumen med snavs. De resulterende Egr3 farvning intensitetsværdier fra alle 10 områder for tumor og stroma blev normaliseret separat. Til dette trin af antallet af svage, medium og kraftigt farvede pixels var vægtet (svag = 1, medium = 2, stærk = 3).