PLoS ONE: Blokade af Hedgehog Signaling Synergistisk Øger Følsomhed til epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere i ikke-småcellet lungekræft Cell Lines

Abstrakt

Aberrant aktivering af pindsvin (Hh) signalvejen har været impliceret i epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) og kræft stamceller-lignende celle (CSC) vedligeholdelse Begge processer kan resultere i tumorudvikling og behandling resistens i flere typer af human cancer. Hh samarbejder med den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) signalvejen i embryogenese. Vi fandt, at Hh signalvejen blev stille i EGFR-TKI-følsomme ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler, mens det uhensigtsmæssigt blev aktiveret i EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler, ledsaget af EMT induktion og ABCG2 overekspression. Opregulering af Hh signalering gennem ydre SHH eksponering nedreguleret E-cadherin udtryk og forhøjede Sneglen og ABCG2 udtryk, hvilket resulterer i gefitinib tolerance (

P. 0

001

) i EGFR-TKI-følsomme celler. Blokade af Hh signalvej ved hjælp af SMO antagonist SANT-1 restaurerede E-cadherin udtryk og nedregulere Sneglen og ABCG2 i EGFR-TKI-resistente celler. En kombination af SANT-1 og gefitinib markant hæmmede tumorigenese og proliferation i EGFR-TKI-resistente celler (

P. 0

001

). Disse resultater viser, at hyperaktivitet af Hh-signalering resulterede i EGFR-TKI modstand ved EMT introduktion og ABCG2 opregulering, og blokade af Hh signalering synergistisk øget følsomhed over for EGFR-TKI’er i primære og sekundære resistente NSCLC celler. E-cadherinekspression kan være en potentiel biomarkør for egnetheden af ​​den kombinerede anvendelse af en Hh inhibitor og EGFR-TKI’er i EGFR-TKI-resistente NSCLCs

Henvisning:. Bai XY, Zhang XC, Yang SQ, An SJ, Chen ZH, Su J, et al. (2016) Blokade af Hedgehog Signaling Synergistisk Øger Følsomhed til epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere i ikke-småcellet lungekræft cellelinier. PLoS ONE 11 (3): e0149370. doi: 10,1371 /journal.pone.0149370

Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: December 28, 2014 Accepteret: 31 januar 2016; Udgivet: 4 marts 2016

Copyright: © 2016 Bai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. de Autors har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en førende årsag til kræft død på verdensplan, og udgør en betydelig risiko for menneskers sundhed. Median overlevelse af patienter med fremskreden ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), der modtager standard kemoterapi er kun 9-12 måneder [1]. Fremkomsten af ​​molekylært målrettede behandlinger har kastet meget lys på lungekræft behandling. Epidermal vækstfaktorreceptor tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI’er) er blevet standard first-line behandling for avanceret NSCLC med følsomme EGFR-mutationer [2, 3]. Men næsten alle patienter uundgåeligt udvikle resistens inden for 6-12 måneder efter indledningen af ​​EGFR-TKI-behandling [4]. Selv om flere mekanismer, herunder T790M sekundære mutation [5, 6], MET amplifikation [7, 8], hepatocytvækstfaktor (HGF) overekspression [9], og KRAS mutation [10, 11], er blevet rapporteret, overvinde EGFR -TKI modstand er fortsat en udfordring i klinisk praksis.

Nye beviser tyder på, at induktion af epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) i malignitet resulterer i tumor progression og resistens [12, 13]. Cancer stamceller-lignende celler (CSCS) er en anden grund til resistens over for konventionel tumorterapi [14]. De seneste rapporter angivet, at EMT processer kan generere CSCS [15]. Hedgehog (hh) signalvejen, en vigtig regulator af mange fundamentale processer, nøje regulerer celleproliferation, differentiering, EMT, og stamcelle vedligeholdelse i hvirveldyr fosterudvikling og afvigende Hh aktivering i voksne væv er blevet impliceret i tumorigenese, selvfornyelse og resistens i flere typer af kræft hos mennesker, herunder lungekræft [16-18]. Tre Hh homologer er blevet identificeret hos mennesker: Sonic pindsvin (SHH), indisk pindsvin (IHH), og Desert pindsvin (DHH) [19, 20]. HH signalvejen initieres af Hh ligandbinding til en 12-transmembranprotein, “patched” (ptch). I fravær af Hh ligand, ptch undertrykker aktiviteten af ​​Smoothened (SMO), en G-lignende protein-koblet receptor, ved at forhindre dens lokalisering til den primære cilium. Når Hh binder til ptch, er inhiberingen af ​​SMO lettet, så SMO at translokere til den primære cilium og til at transducere HH signalet til GLI familie af zink-finger transkriptionsfaktorer (GLI1, GLI2, GLI3) [20, 21]. De Glis derefter translokerer ind i kernen for at regulere aktiveringen af ​​Hh target gener involveret i forskellige processer, såsom feedback regulering, proliferation, EMT, og selvfornyelse [22, 23].

under embryogenese, HH signalvejen samvirker med EGFR signalvejen i processen med neocorticale stamcelleproliferation [23]. Akkumulerende data viser, at kooperative interaktioner mellem Hh og EGFR veje resulterer i synergistisk regulering af GLI target genekspression og bidrage til den maligne transformation af kræftceller,

in vitro

in vivo

[24 , 25]. Taget sammen, vi antages, at stimulering af Hh signalvejen kan omgå eller svække den terapeutiske effektivitet af EGFR-TKI’er i NSCLC. Således har vi brugt EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celle modeller først vise, at opregulering af Hh-signalering bidraget til EGFR-TKI-modstand. Vi fandt, at kombinationen af ​​en Hh signalering inhibitor og EGRF-TKI’er havde en markant synergistisk effekt i NSCLC celler.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

Gefitinib blev leveret af AstraZeneca (Cheshire, UK). HH inhibitor SANT-1 blev købt fra Tocris Bioscience. Rekombinant humant Shh N-terminus blev indkøbt fra R Frosne snit (5 um) blev fikseret i kold methanol i 10 minutter og lufttørret. Disse objektglas blev nedsænket i 3% H

2O

2 i 10 minutter for at blokere endogene peroxidaser, derpå inkuberet med 10% gedeserum albumin i 10 minutter ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik antistofbinding. Efterfølgende blev celler farvet med GLI1, E-cadherin, sneglen, og ABCG2 primære antistoffer (1: 100) natten over ved 4 ° C. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med Envision

+ /HRP mod kanin (DAKO GK400305, Glostrup, Danmark) i 30 minutter, efterfulgt af 3,3′-diaminobenzidin (DAB) detektion. Objektglas blev modfarvet med hematoxylin og efter dehydratisering blev monteret permanent. Negative kontroller blev udført i alle tilfælde ved at udelade de primære antistoffer.

Alle objektglas blev vurderet uafhængigt af to patologer, der var blindet til sagen oplysninger. Sager med farvning i 10% af celler blev betragtet som positive. Immunhistokemisk reaktivitet blev bedømt på en skala fra 0 til 3 ifølge farvningsintensitet og procentdelen af ​​immunpositive celler, som følger: 0, ingen farvning, 10% positive celler, 1, svag farvning i 10% af tumorceller eller moderat farvning i 10-40% af tumorcellerne, 2, moderat farvning i 40% af tumorceller eller stærk farvning i 10-40% af tumorcellerne, eller 3, stærk farvning i 40% af tumorcellerne [26].

RNA-isolering og kvantitativ real-time PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIZOL-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fra cellelinierne ifølge producentens instruktioner. Total RNA blev kvantificeret under anvendelse af ultraviolet spektrofotometer (NanoDrop ND-1000). RNA integritet blev vurderet ved anvendelse af 1% denaturerende agarosegelelektroforese. CDNA-syntese blev udført under anvendelse af høje cDNA kapacitet revers transkription kit (ABI, USA) ifølge producentens anvisninger. Q-PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af TaqMan-genekspression mastermix (ABI, USA), blev β-actin anvendt som en endogen kontrol til normalisering af dataene. Alle qPCR reaktioner blev udført tre gange. Primer sekvenser anvendt i denne undersøgelse, var følgende: 5′-AGCGTGAGCCTGAATCTGTG-3 ‘(fremad) og 5′-CAGCATGTACTGGGCTTTGAA-3′ (revers) for GLI1, 5’-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3 ‘(fremad) og 5’-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT- 3 ‘(tilbage) forβ-actin. Den relative RNA udtryk niveau GLI1 blev beregnet med 2

-Δct metoder.

Western blot-analyse

Cell blev dyrket i 25cm

2 kultur flasker og høstet i log- vækstfase for protein ekstraktion. Celle Totalt protein blev ekstraheret fra behandlede celler under anvendelse radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer, suppleret med proteaseinhibitorer PMSF. Proteinkoncentrationen af ​​hver lysat blev bestemt under anvendelse af bicinchoninsyre-assay. Proteiner (30 ug /brønd) blev separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Proteinerne blev blokeret med 5% Proteiner fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner blev påvist ved inkubering af membranerne i nærvær af de følgende primære antistoffer: GAPDH (1: 1000), ABCG2 (1: 500), snail (1: 500), E-cadherin (1: 500) og Gli1 (1 : 500) og derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof ved stuetemperatur i 1 time. Antistofbinding påvist ved en forøget kemiluminescens-kit (Thermo, Rockford, IL, USA).

Film blev scannet og analyseret med billede J software for protein kvantificering. De relative proteinniveauer blev talt under anvendelse af en sammenligning med ubehandlede kontrol.

Celleproliferationsassay

Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 2.000 /brønd i PC9, 3.000 /brønd i H1975, og 1.500 /brønd i A549. Efter natten over fastgørelse blev celler behandlet med fem gentagelser, med SHH-N 1 ug /ml (R . SPSS Inc., Chicago, IL). Resultaterne er vist som middelværdi ± SE for mindst tre forsøg. Først blev data testet for en normalfordeling og homoscedasticity. Forskelle i Q-PCR, Western blot værdier grå skala, og celle-klon dannelse, mellem grupper blev vurderet ved envejs ANOVA, var forskelle i celledeling testet af en faktoranalyse, og koncerninterne forskelle blev evalueret ved brug af LSD test, hvis de data, blev normalfordelt og viste homoscedasticity. Ellers blev en Welch test anvendt, og koncerninterne forskelle blev vurderet ved anvendelse af Dunnetts T3 test. Forskelle i klassificeret data mellem grupper blev vurderet ved hjælp af en Kruskal-Wallis H-test. Korrelationer af sorteret data blev analyseret under anvendelse Spearman rang korrelation test.

P

værdier 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans i alle tilfælde.

Resultater

Forskelle i Hh signalvej aktivitet mellem EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler

For at vurdere Hh signalvej forskelle mellem EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler, tre NSCLC cellelinjer, PC9, H1975, og A549, huser forskellige mutationer og med forskellig følsomhed over for TKI’er blev anvendt. Første, ekspression af GLI1, en markør for aktivering af Hh signalvejen, blev bestemt ved immunocytokemi. Som vist i fig 1A, blev GLI1 udtrykt i kerner af EGFR-TKI-resistente cellelinier A549 og H1975, men GLI1 ekspression var negativ i EGFR-TKI-sensitive cellelinie PC9. Vi bekræftede dette resultat med Q-PCR og Western blot-analyse. Som vist i figur 1B og 1C, blev GLI1 udtrykt på et meget lavt niveau i PC9 sammenlignet med H1975 og A549 celler

(P . 0

001

P = 0

.

005

henholdsvis). Tidligere undersøgelser indikerede, at Hh-signalering regulerer EMT via opregulering af transkriptionsfaktoren Sneglen og nedregulering af E-cadherin [27, 28]. Stamcelle markør ABCG2 er også et direkte mål for den Hh signalvejen [29]. For yderligere at tydeliggøre Hh pathway forskelle mellem EGFR-TKI-sensitive og resistente celler, blev disse tre vigtige nedstrøms målgener undersøgt ved Western blotting. Vi fandt, at Snail udtryk var betydeligt svagere i EGFR-TKI-sensitive PC9 cellelinje sammenlignet med de EGFR-TKI-resistente cellelinier H1975 og A549 (

P

= 0,001). E-cadherinekspression i PC9 celler var ganske høj, mens dens udtryk var meget svag i EGFR-TKI-resistente cellelinier H1975 og A549 (

P

0,001, Fig 1D). Dette resultat var konsistent med tidligere rapporter, der snegl ekspression blev omvendt korreleret med den for E-cadherin [30, 31]. ABCG2 udtryk var også helt høj i EGFR-TKI-resistente cellelinier H1975 og A549 sammenligne med sit udtryk i EGFR-TKI-sensitive PC9 cellelinje (

P

0,001, Fig 1D). Tilsammen viste disse resultater en signifikant forskel i aktiviteten af ​​Hh signalvejen mellem EGFR-TKI-sensitive og -resistente celler. HH signalvej blev aberrerende aktiveret i EGFR-TKI-resistente celler, mens det blev stille i EGFR-TKI-sensitive celler.

(A). Forskelle i GLI1 udtryk i EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler bestemt med immuncytokemi. GLI1 blev udtrykt i kerner af EGFR-TKI-resistente cellelinier A549 og H1975, men GLI1 udtryk var negativ i EGFR-TKI-sensitive cellelinje PC9. (B). Relativ GLI1 mRNA-ekspression i EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler bestemt ved Q-PCR; Udtrykket af PC9 var signifikant lavere end for H1975 og A549; ** (

P

0,01). (C). Forskelle i GLI1 udtryk i EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler bestemt ved western blot. (D) Forskelle i E-cadherin, sneglen, og ABCG2 udtryk i EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler bestemt ved western blot.

opregulering af Hh signalvej aktivitet ved udsættelse for SHH bly til gefitinib tolerance ledsaget af EMT induktion og ABCG2 opregulering i EGFR-TKI-sensitive NSCLC celler

på baggrund af ovenstående resultater, vi hypotese, at afvigende aktivering af Hh signalvejen kan bidrage til EGFR-TKI modstand i NSCLC ved at påvirke EMT og CSC vedligeholdelse. For at undersøge denne mulighed, testede vi rolle Shh signalering i NSCLC celler. Først blev EGFR-TKI-sensitive PC9 celler behandlet med N-Shh (0,5 ug /ml). Immuncytokemi Resultatet viste, at GLI1 ekspression i PC9 celler var negativ uden eksponering for N-Shh, men det blev udtrykt i kerner efter N-Shh behandling i 24 og 48 timer (Fig 2A). Western blotting og Q-PCR-resultater viste, at GLI1 udtryk tydeligvis blev ophøjet efter eksponering for N-Shh i 24 timer og 48 timer (

P

= 0,008 og

P

0,001 henholdsvis; Fig 2B og 2C). Disse resultater viste, at Hh-signalering blev aktiveret ved ydre N-Shh i PC9 celler.

(A) Immuncytokemisk analyse af GLI1 i PC9 celler efter N-Shh (0,5 ug /ml) behandling i 0, 24, og 48h. GLI1 ekspression i PC9 celler var negativ uden eksponering for N-Shh. GLI1 blev udtrykt i kerner efter N-Shh behandling for 24 og 48 timer. (B) Western blot-analyse af GLI1 i PC9 celler efter N-Shh (0,5 ug /ml) behandling i 0, 24 og 48 timer. (C) Q-PCR-analyse af GLI1 mRNA relative ekspression i PC9 celler efter N-Shh (0,5 ug /ml) behandling i 0, 24 og 48 timer; GLI1 udtryk var tydeligvis forhøjet efter eksponering for N-Shh i 24 timer og 48 h; ** (

P

0,01). (D) Proliferation af PC9 celler blev vurderet ved MTT-assay efter behandling med de angivne koncentrationer af gefitinib med eller uden præ-eksponering for ydre N-Shh (0,5 ug /ml) i 24 timer; sammenlignet med den gefitinibs single-agent gruppe, udsættelse for ydre N-Shh signifikant øget gefitinibs tolerance i PC9 celler ** (

P

0,01). (E) Western blot analyse af E-Cadherin, Sneglen og ABCG2 i PC9 celler efter N-Shh (0,5 ug /ml) behandling for 0, 24, og 48 timer.

Næste, EGFR-TKI -følsom celler PC9 blev behandlet med stigende koncentrationer af gefitinib med eller uden udsættelse for ydre N-Shh (0,5 ug /ml) og derefter deres levedygtighed blev vurderet. Vores resultater viste, at sammenlignet med den gefitinibs single-agent gruppe, udsættelse for ydre N-Shh signifikant øget gefitinibs tolerance i PC9 celler (

P

= 0,001, Fig 2D og S1 og S2 Tables). Disse resultater viser, at afvigende aktivering af Shh signalvejen fører til EGFR-TKI modstand i NSCLC celler.

For at undersøge de molekylære mekanismer bag bidrag Shh signalering til EGFR-TKI modstand i NSCLC celler undersøgte vi Snail , E-cadherin, og ABCG2 ekspression ved 0, 24 og 48 timer efter behandling af PC9 celler med N-Shh (0,5 ug /ml) ved Western blotting. Som vist i fig 2E, efter eksponering for N-Shh i 24 timer blev ekspressionen af ​​Snail forhøjet (

P

0,001), ekspressionen af ​​E-cadherin var naturligvis svækkede (

P

= 0,003), og ABCG2 udtryk blev markant opreguleret i PC9 celler (

P

= 0,008). Disse effekter blev opretholdt i 48 timer efter N-Shh stimulering. Disse resultater bekræftede, at hyperaktivering af Hh-signalering bidraget til EGFR-TKI modstand i NSCLC celler gennem aktivering af EMT omstilling og ABCG2 opregulering.

Hh hæmning vendt EMT induktion og nedsat ABCG2 udtryk i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler

Næste yderligere at vurdere de molekylære mekanismer i Hh-signalering i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler, undersøgte vi GLI1, Snail, E-cadherin, og ABCG2 udtryk ved 0, 24, og 48 timer efter behandling de EGFR-TKI-resistente cellelinier H1975 og A549 med SANT-1 (40 uM). Resultaterne viste, at efter behandling med SANT-1 i 24 timer, blev GLI1 udtryk nedreguleret (

P

0,001) og Snail ekspression blev svækket betydeligt i begge cellelinier (

P

0.001 og

P

= 0,003 henholdsvis); efter behandling med SANT-1 i 48 timer, snail ekspression var næsten fraværende i H1975 celler (Fig 3A og 3B). Omvendt blev E-cadherinekspression forhøjet betydeligt efter behandling af EGFR-TKI-resistente cellelinier med SANT-1 i 48 h (

P

0,001). ABCG2 ekspression var ubetydelig efter SANT-1 behandling i 24 timer (Fig 3A og 3B). Disse resultater viste, at Hh inhibering tilbageføres EMT og reducerede ABCG2 ekspression i EGFR-TKI-resistente NSCLC celler.

(A) og (B), Western blot-analyse af Hh-signalering pathway aktivitet og dets målgener E -Cadherin, sneglen og ABCG2 i EGFR-resistente celler A549 og H1975 efter SANT-1 behandling for 0, 24, og 48 timer. (C) og (D), kolonidannelse kvantitativ analyse i A549 og H1975 celler; gefitinib alene eller Sant1 alene ikke hæmme klonogene vækst effektivt. Men kolonier meget knapt dannet i gruppen udsat for kombineret SANT-1 og gefitinib behandling i A549 og H1975 celler; * (

P

0,05), ** (

P

0,01). (E) og (F), spredning af A549 og H1975-celler blev vurderet ved MTT-assay efter behandling med de angivne koncentrationer af gefitinib alene, SANT-1 alene, eller kombinationen af ​​gefitinib og Sant-1; * (

P 0

05.)

, ** (

P. 0

01

).

kombinationen af ​​gefitinib og SANT-1 synergistisk hæmmede tumorigenese og proliferation i EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinier

for yderligere at demonstrere rolle Hh signalvejen i NSCLC celler, vi blokerede Hh signalering ved hjælp af SMO inhibitor SANT-1. IC

50 SANT-1 i de fleste NSCLC cellelinjer er ~ 40 pM [18], og IC

50 af gefitinib i EGFR-TKI-sensitive celler er ~ 20 nM [32]. Således EGFR-TKI-resistente cellelinier A549 og H1975were behandlet med 40 pM SANT-1 alene, 20 nM gefitinib alene, eller en kombination af SANT-1 og gefitinib. Som vist i figur 3C og 3D, SANT-1 og gefitinib alene ikke hæmme klonogene vækst (

P

= 0,252 og

P

= 0,187 henholdsvis). Men kolonier meget knapt dannet i gruppen udsat for kombineret SANT-1 og gefitinib behandling (

P

0,001). Disse resultater indikerer, at SANT-1 og gefitinib kan have en synergistisk virkning i EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler. For at bekræfte dette, vi behandlede EGFR-TKI-resistente NSCLC cellelinjer A549 og H1975 med stigende koncentrationer af SANT-1 alene, gefitinib alene og kombinationer af SANT-1 og gefitinib, og derefter vurderet deres proliferation. Resultaterne viste, at A549-celler var resistente ikke blot at gefitinib men også til Sant-1 (

P

= 0,503, Fig 3E og S3 og S4 tabeller). Dette resultat er i overensstemmelse med en tidligere rapport, at A549-celler viste hyperaktivering af Hh-signalering, men var resistente over for Hh-signalering inhibitorer [18]. Kombinationen af ​​gefitinib og Sant-1 inhiberede proliferation af A549-celler (

P

0,001, Fig 3E og S3 og S4 tabellerne). Selv sammenlignet med gefitinib, SANT-1 var mere effektiv i H1975 celler (

P

= 0,002), viste H1975 celler den “bedste” svar på kombinationen af ​​gefitinib + Sant1 (

P

0,001, fig 3F og S5 og S6 tabellerne). Samlet set viser disse resultater bekræftede, at kombinationen af ​​en Hh-signalering inhibitor og EGFR-TKI’er havde markeret synergistiske virkninger på EGFR-TKI-resistente NSCLC celler.

Aktivitet af Hh signalvejen i EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC væv

for yderligere at forstå forskellen i Hh signalvejen aktivitet mellem EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLCs, udtryk for GLI1, ABCG2, sneglen, og E-cadherin blev vurderet ved IHC i fire NSCLC væv, som indeholdt EGFR exon 19 deletion eller L858R mutation, fire væv, som indeholdt EGFR T790M sekundære mutation og fire væv, som indeholdt KRAS-mutationen (Fig 4). Resultaterne indikerede, at GLI1 blev udtrykt i begge EGFR-TKI-følsomme og -resistente væv. På grund af den lille størrelse af prøverne viste GLI1 udtryk ingen statistisk signifikant forskel mellem de tre grupper (

P

= 0,108). middelværdien rang af EGFR-TKI-følsomme væv var imidlertid 5,25, der af sekundære resistente mutation væv var 4,88, og den gennemsnitlige rang af KRAS mutation væv var 9,38. Således blev en tendens mod højere GLI1 ekspression fundet i væv, som indeholdt KRAS mutation (tabel 1 og 2). KRAS mutation-husly NSCLCs kan have højere Hh signalvej aktivitet sammenlignet med dem med EGFR-TKI-følsomme mutationer og sekundære resistente mutationer.

(A) og (B), negativ kontrol og positive GLI1 udtryk i NSCLC væv . (C) og (D), negativ kontrol og positive E-cadherin-ekspression i NSCLC væv. (E) og (F), negativ kontrol og positive Snail udtryk i NSCLC væv. (G) og (H), negativ og positiv ABCG2 udtryk i NSCLC væv. Vejviser

ABCG2 udtryk ikke signifikant blandt EGFR-TKI-følsomme, sekundære resistente, og primære resistente NSCLC væv (

P

= 0,340). E-cadherin var moderat eller stærkt udtrykt i de fleste NSCLC væv (9/12,

P

= 0,555). Omvendt Snail var negativ eller svagt udtrykt i de fleste væv (11/12,

P

= 0,658) (tabel 1 og 2).

Correlation analyse viste, at E-cadherinekspression var signifikant negativt korreleret med Snail udtryk (

r

= 0,582,

P

= 0,047). Dette resultat var konsistent med cellen eksperimenter. Desuden blev GLI1 udtryk negativt korreleret med E-cadherinekspression (

r

= 0,408,

P

= 0,188), og positivt korreleret med Snail (

r

= 0,372,

P

= 0.300) og ABCG2 (

r

= 0,386,

P

= 0,215) udtryk. Selvom korrelationerne manglede statistisk signifikans på grund af den lille stikprøve, tendensen var i overensstemmelse med de celle eksperimenter.

Diskussion

Hh signalvej er en effektiv terapeutisk mål i behandling og forebyggelse af mange typer af human cancer. Uhensigtsmæssig aktivering af Hh signalvejen er blevet rapporteret i NSCLC [17, 18, 33, 34]. Tidligere undersøgelser har vist, at EMT induktion er forbundet med følsomhed over for EGFR-TKI i lungekræft [35-37]. Pindsvinesignaleringsvejen stramt regulerer EMT induktion gennem dens downstream målgener, såsom sneglen, ZEB1, og TWIST2 [22]. Nedregulering eller tab af E-cadherin udtryk er kendetegnende for EMT af fosterudviklingen og kræft progression. Snegl ekspression er omvendt korreleret med E-cadherin i epiteliale tumorcellelinier [30, 31]. ABCG2 er en af ​​de største multilægemiddelresistens (MDR) pumper; det er også en stamcelle markør og er tæt forbundet med resistens over for flere lægemidler [38, 39]. HH signalvej direkte regulerer aktiviteten af ​​ABCG2 [29]. Hh antagonister kan inhibere aktiviteten af ​​ABCG2 og resensitize NSCLC celler til mitoxantron og topotecan

in vitro

[40]. Hh og EGFR signalering samvirkende regulere stamcelle proliferation i den postnatale og voksne hjerne [23, 41]. Samtidig blokade af Hh og EGFR signalering hæmmede proliferation og apoptose, og forbedret de cytotoksiske virkninger af docetaxel i metastatisk prostatacancer celler [42]. På denne baggrund, vi hypotese, at den Hh signalvejen kan bidrage til EGFR-TKI modstand i NSCLC med disreguleret EMT og ABCG2 aktivitet.

For at tydeliggøre forbindelsen mellem Hh signalering og EGFR-TKI modstand, vi først evalueres forskelle i Hh signalering mellem EGFR-TKI-følsomme og resistente NSCLC celler. Resultaterne viste, at Hh signalvejen aberrerende blev aktiveret, ledsaget af induktionen af ​​et EMT fænotype og ABCG2 overekspression, i EGFR-TKI-resistente celler, hvorimod Hh pathway blev stille i EGFR-TKI-sensitive celler. Forskellen i Hh signalering aktivitet mellem EGFR-TKI-sensitive og resistente celler foreslog, at afvigende aktivering af Hh signalvejen kan bidrager til EGFR-TKI modstand ved at inducere en EMT fænotype og ABCG2 opregulering. For at bekræfte disse resultater, blev Hh signalering opreguleret ved hjælp ydre SHH i EGFR-TKI-sensitive PC9 cellelinje. Opregulering af Hh aktivitet resulterede i induktion af EMT og elevation af ABCG2 udtryk. Hh signalering hyperaktivitet resulterede også i EGFR-TKI tolerance i ellers EGFR-TKI-sensitive celler. Disse resultater bekræftede, at afvigende aktivering af Hh-signalering resulteret i udviklingen af ​​EGFR-TKI-resistens i NSCLC celler gennem induktion af EMT og ABCG2 overekspression. Hæmning af Hh-signalering af Hh inhibitor SANT-1 udvidet E-cadherin udtryk og nedreguleret Sneglen og ABCG2 udtryk. Dette resultat viste, at blokade af Hh-signalering kan vende EMT fænotype og måske reducere CSC overflod. En tidligere undersøgelse viste, at genoprette E-cadherinekspression øget følsomhed over for EGFR-TKI’er

in vitro

in vivo

[38]. Baseret på disse resultater, havde vi grund til at tro, at målrette Hh signalvejen kan påvirke EGFR-TKI modstand i NSCLC celler. Således har vi næste behandlet EGFR-TKI-resistente celler med gefitinib eller SANT-1 alene eller gefitinib plus SANT-1. Resultaterne indikerede, at sammenlignet med enten gefitinib eller SANT-1 alene, kombinationen af ​​gefitinib plus SANT-1 inhiberede signifikant tumorigenese og cellelevedygtighed. Tilsammen vores resultater tyder associationer blandt Hh-signalering, EMT, ABCG2 overekspression, og EGFR-TKI resistens i NSCLC-celler for første gang.

Deregulering af Hh-signalering bidrager til tumorigenese eller accelererer tumorvækst i et HH-ligand -uafhængige eller -afhængig måde [43]. I de fleste basalcellekarcinomer (BCC) og medulloblastomer, tab af funktion mutationer i ptch og få-of-funktion mutationer i SMO både bly til ligand-uafhængig, mutation-drevet aktivering af Hh vej [44-46]. Denne type tumor kan have gavn af behandling med en enkelt Hh inhibitor.