PLoS ONE: Lgr5 Methylering i Cancer Stem Cell Differentiering og Prognose-forudsigelse i kolorektal Cancer

Abstrakt

Målsætning

Leucin-rig-gentag-holdige G-protein-koblede receptor 5 (lgr5 ) er en kandidat markør for kolorektal cancer stamceller (CSC). I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi status methylering inden thelgr5 promotor og evalueret sit forhold til CSC differentiering, prognose for tarmkræft, og dets klinisk-patologiske træk.

Metoder

status methylering inden Lgr5 promotor blev påvist med en methyleringsspecifik PCR i seks kolorektale cancercellelinjer samt 169 primære colorektale tumorvæv. Differentiering af CSC blev undersøgt med immunofluorescens og immuncytokemi. Nedregulering af lgr5 blev opnået med gen-specifikke siRNA. Foreningerne mellem lgr5 methylering og klinisk-patologiske træk samt overlevelse af patienter blev analyseret med statistiske metoder.

Resultater

lgr5 promotor blev methyleret til forskellige grader for de undersøgte seks kolorektale cellelinjer, med komplet methylering observeret i HCT116 celler, hvor lgr5 udtryk blev delvist genvundet efter DAC behandling. Det stamceller sfære dannelse fra HCT116 celler blev ledsaget af stigende methylering i lgr5 promotoren og faldende udtryk for lgr5. Vælte lgr5 af siRNA også ført til stamcelle sfærer formation. Blandt primære kolorektale tumorer, 40% (67/169) var positive for lgr5 methylering, mens ingen af ​​de normale colon væv var positive for lgr5 methylering. Desuden lgr5 methylering signifikant associeret med højere tumor kvalitet, og negativ fjernmetastaser (p 0,05), samt bedre prognose (p = 0,001) hos patienter med colorectal cancer

Konklusioner

Vores data tyder på, at lgr5 methylering, gennem regulering af lgr5 udtryk og kolorektal CSC differentiering, kan udgøre en ny prognostisk markør for kolorektal kræftpatienter

Henvisning:. Su S, Hong F, Liang Y, Zhou J, Liang Y, Chen K, et al. (2015) Lgr5 Methylering i Cancer Stem Cell Differentiering og Prognose-forudsigelse i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (11): e0143513. doi: 10,1371 /journal.pone.0143513

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: Marts 20, 2015; Accepteret: 5. november 2015; Udgivet: November 24, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed: Relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Projektet var delvist støttet af National Naturvidenskab fundament Kina (NSFC. NO. 81.302.156), Guangzhou Pilotprojekt for Klinisk og Translational Research center (tidlige gastrointestinale kræftformer, No.7415696196402), Guangdong Provincial Bio-engineering Forskningscenter for Gastroenterology Sygdomme. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Akkumulerende beviser understøtter hypotesen om, at et lille antal udifferentierede stamceller eller stamceller-lignende celler, såkaldte cancer stamceller (CSC), er ansvarlige for tumor initiering, udvikling, vedligeholdelse, formidling, regenerering og terapeutisk modstand . Senere blev tilstedeværelsen af ​​CSC bekræftet i en række faste cancere, såsom brystcancer [1, 2], glioblastomer [3], hepatocellulære carcinomer [4], og så videre, hvilket blev opnået ved hjælp af, og til gengæld fremmet identifikationen af ​​mange tumorspecifikke celleoverfladeantigener, også kendt som CSC markører. For tarmkræft har flere CSC markører blevet identificeret, herunder CD133 [5, 6], EpCAM /CD44 /CD166 [7], CD24 /CD29 [8] og lgr5 [9, 10]. Imidlertid vides der kun lidt om den biologiske betydning af disse markører, som kan have betydelige virkninger i multilineage differentiation kapacitet CSC [8].

Blandt de kolorektale CSC markører, lgr5, også kendt som GPR49, er en sjældne G-protein-koblet receptor (GPCR), der hører til leucin-rige repeat-holdige GPCR [11]. For nylig blev det rapporteret, at lgr5 er positiv i stamceller i tyndtarmen, tyktarmen og hårsækken [9, 12, 13], hvilket tyder på potentiel betydning lgr5 i stamcellebiologiske. Konsekvent, de lgr5-udtrykkende stamceller var i stand til at bygge organoide strukturer in vitro, som eksperimentelt blev påvist i tarmen [14-16], mave [17] og lever [18]. Desuden blev de modtagende mus med overfladisk beskadigede koloner transplanteret med organoids afledt fra et enkelt Lgr5

+ kolon stamcelle efter omfattende in vitro ekspansion dermed dannede selvfornyende krypter, der var funktionelt og histologisk normal [15]. Tværtimod den lgr5-null mus udviste neonatal letalitet på grund ankyloglossia og mave distension [19]. Opreguleringen af ​​lgr5 er blevet rapporteret i mange humane faste tumorer, såsom hepatocellulært karcinom [20, 21], kolon [22], ovarietumorer [22], basalcellecarcinom [23] og gastrisk cancer [24]. Funktionelt, forstærkede lgr5 fremmes ekspressionen cancercelleproliferation og tumorigenicitet [23], mens inaktivering af lgr5 reduceret proliferation, migration og kolonidannelse, tumorigenicitet [25] og induceret cellulær apoptose [22]. Lgr5 er en nedstrøms mål for Wnt-β-catenin signalvej [26]. I intakte dyr, lgr5 var en del af en negativ feedback loop finjustere Wnt signalering under tarm morfogenese. Lgr5 mangel induceret for tidlig differentiering af Paneth celler, hvilket er samtidig med opregulering af Wnt aktivitet, hvilket indebærer lgr5 er en negativ regulator af Wnt signalering i progenitorceller af den udviklende tarmen [27]. Desuden lgr5 homologer er fakultative Wnt receptor komponenter, der medierer Wnt signal forstærkning af opløselige R-spondin proteiner [28].

Stigende beviser peger på vigtigheden af ​​lgr5, på forskellige udtryksmæssige niveauer, forskellige sygdomstilstande paradigmer og udviklingstrin. Men de underliggende mekanismer for udtryksmæssige regulering på lgr5 stadig undvigende.

DNA methylering er blevet påvist som en vigtig epigenetisk mekanisme til inaktivering gener under tumorudvikling [29, 30]. For nylig er der stadigt stigende undersøgelser, der afslører, at methylering af nogle gener regulerer udvikling, progression, og gentagelse af tumorer [31-33], hvoraf omfatter kolorektal cancer [34]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi status for methylering af CpG-øer i umiddelbar promotorregion af lgr5 genet i kolorektale cancer-cellelinjer og tumorvæv, og analyseret dets associering med CSC differentiering, klinisk-patologiske træk, samt prognosen for patienter med colorectal kræftformer.

Materialer og metoder

Cell kultur og behandling

kolorektal cancer cellelinjer (HCT116, SW480, HT29, LoVo, Colo205, SW620, SW1116) blev opnået fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Holly blade, Beijing, Kina). For demethylering behandling blev dyrkede celler inkuberet med 3 uM 5-aza-2′-deoxycytidin (DAC, Sigma, St. Louis, MO) i 72 timer med medium skiftes hver dag. Mock lægemiddelbehandlinger blev udført parallelt med PBS (pH 7,4).

Menneskelige vævsprøver og patientinformation

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i det sydlige Medical University (Guangzhou, Kina) og skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagere. 169 patienter (gennemsnitsalder 57 ± 22,3 år) blev diagnosticeret med sporadisk kolorektal cancer i Dept. of Pathology (Nanfang Hospital, Southern Medical University) mellem 1999 og 2001. Alle diagnoser blev etableret baseret på histologiske undersøgelser af standard HE-farvede sektioner efter WHO retningslinjer. Tumorer blev iscenesat baseret på Dukes iscenesættelse system. Disse patienter fik ikke neoadjuverende radio-kemoterapi heller ikke de har nogen complicattions med andre kendte maligne sygdomme på tidspunktet for diagnosen. Patienterne døde inden for seks måneder efter kirurgisk resektion blev udelukket.

Western blotting analyse

25 ug af det totale protein blev inkuberet med denaturering buffer (0,3 M Tris pH 6,8, 10% 2-mercaptoethanol, 40% glycerol, 20% SDS, 0,02% bromphenolblåt) i 5 minutter ved 95 ° C, sat på en 10% SDS-polyacrylamidgel til elektroforese, overført til PVDF-membraner, blokeret i 5% fedtfri mælk /TBS-Tween i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet natten over ved 4 ° C i et primært antistof mod lgr5 (1: 500, Abcam, Cambridge, MA) eller en muse-alfa-tubulin-antistof (intern kontrol, 1: 1,000, Cell Signaling, Danvers, MA). Membraner blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Immunreaktivitet blev detekteret kemiluminescens (Pierce, Rockford, IL).

RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 2 pg total RNA blev underkastet den første-streng cDNA-syntese (Fermentas, Ontario, Canada) ifølge fabrikantens instruktioner. Primer sekvenser for RT-PCR blev anført i tabel 1, med GAPDH anvendt som en intern kontrol.

dna-ekstraktion, methylering-specifik PCR (MSP) og bisulfit sekventering PCR (BSP)

Genomisk DNA blev ekstraheret fra cellelinier eller primære tumorer efter en standard phenol-chloroform ekstraktion metode (Qiagen, Valencia, CA). Hydrogensulfit modifikation af genomisk DNA blev udført under anvendelse af EZ DNA-methylering kit (Zymo Research, Orange, CA). Methyleringsmønsteret i CpG-øer i lgr5 promotoren blev bestemt ved MSP ved hjælp af bisulfit-behandlet DNA som skabelon og MSP-primere anført i tabel 1. MSP primere blev udformet efter princippet som beskrevet tidligere [35] og testet for ikke amplifikation ikke- bisulfited DNA. MSP blev udført ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 38 cyklusser ved 94 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek, derefter ved en 5-min forlængelse ved 72 ° C. MSP blev derefter separeret på 1,5% agarosegeler farvet med ethiium bromid og visualiseret under UV-spektrofotometer. Vand blanks blev anvendt som negativ kontrol.

I bisulfit sekventering BSP primere (tabel 1) blev anvendt til at amplificere et 428 bp fragment, der dækker promotor-exon 1 (-362 til +96) region af lgr5 gen. BSP primere blev udformet til ikke at dække eventuelle CpG sites. PCR-produkterne blev derefter subklonet i pCR2.1-TOPO (Invitrogen) plasmider og plasmid DNA fra fem bakterielle kloner blev udvalgt til DNA-sekventering ifølge tidligere beskrevet [36].

Stem cell sfære dannelse og differentiering

For at undersøge stamceller sfære dannelse, 5 × 10

5 HCT116-celler blev dyrket i 60-mm dyrkningsskål i suspension i serum-frit DMEM /F12 (Gibco, Carlsbad, CA), suppleret med B27 ( 01:50, Invitrogen), 40 ng /ml EGF (Sigma) og 20 ng /ml FGF-2 (Chemicon, Billerica, MA), 100 U /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycin (Gibco, Australien). CSC sfærer begyndte at dannes ca. to uger senere. For at inducere CSC differentiering blev CSC kugler vasket med PBS tre gange og derefter dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycin. Nuklear syre og protein blev ekstraheret fra disse celler på dag 0, 1, 3 og 7, henholdsvis som beskrevet [37-39]. Alle celler blev dyrket ved 37 0C i en fugtighed atmosfære indeholdende 5% CO2.

Immunofluorescens (IF) og immunhistokemi (IHC)

For IF, blev CSC kugler fikseret med 4% formaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter permeabiliseret med PBS indeholdende 0,1% Triton X-100. Efter blokering med 1% bovint serumalbumin i 20 minutter ved stuetemperatur blev CSC kugler inkuberet med primært muse-monoklonalt antistof CK20 (1: 300, Santa Cruz, CA) ved 4 ° C natten over og derefter med FITC-konjugeret anti-kanin IgG (Santa Cruz).

i IHC beskrevet som vores tidligere metoder [40], formalin-fikserede paraffin-indlejrede vævssnit blev afvoksede i xylen og hydreret med destilleret vand., og blev udført varme medieret antigen-genvinding med citratbuffer pH 6,0 og blok med 3% BSA. Objektglassene blev efterfølgende inkuberet med lgr5 antistof (1: 300, # 137.484, Abcam) ved 4 ° C natten over, med signalet forstærkes og udviklet ved hjælp af ABC-systemet og DAB-substrat chromogen (Maixin Bio, Kina) henholdsvis følgende ved haematoxylin kontrastfarvning. Ekspression blev anset for at være “positiv”, hvor 10% eller flere cancerceller blev farvet.

Transfektion af lille interfererende RNA (siRNA)

targeting sekvens for lgr5-specifikke siRNA nukleotider var 5 ‘ -GATCTGTCTTACAACCTAT-3 ‘og den krypterede siRNA sekvensen 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’ blev anvendt som kontrol. Begge siRNA-duplexer blev syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina). Transfektion blev udført ved anvendelse af lipofectamin transfektionsreagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

Statistisk analyse

For at vurdere den uafhængige korrelation af lgr5 methylering med andre variabler, blev udført multivariat logistisk regressionsanalyse. For overlevelse analyse blev Kaplan-Meier-metoden anvendes til at vurdere overlevelsestid fordeling i forhold til lgr5 methylering.

s

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Lgr5 blev forskelligt methyleret i kolorektale cancer cellelinjer

For at teste potentialet i DNA-methylering i regulering lgr5 ekspression, vi først undersøgt ekspressionen af ​​lgr5 i syv kolorektale cancercellelinjer og dens ændring i respons til 5-aza-2′-deoxycytidin (DAC), den klassiske methylering inhibitor. Som vist i fig 1A og 1B, for HCT116, SW480 og SW620 celler, lgr5 ekspression på begge steady-state-mRNA og proteinniveauet blev opreguleret som respons på DAC behandling, hvilket tyder lgr5 ekspression kunne inhiberes i disse celler via DNA-methylering. I modsætning hertil ekspression i SW1116, LoVo, HT29 og Colo205 celler blev ikke dramatisk ændret efter DAC behandling, hvilket indebærer en irrelevans methylering involverede mekanismer. I overensstemmelse med disse observationer har vi registreret fuldstændig methylering af promotorregionen CpG-øer i HCT116-celler, delvis methylering i SW480 og SW620 celler og ingen methylering i HT29, Colo205, SW1116 eller LoVo-celler (Fig 1C) ved MSP-analyse. Nøjagtigheden af ​​MSP-analysen blev yderligere bekræftet med bisulfit sekventering (Fig 1D). Derfor ekspressionen af ​​lgr5 i disse cancercellelinier godt korreleret med status for methylering af promotoren CpG-øer, støtte DNA methylering som en mekanisme til regulering lgr5 niveau.

A. Totalt RNA blev ekstraheret fra angivne celler uden (-) eller med (+) DAC behandling og RT-PCR blev udført for at undersøge lgr5 steady-state-mRNA-niveau, med GAPDH som en intern kontrol. B. protein niveau lgr5 blev målt i alle syv kolorektal cancer celler behandlet som i A med western blot analyse. α-tubulin blev anvendt som en intern kontrol. C. DNA status for methylering af en CpG ø i den proximale promotorregion af lgr5 genet blev bestemt med MSP-analyse. M, methylering signal; U, unmethylation signal.

dd

H2O, vand der ikke indeholdt genomisk DNA. D. Methylering densitet inden den proximale promotorregion af lgr5 genet i syv kolorektal cancer cellelinjer blev bestemt ved BSP analyse. Øvre panel, diagram over fordelingen af ​​bindingssteder for CpG i 5′-UTR af lgr5 genet. Hver lodret bjælke repræsenterede et CpG site. Lavere panel, BSP 14 CpG websteder inden -150 til 42 region i forhold til transskription stjerne stedet (TSS) i syv kolorektale cancer cellelinjer. Hver række repræsenterer et individuelt klonet allel, der blev sekventeret efter bisulfit DNA modifikation. Cirkler repræsenterer CpG sites og deres indbyrdes afstand nøjagtigt afspejler CpG densitet regionen. Sort cirkel, methylerede CpG sted; hvid cirkel, umethyleret CpG site.

Lgr5 methylering korreleret med CSC- differentiering in vitro

Som tidligere rapporteret, lgr5 udtryk var højere i udifferentierede celler i forhold til differentierede celler i kolorektal cancer [9]. For at undersøge inddragelsen af ​​lgr5 DNA-methylering i CSC differentiering, vi afledt cancer stamceller eller stamceller-lignende celler fra HCT116 cellelinien efter en sfærer model som beskrevet [41], hvor brystcancer stamceller blev beriget ved dyrkning i suspension som adhærerende sfærer. To uger efter dyrkning i serumfrit medium indeholdende EGF og FGF-2, vi opnåede CSC kugler fra HCT116 cellelinie (Fig 2A, første panel). Ingen ekspression af cytokeratin 20 (CK20), en markør for epitelcelledifferentiering, var detekterbar i CSC sfærer af IF (Fig 2B, første panel). Så kunne disse CSC sfærer vokse med suspension tilstand, og efterhånden blev stram og slået sammen (figur 2, øverste panel). Men disse sfærer blev inkuberet med serumholdigt medium, hvor de gradvist klæbet til overfladen af ​​dyrkningspladen, som var karakteristisk for differenation cellsby dissociation af cellerne fra kuglerne (fig 2A, ned panel), og opregulering af CK20 (Fig 2B) fra dag 0 til dag 7. Samtidig med differentieringen proces blev lgr5 ekspression også reduceret med qPCR og western blot (fig 2C og 2D). Nedreguleringen af ​​lgr5 ekspression også godt korreleret med en signifikant forøgelse i tætheden af ​​promotor-methylering (figur 2E).

A. CSC kugler fra HCT116 cellelinjer voksede med CSC medium uden serum (øverste panel); Eller, CSC sfærer ændret til normalt medium med 10% FBS (ned panel). Observationstidspunkt: 1 dag, tre dage. Og 7. dag og fotograferet under lysmikroskop. B. Immunfluorescerende farvning af CK20 i CSC sfærer; Green angivet CK20 farvning. C. RNA blev opsamlet i forskellige tidspunkt og analyseredes ved qPCR i medium med 10% FBS gruppe. D. Proteinet blev opsamlet i forskellige tidspunkt i medium med 10% FBS gruppe, blev lgr5 påvist med western blot.westernblot α-tubulin blev anvendt som intern kontrol. E. BSP-analyse af lgr5 promotor methylering tæthed i CSC sfærer og tidspunkt i i medium med 10% FBS gruppe. Sort cirkel, methylerede CpG sted; hvid cirkel, umethyleret CpG site.

Knocking ned lgr5 induceret differentiering af CSC kugler

For at undersøge årsagssammenhængen mellem nedsat lgr5 udtryk og differentiering af CSC sfærer, vi transficeret CSC kugler med lgr5-specifikke siRNA. Sammenlignet med scrambled kontrol siRNA, lgr5-specifikke siRNA reducerede signifikant lgr5 ekspression (fig 3A, s 0,001). SiRNA behandling førte også til opregulering af CK20 samt dissociation af CSC kugler (fig 3B). Dette er i overensstemmelse med de fænotyper, der er forbundet med CSC differentiering, hvilket antyder, at nedregulering af lgr5 var tilstrækkelig til at inducere differentieringen af ​​CSC sfærer.

A. B.Expression af lgr5 mRNA og protein i CSC kugler transficeret med enten scramble eller lgr5-specifikke siRNAwas undersøgt af qPCR og western blot (øverste panel) C. Immunfluorescerende farvning af CK20 (grøn) i CSC sfærer transficeret som i A. Blå: DAPI nukleare plet.

Lgr5 methylering kunne påvises i tarmkræft, men ikke normale colon væv

Dernæst undersøgte vi promoter methylering af lgr5 gen i normale colon væv versus kolorektal cancer væv. Som vist i figur 4A og 4B, positiv methylering var kun påvises i kolorektal cancer væv, men ikke normale kolon væv. MSP-analyse på de samlede 169 tarmkræft afslørede, at 67 prøver (40%) var positive for lgr5 promotor methylering. Derudover har vi også undersøgt lgr5 udtryk ved IHC.Lgr5 negative udtryk var forbundet med lgr5 methylering i samme kræftpatienter væv ved MSP. Og lav methylering eller unmethlation lgr5 udtryk var tydeligvis højere i lav methylering eller unmethlation gruppe ved MSP (Fig 4C). Der foreslog data, lgr5 methylering var lukket for sit udtryk.

A. MSP blev udført på normale colon væv (A) eller primære colorektale cancere. M, methylering signal; U, unmethylation signal. B. Lgr5 ekspression var i normale væv og cancervæv, mørke pile repræsenterede lgr5 positive celle i ved immunohistokemisk farvning. N1 repræsenterede en af ​​de normale colon væv; T5 og T22 repræsenterede henholdsvis tyktarmskræft patienter.

Lgr5 methylering negativt korreleret med tumor kvalitet, tumormetastaser og positivt med god prognose af colorectal cancer

For at evaluere den kliniske betydning af lgr5 methylering analyserede vi sammenhængen mellem lgr5 promotor methyleringsstatus, som bestemt ved MSP, med en række klinisk-patologiske træk ved patienter med kolorektal cancer (tabel 2). Vi identificerede en signifikant omvendt sammenhæng mellem positiv lgr5 methylering og højere tumor bedømmelse (p 0,001), positiv lymfeknudeinvolvering (p = 0,04) og positiv fjernmetastaser (p = 0,024), Men vi identificerer ikke andre funktioner såsom patientens alder , køn, tumor position eller Dukes stadieinddeling. De omvendte korrelationer foreslog, at lgr5 methylering var relateret til kræft i en mindre invasiv fænotype,

jeg

.

e

., Højere tumor kvalitet, negativ lymfeknude og fjernmetastaser, som blev yderligere understøttet af Kaplan-Meier overlevelsesanalyse (figur 5). Blandt de 169 patienter, analyserede, den 100-måneders overlevelsesrate var signifikant højere i tilfælde med lgr5 methylering end dem unmethylation (

s =

0,001). Disse resultater viste, at lgr5 methylering var en uafhængig prædiktiv biomarkør for god prognose af colorectal cancer.

Kaplan-Meier-overlevelseskurver for patienter grupperet baseret på lgr5 status methylering. Solid line: colorectal cancer positive for lgr5 methylering, n = 67; stiplede linje: kolorektal cancer negativ for lgr5 methylering, n = 102. HR: Hazard Ratio; 95% CI: 95% Konfidensinterval

Diskussion

Tissue selvfornyelse vedligeholdes af stamceller nicher.. Mønstret methylering inden nicherne regulerer stamcelle omsætning, der påvirker celle skæbne, heterogenitet, og så videre. Når balancen i dette mønster er forstyrres, stamceller med fænotypiske og genetiske ændringer kan undergå tumorigenese. En stor mængde af beviser har vist, at epigenetiske ændringer, såsom hypermethylering af CpG øer inden promotorområder af forskellige gener, er sandsynligvis vigtige bidragydere til tumorigenese i en bred vifte af kræft [42] og CpG ø kyster i sekvenser på op til 2 kb fjernt blev stærkt forbundet med genekspression i tyktarmskræft [43]. Desuden blev flere cancer stamceller celleoverflademarkører også reguleret ved hjælp af gen-methylering. Furhtermore, Hypermethylering status var relateret til lav eller ingen ekspression og celledifferentiering, f.eks CD133 i colorektal cancer og gliom [44, 45], og EpCAM i brystcancer [36]. I den aktuelle undersøgelse, vi hypotese, at lyddæmpet eller nedsat lgr5 ekspression var relateret til CpG ø metylering. Til støtte for denne hypotese, behandling med 5-aza-2′-deoxycytidin restaureret lgr5 udtryk i et par af kolorektale tumorcellelinjer, med dramatiske opregulering i HCT116 celler, der indeholder helt methylerede lgr5, og midt eller ingen opregulering i andre celle linier, der indeholder delvist eller næsten ikke methyleret lgr5. Desuden har behandling af DAC ikke ændre lgr5 ekspression i Melo offentliggjort undersøgelse [34] i SW620 cellelinien, men lidt stigning i vores nuværende undersøgelse. Vi analyserede lgr5 methylering i omkring ~ 1 kb promotor af lgr5, og det kan være nogle CpG øer i andre 1 kb fragment. Så vi kan ikke detektere lgr5 methylering i SW620 cellelinien, men lgr5 ekspression var lidt stigning efter DAC behandling eller anden uklar årsag. Disse data antydede, at DNA-methylering spillet en vigtig rolle i reguleringen af ​​lgr5 ekspression.

Tidligere undersøgelser har vist, at lgr5 spillet en central rolle i at opretholde egenskaberne af intestinale og kolon stamceller. Lav eller ingen lgr5 ekspression blev detekteret i differentierede celler. I modsætning hertil en høj ekspression af CK20, en differentieret celle markør, blev også fundet i forskellige kræftformer [38, 46]. I overensstemmelse med disse resultater, vores resultater indikerede, at lgr5 ekspression var høj i colorektal CSC og reduceret differentiering, som blev ledsaget af forstærket DNA-methylering og CK20 opregulering. Desuden banker ned lgr5 i CSC sfærer induceret CSC differentiering. Disse resultater antydede, at nedregulering af lgr5, der var resultatet af DNA-methylering, var ansvarlig for den differentierede fænotype af CSC.

Vi undersøgte yderligere den kliniske betydning af lgr5 methylering i sporadisk kolorektal cancer. Vi har bemærket, at dette ikke var den første undersøgelse undersøger epigenetisk modifikation af CSC markører. Det er blevet rapporteret, at hypermethylering af CpG øer beliggende i promotorregionen af ​​stilken /precursor cellemarkør CD44, en af ​​kolorektal og andre cancer stamceller celleoverflademarkører, kan forudsige biokemisk tilbagefald hos prostatacancerpatienter undergår radikal prostatektomi [47] . Den hypomethylering af bindingssteder for CpG i tre proksimale promotorer bestemt CD133 ekspression i glioblastomer [42, 48] (DELET: og hypermethylering af CD133 i HCT116 førte til xenotransplantat tumordannelse i nøgne mus sammenlignet med celler uden CD133 methylering). Interessant, har vi også observeret, at lgr5 blev hyppigere methyleret i kolorektal cancer koloner end i normale koloner, og at lgr5 ekspression blev stramt reguleret af methylering. Klinisk-patologisk analyse unraveled omvendt sammenslutning af positive lgr5 methylering med højere tumor kvalitet og invasivitet efter aftale med forestillingen om, at overekspression af lgr5 var forbundet med de mere ondartede og invasive kræftformer. Derudover fandt vi også, at lgr5 methylering var signifikant associeret med bedre prognose blandt kolorektal kræftpatienter.

Det var tidligere rapporteret, at tab af lgr5 udtryk ses i ca. 40% kolorektal cancer [22]. I vores undersøgelse har vi også observeret positiv lgr5 promotor methylering hos cirka 40% af kolorektal kræft, og kontrolleret, at negative lgr5 udtryk var signifikant associeret med promoter DNA methylering. Disse resultater antyder, at lgr5 giver en balance mellem cancercelleproliferation og CSC differentiering. Derfor kan dereguleret lgr5 udtryk tippe balancen i retning af en mere transformeret og onkogen fænotype, som observeret i en anden stamcelle markør, Oct4 [49] .Similarly, lgr5 mangel i normal tyndtarm fører til tidlig Paneth celler differentiering i tyndtarmen [ ,,,0],27]. I denne undersøgelse, vi identificeret en ny mekanisme til at styre ekspressionen af ​​lgr5,

jeg

.

e

. via promoter methylering. Vi viste, at nedreguleringen af ​​lgr5, som følge af enten siRNA behandling eller promotor-methylering, var tilstrækkelig til at inducere CSC differentiering. Der er observeret lignende bestemmelser i andre stamcellemarkører, såsom Oct4 [49]. Det er blevet foreslået, at en effektiv DNA methylering er på plads for at sikre lyddæmpning af denne potente kræft gen under udvikling. Hypermethylering af lgr5 resulterer i cancer stamceller differentiering. Som vi ved, differentierede celler er ikke i stand potent selv-fornyelse og aresensitive til traditionelle kemoterapi narkotika, så lgr5 methylering kan forbedre kemoterapi, er følsom over for kolorektal cancer celle. Men det er bemærkelsesværdigt, at DNA-methylering er ikke den eneste molekylære mekanisme regulering cancer stamceller heterogenitet. Andre mekanismer, såsom histon modifikationer, microRNA, kromatin remodelers og så videre [50], kan også fungere under carcinogenese, som er uden for rammerne af denne undersøgelse. Hvad mere er, at DNA-methylering kan have en krydstale med andre signalveje eller regulering af anden genekspression. Melo [34]

et al

. rapporterede, at promotor-methylering af Wnt målgener er en stærk indikator for fornyet colorektal cancer, og at en meget mulig mekanisme er, at inhibering af disse gener resulterede fra methylering kan faktisk forbedre Wnt aktivitetsniveauer og føre til sygdomsprogression og tilbagefald via aktivering af endnu uopdagede positive mål. Derimod blev Lgr5 høj ekspression relateret til dårlig prognose i tyktarmskræft [51, 52]. Silencing lgr5 ekspression kunne fremme coloncancer celleapoptose og reducerede metastase [22]. Methylering af promotoren reducerede lgr5 ekspression i humane coloncancer væv og cellelinier i Melo et al. rapportere og i vores undersøgelse. Det syntes, at lgr5 methylering indikerede god prognose og mindre invasion, og vores resultater var magen til dette. Der var noget anderledes med Melo et al. resultater, kan det være forspændingen af ​​vores prøver. De metastase prøver er 31 (kun 18,3%, 31/169) i vores undersøgelse, men prøverne næsten var fase II i Melo`s artiklen.

Samlet set vores undersøgelse viste, at lgr5 methylering isresponsible for lgr5 gendæmpning og cancer stamceller differentiering i kolorektal cancer. Desuden er lgr5 methylering også omvendt forbundet med høj tumorklassificering og positiv fjernmetastase. Endvidere kan det tjene som en markør til at forudsige bedre overlevelse blandt patienter med primær kolorektal cancer. Disse data tyder på, at silencingof lgr5 genet via CpG ø methylering kan være involveret i udviklingen af ​​CRC og kan potentielt tjene som et terapeutisk mål (et supplement til traditionel kemoterapi for tarmkræft). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at belyse de detaljerede reguleringsmekanismer in vivo.

Støtte Information

S1 data. Data for overlevelse analyse (udvidet Fig 5)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143513.s001

(XLSX)

Tak

Vi vil gerne takke Dr. Shunhua Jin (Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University) for MSP teknisk bistand.