PLoS ONE: Barnase som en ny terapeutisk agent Udløsning Apoptose i Human Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

RNaser øjeblikket studeres som ikke-mutagene alternativer til de skadelige DNA-skadelige anticancer narkotika almindeligt anvendes i klinisk praksis. Mange pattedyr RNaser ikke potente toksiner på grund af den stærke hæmning af ribonukleaseinhibitor (RI) præsenteret i cytoplasmaet i pattedyrceller.

Metode /vigtigste resultater

På jagt efter nye effektive anticancer RNaser vi studerede virkningerne af barnase, en ribonuklease fra

Bacillus amyloliquefaciens

, på humane cancerceller. Vi fandt, at barnase er resistent over for RI. I MTT celleviabilitetstest, var barnase cytotoksisk for humane carcinoma cellelinier med halv-inhiberende koncentrationer (IC

50) i området fra 0,2 til 13 pM og leukæmi cellelinjer med IC

50 værdier fra 2,4 til 82 uM . Også vi kendetegnet de cytotoksiske virkninger af barnase-baserede immunoRNase scFv 4D5-dibarnase, som består af to barnase- molekyler serielt fusioneret til det enkeltkædede variable fragment (scFv) af humaniseret antistof 4D5, som genkender det ekstracellulære domæne af kræft markør HER2. ScFv 4D5-dibarnase specifikt bundet til HER2-positive celler og er internaliseret via receptor-medieret endocytose. Den intracellulære lokalisering af internaliseret scFv 4D5-dibarnase blev bestemt ved elektronisk mikroskopi. Den cytotoksiske virkning af scFv 4D5-dibarnase på HER2-positive humane ovariecarcinom SKOV-3-celler (IC

50 = 1,8 nM) var tre størrelsesordener større end for barnase alene. Både barnase og scFv 4D5-dibarnase induceret apoptose i Skov-3-celler ledsaget af internukleosomal chromatin fragmentering, membranblæredannelse, udseendet af phosphatidylserin på den ydre blad af plasmamembranen, og aktiveringen af ​​caspase-3.

konklusioner /betydning

Disse resultater viser, at barnase er et potent giftigt middel til målretning til kræftceller

Henvisning:. Edelweiss E, Balandin TG, Ivanova JL, Lutsenko GV, Leonova OG, Popenko VI et al. (2008) Barnase som en ny terapeutisk agent Udløsning Apoptose i humane cancerceller. PLoS ONE 3 (6): e2434. doi: 10,1371 /journal.pone.0002434

Redaktør: Gideon Schreiber, Weizmann Institute of Science, Israel

Modtaget: August 22, 2007; Accepteret: 13. maj 2008; Udgivet: 18 Jun 2008

Copyright: © 2008 Edelweiss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den Russiske Foundation for Grundforskning (nr. 07-02-00649, 07-04-00584, 06-04-49686-a), SNSF (nr IB73AO-110.842 /1), og Program ” Molekylær og Cell Biology “RAS

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Barnase, en ribonuklease fra

Bacillus amyloliquefaciens

, syntetiseres som et aktivt proenzym, behandles af fjernelse af den amino-terminalt signalpeptid, og udskilles i det ekstracellulære rum. I denne bakteriearter, barstar, en specifik intracellulær inhibitor af barnase, produceres. Barstar stramt binder til barnase og derved hæmmer dens intracellulære enzymatiske aktivitet og beskytter værtsceller fra den skadelige virkning af denne RNase. Barnase er en lille (110 aa) enkeltkædet protein. Det har ingen disulfidbindinger og kræver ingen posttranslationelle modifikationer, divalente kationer eller andre ikke-peptid komponenter til dens funktion [1], [2]. På grund af disse gunstige træk, barnase er aktiv i enhver celletype, i hvilken det udtrykkes. Evnen af ​​barnase til at spalte RNA er blevet udnyttet i en lang række af bio-anvendelser, eftersom indførelsen af ​​dette enzym i celler forårsager celledød. Specifik ablation af bestemte celler er mulig ved at rette barnase genekspression via anvendelse af cellespecifikke promotorer [3] – [5]. Alternativt proteiner, der er målrettet barnase til specifikke celler udstyre specificitet for barnase handling [6] – [8].

Den toksiske effekt af barnase genekspression blev anvendt til at designe vektorer til positiv selektion af klonede inserts [9], [10], for at generere mandlige og kvindelige sterilitet i planter [11], [12], at bibringe nematoderesistens på afgrøder [13], for at fremstille potente midler for at dræbe den tredje stadiums larver af bomuld frøkapselorm [14], for at studere sygdomme forårsaget af tabet af en specifik celletype i pattedyr og til at eliminere cancerceller [5]. Disse eksempler viser klart effektiv specifik eliminering af celler i forskellige arter ved anvendelse af barnase genekspression; imidlertid lidt arbejde været fokuseret på virkningerne af exogen tilsætning af barnase på maligne og normale pattedyrceller. Faktisk undersøgelsen af ​​barnase nefrotoksicitet er den eneste offentliggjorte eksempel [15]. Derfor er målet med dette arbejde var at karakterisere virkningerne af ribonuklease barnase på menneskers cancer og normale celler.

RNaser er i øjeblikket under intens efterforskning for deres anticancer potentiale [16], [17]. De mest lovende blandt dem er humane pancreas-type RNaser tolereres godt af det humane immunsystem. Men det cytotoksiske potentiale af mange af dem er reduceret med deres følsomhed over for inhibering med cytoplasmatisk ribonuclease-inhibitor (RI) findes i alle pattedyrcelle undersøgt [18]. er blevet udforsket flere tilgange til at reducere følsomheden af ​​pancreas-type RNaser til RI [19] – [22]. Anvendelsen af ​​RNaser uløseligt resistente over for RI tilvejebringer en anden måde at overvinde denne hindring. Vi undersøgte modtagelighed barnase til RI og fandt, at barnase er heldigvis ufølsom for inhibering med RI.

cancerceller er en specifik cellepopulation, kendetegnet ved nærvær af tumorspecifikke promotorer og kræft markører. En af disse markører er HER2-antigenet (også kaldet HER-2, ERBB2, p185HER-2), der overudtrykkes i en lang række humane neoplasmer [23], især i æggestokkene og brystcarcinomer [24], [25]. Vi fusionerede to barnase- molekyler til enkelt-kæde variable fragment (scFv) af det humaniserede antistof 4D5, som genkender det ekstracellulære domæne af HER2, til frembringelse af scFv 4D5-dibarnase [8]. Vi gjorde en immunoRNase (IR), der omfattede to ribonukleaser pr bærer, eftersom specifikke cytotoksicitet begrænses af celleoverfladen densiteten af ​​HER2-antigenet. Denne konfiguration muliggjort, at den dobbelte ribonucleaseaktivitet i celler med kun et HER2 receptor. Som tidligere vist [26], en to-fold stigning i antallet af RNase-molekyler i immunokonjugatet potenserede den ved femten gange. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, om scFv 4D5-dibarnase er i stand til at interagere specifikt med HER2-positiv humane ovarieceller, skal internaliseres i cellerne, og udøve cytotoksicitet.

Derfor i dette arbejde, vi skønnede fordele af barnase til udvikling anticancer narkotika og demonstreret styrken af ​​barnase-baserede immunoRNase for kræftcellen ablation.

Resultater

Karakterisering af barnase og scFv 4D5-dibarnase

rekombinante proteiner var produceret i

E. coli

og oprenset som beskrevet i Materialer og Metoder. De opnåede proteiner var af den forventede størrelse og homogen ifølge SDS-PAGE (data ikke vist). Den enzymatiske aktivitet af tilberedt barnase var 1,8 X 10

6 enheder /mg, hvilket var i overensstemmelse med tidligere publicerede værdier [27]. Den ribonucleaseaktivitet af hver barnase enzym i scFv 4D5-dibarnase fusionsproteinet var 75% af nativt barnase (figur 1A). Den ribonucleaseaktivitet af scFv 4D5-dibarnase blev inhiberet af barstar (figur 1B, punkteret linie). Således barnase del med scFv 4D5-dibarnase bevaret sin funktionalitet.

(A) De ribonuklease aktiviteter barnase (stiplet linie og diamanter) og scFv 4D5-dibarnase (stiplet linje og cirkler) blev bestemt ifølge fremgangsmåden af Rushizky et al. [58]. X-aksen repræsenterer koncentrationen af ​​barnase alene eller den halve koncentration af scFv 4D5-dibarnase. Absorbansen af ​​0,5 AU

260 svarer til aktiviteten af ​​2 nM nativt barnase som tidligere beskrevet [27]. (B) Modtagelighed for barnase til HRI (optrukket linje og cirkler) og scFv 4D5-dibarnase at barstar (stiplet linie og trekanter). Data er middelværdier ± SD af tredobbelte bestemmelser; kurverne er resultaterne af sigmoid regression udført med SigmaPlot software.

Efter indtrængning i celler, tilsættes det eksogent RNase kan undlade at være aktiv på grund af følsomhed over for den cytoplasmatiske ribonucleaseinhibitor [18]. Derfor, før testning cytotoksiciteten af ​​scFv 4D5-dibarnase undersøgte vi følsomheden af ​​barnase til human ribonuclease-inhibitor (HRI). Ved en koncentration på fire gange større end den, der kræves for at inhibere RNase A med 50% (bestemt ifølge producentens instruktioner), havde HRI ikke inhiberer barnase (figur 1B, optrukket linje).

Binding af barnase og scFv 4D5-dibarnase til celler

binding af barnase og scFv- 4D5-dibarnase til HER2-overekspression menneske ovariekarcinom SKOV-3 celler [28] og murine CTLL-2 cytotoksiske T-celler, der mangler menneskelige HER2 blev bestemt ved fluorescerende mikroskopi. Membranen fluorescens af SKOV-3-celler, men ikke CTLL-2-celler, farvet med 20 nM scFv 4D5-dibarnase blev observeret (figur 2, B og D). I kontroller, når scFv 4D5-dibarnase eller kanin anti-barnase antiserum blev udeladt, blev der ikke fluorescens påvist i SKOV-3 celler og CTLL-2 celler (data ikke vist). Tilsætningen af ​​scFv 4D5 til scFv 4D5-dibarnase ført til bemærkelsesværdige quenching af cellemembranen fluorescens (figur 2, sammenlign B og C), hvilket viser, at scFv 4D5-dibarnase bundet til HER2-receptoren. Ingen fluorescens blev påvist i enten SKOV-3 celler eller CTLL-2-celler i nærvær af 20 nM barnase (data ikke vist). Ved barnase koncentration på 20 uM, blev en lys cytoplasmatisk farvning af SKOV-3-celler observeret (figur 2E), hvilket tyder på penetration af barnase i celler. Passende kontroller uden enten barnase eller kanin-anti-barnase antiserum var negative (data ikke vist).

cellebindende evne af de rekombinante proteiner påvist ved fluorescensmikroskopi. Cellerne blev inkuberet ved 4 ° C i 1 time med enten 20 nM scFv 4D5-dibarnase (A, B og D), eller en blanding af 20 nM scFv 4D5-dibarnase og 20 nM scFv 4D5 (C), eller 20 uM barnase ( E). Ubundne proteiner blev fjernet, og derefter lever (A-D) eller faste (E) -celler blev farvet med kanin-anti-barnase antiserum og GAR-TR som beskrevet i Materialer og Metoder. ScFv 4D5-dibarnase bundet til HER2-positive SKOV-3-celler (A og B), var dette specifikke binding inhiberet af scFv 4D5 (C). ScFv 4D5-dibarnase ikke bandt til HER2-negativ CTLL-2-celler (D). Cytoplasmatisk farvning af SKOV-3-celler med 20 pM barnase blev observeret (E). Forstørrelse, 400 ×.

Samspillet mellem scFv- 4D5-dibarnase med HER2-overekspression human karcinom BT-474 celler [25] blev undersøgt ved konfokal mikroskopi. BT-474 celler blev inkuberet med 20 nM scFv 4D5-dibarnase ved enten 4 ° C for at undertrykke internalisering eller 37 ° C for at lade internalisering og farvet med kanin-anti-barnase antiserum efterfulgt af phycoerythrin-konjugeret gede anti-kanin IgG. Fluorescensen blev observeret overvejende på overfladen af ​​cellerne inkuberet ved 4 ° C (figur 3A) og inde i cellerne inkuberet ved 37 ° C (figur 3B), hvilket viser, at scFv 4D5-dibarnase binder til og trænger ind BT-474-celler. I kontroller, da scFv 4D5-dibarnase eller kanin anti-barnase antiserum blev udeladt, blev der ikke fluorescens påvist i BT-474 celler (data ikke vist).

(A) Celler blev inkuberet med scFv 4D5-dibarnase på 4 ° C eller (B) ved 37 ° C. ScFv 4D5-dibarnase blev påvist med kanin-anti-barnase antiserum efterfulgt af GAR-PE. Fluorescens blev overvejende observeret på overfladen af ​​celler inkuberet ved 4 ° C, og inde i cellerne inkuberet ved 37 ° C. Denne forskel i lokaliseringen af ​​fluorescerende mærke antyder internalisering af scFv 4D5-dibarnase ved 37 ° C i BT-474-celler.

internalisering af scFv 4D5-dibarnase undersøgt ved elektronmikroskopi

Den intracellulære lokalisering af scFv- 4D5-dibarnase blev udforsket af elektronmikroskopi. ScFv 4D5-dibarnase blev kompleksbundet med guldpartikler (AU). ScFv 4D5-dibarnase-Au-komplekset bundet til SKOV-3-celler (figur 4), men bandt ikke eller trænge CTLL-2-celler (data ikke vist) ved 4 ° C og 37 ° C. Ved binding af komplekset til celleoverfladen af ​​SKOV-3-celler, blev guldpartiklerne aflejret på fremspring og glatte dele af cellemembranen (figur 4, A-D). Penetrationen af ​​scFv 4D5-dibarnase-Au i SKOV-3-celler blev observeret ved 37 ° C, men ikke ved 4 ° C, hvilket indebærer, at indtrængningen er en temperatur-afhængig proces. Internaliseringen af ​​scFv 4D5-dibarnase-Au involverede dannelsen af ​​overtrukne gruber (figur 4D), som havde blomstret fra cellemembranen og omdannet til overtrukne vesikler (Figur 4E). Inde i cellerne, blev de fleste af guldpartiklerne ligger i endosomer (figur 4, F og G). Et par guldpartikler blev fundet fri i cytoplasmaet tilstødende til endosomerne (figur 4, F og G, pilespidser). Disse observationer tyder på, at scFv 4D5-dibarnase kan frigives fra endosomer til cytoplasmaet. Guldpartiklerne forekom også i multivesikulære organer (Figur 4H). Kerner blev ikke mærket (figur 4F).

SKOV-3-celler blev inkuberet med 20 nM scFv 4D5-dibarnase-Au i 1 time ved 4 ° C eller ved 37 ° C. (A og B) ved 4 ° C blev guld etiket anbragt på den cytoplasmatiske membran (m) og fremspring (asterisker), men ikke inde i cellen. (C-H) ved 37 ° C, scFv 4D5-dibarnase-Au bundet til celleoverfladen på samme måde som ved 4 ° C, men blev også fundet inde i cellerne i overtrukne gruber (cP) (D), overtrukne vesikler ( cv) (E), endosomer (e) (F og G), cytoplasma (c) (F og G, pilehoveder), og multivesikulære organer (MVB) (H). ScFv 4D5-dibarnase-Au blev ikke fundet i kernen (n) (F). Bar, 200 nm.

Effekt af barnase og scFv- 4D5-dibarnase på celleoverlevelse

Vi undersøgte effekten af ​​rekombinant barnase og scFv 4D5-dibarnase på overlevelsen af ​​forskellige human cancer cellelinier. Humane mononukleære celler fra perifert blod (hPBMCs) blev isoleret fra det perifere blod fra raske donorer og straks anvendt til at undersøge cytotoksiciteten af ​​barnase og scFv 4D5-dibarnase på normale humane celler. Murint CTLL-2 cytotoksiske T-celler, der mangler human HER2 blev også anvendt. Alle cellelinier og hPBMCs blev inkuberet med proteiner i forskellige koncentrationer i komplet dyrkningsmedium i 72 timer og cellelevedygtighed blev evalueret i MTT-assayet (tabel 1). De humane brystcarcinom BT-474-celler demonstrerede den højeste følsomhed over for barnase (IC

50 = 0,21 uM), den laveste en blev vist ved den myelocytisk leukæmi HL-60-celler (IC

50 = 82 uM). For andre cancer cellelinjer, barnase var giftige med IC

50 spænder fra 2,4 til 13 uM. De dosisresponskurver nåede ikke mætning plateau, hvilket tyder uspecifik vekselvirkning af barnase med celler. De SKOV-3 celler viste moderat følsomhed (IC

50 = 5 uM), hvilket viser mere generelt svar på barnase-induceret cytotoksicitet end BT-474 celler. Derfor var SKOV-3 celler anvendes til yderligere karakterisering af scFv- 4D5-dibarnase effekter på HER2-overekspression celler. For hPBMCs, blev den maksimale cytotoksiske virkning (27%) opnået ved 110 uM barnase (figur 5A, kort- stiplet linie) mens for SKOV-3-celler, 1,2 uM af barnase var tilstrækkelig til at frembringe den samme virkning. Således barnase toksicitet var to størrelsesordener større for human cancer SKOV-3 celler end for hPBMCs.

(A) Virkningerne af barnase og scFv- 4D5-dibarnase om levedygtigheden af ​​human cancer og normale celler. SKOV-3-celler blev behandlet i 72 timer med barnase (linie med lange streger) eller scFv 4D5-dibarnase (optrukket linje), og hPBMCs blev behandlet med barnase (kort stiplet linie) eller scFv 4D5-dibarnase (stiplet-punkteret linie). (B) Den konkurrencemæssige hæmning af scFv- 4D5-dibarnase cytotoksicitet ved scFv 4D5. SKOV-3-celler blev behandlet i 72 timer med scFv 4D5-dibarnase i fravær (sorte cirkler) eller nærvær (hvide trekanter) på 300 nM scFv 4D5 eller med scFv 4D5 alene (hvide firkanter). (C) Inhibering af barnase cytotoksicitet og scFv 4D5-dibarnase cytotoksicitet ved barstar. SKOV-3-celler blev behandlet i 72 timer med barnase (hvide cirkler), barnase og ækvimolære mængder af barstar (hvide trekanter), scFv 4D5-dibarnase (sorte cirkler), scFv 4D5-dibarnase med tre gange molært overskud af barstar (sort trekanter) eller barstar alene (sorte firkanter). (D) Virkningerne af HRI på cytotoksicitet af scFv- 4D5-dibarnase. SKOV-3-celler blev behandlet i 72 timer med enten scFv 4D5-dibarnase i fravær af HRI (sorte cirkler), scFv 4D5-dibarnase i nærvær af HRI (hvide diamanter), eller HRI alene (sorte romber). Cellelevedygtighed udtrykt som procentdelen af ​​den metaboliske aktivitet af behandlede celler i forhold til ubehandlede celler (Crosshair). Hver regression kurve i panel A (med 95% konfidensintervaller er angivet med stiplede linjer) repræsenterer mindst tre uafhængige forsøg. Sigmoideum regression blev udført med SigmaPlot software. Kurver i B-D repræsenterer typiske eksperimenter. Fejlsøjler (B-D) blev opnået fra tredobbelte målinger.

Eksponering af HER2-overekspression SKOV-3-celler til scFv 4D5-dibarnase i 72 timer viste en dosisafhængig cytotoksicitet fra 0,1 nM til 20 nM (figur 5A, optrukket linje). Yderligere stigninger i koncentrationen forbedret cytotoksicitet smule, peger på, at virkningen af ​​scFv 4D5-dibarnase var begrænset af celleoverfladen tæthed af HER2 receptoren. IC

50 i scFv 4D5-dibarnase var 1,8 nM, hvilket var 2800 gange mindre end IC

50 af barnase (figur 5A, sammenlign solide og stiplede linjer). BT-474-celler viste scFv 4D5-dibarnase følsomhed sammenlignes med SKOV-3-celler. Som IC

50 og IC

30 scFv 4D5-dibarnase var 1,3 gange højere for BT-474 celler end for SKOV-3 celler, men IC

70 var 1,5 gange lavere for BT-474 celler end for SKOV -3 celler (tabel 1). Bemærkelsesværdige, mens virkningerne af barnase alene på SKOV-3 og BT-474 celler afveg 25 gange, scFv 4D5-dibarnase demonstrerede lignende virkninger på disse HER2-positive celler. Samtidig blev der HER2-negative hPBMCs ikke påvirket af scFv 4D5-dibarnase ved koncentrationer op til 2600 nM (figur 5A, stiplet-punkteret linie). Disse fund indikerer, at virkningen af ​​scFv 4D5-dibarnase var specifik og receptormedieret.

For yderligere at bekræfte, at cytotoksiciteten af ​​scFv 4D5-dibarnase var medieret ved interaktionen af ​​scFv 4D5 del med HER2-receptoren, undersøgte vi virkningen af ​​scFv 4D5-dibarnase på SKOV-3-celler i nærvær af scFv 4D5 i en koncentration på 300 nM. Mens scFv 4D5 selv ikke påvirker SKOV-3-celler (figur 5B, hvide firkanter) ved koncentrationer på 0,1 nM til 2000 nM, den miniantistof formindskede cytotoksicitet af scFv 4D5-dibarnase på en dosis-afhængig måde (figur 5B, hvide trekanter) . Denne afhængighed antyder, at scFv 4D5 og scFv 4D5-dibarnase konkurrerer om det samme bindingssted og yderligere bekræftet den specifikke interaktion af scFv- 4D5-dibarnase med HER2-receptoren.

For at afgøre om den enzymatiske aktivitet af barnase var afgørende for cytotoksicitet, barstar, en specifik inhibitor af barnase, blev anvendt. Barstar alene ikke hæmme levedygtighed SKOV-3 celler ved koncentrationer op til 2000 nM. (Figur 5C, sorte firkanter). Tilsætning af barstar at barnase ved ækvimolære mængder afskaffet barnase cytotoksicitet ved et koncentrationsinterval fra 0,4 til 13 uM (figur 5C, hvide trekanter). Når de tilsættes i tre-gange overskud, barstar reducerede den toksiske virkning af scFv 4D5-dibarnase ved koncentrationer på 0,6 nM til 80 nM (figur 5C, sorte trekanter).

Inhiberingen af ​​scFv 4D5-dibarnase cytotoksicitet ved barstar og scFv 4D5 bekræftede, at både 4D5 scFv- og barnase bidrage til cytotoksicitet af scFv- 4D5-dibarnase til SKOV-3 celler.

for at teste, om HRI påvirker effekten af ​​scFv 4D5-dibarnase på kræftceller, HRI og scFv- 4D5-dibarnase blev inkuberet i et forhold på 100 enheder HRI til 1 pg scFv 4D5-dibarnase i 30 minutter ved 4 ° C og derefter tilsat til cellerne. HRI alene hverken påvirket SKOV-3 celleoverlevelse (fig 5D, sorte diamanter) eller scFv 4D5-dibarnase cytotoksicitet (figur 5D, sammenlign sort cirkel og hvide diamanter).

RNA-nedbrydning induceret af barnase i SKOV-3 celler

polyacrylamidgel analyse af totalt cellulært RNA isoleret fra SKOV-3-celler viste, at cellulært RNA undergår nedbrydning i celler behandlet med 50 pM barnase (figur 6). Omfattende RNA-nedbrydning var tydelig 24 timer efter eksponering af celler for barnase (bane 3); efter 48 timer, nedbrydning af cellulært RNA var næsten fuldstændig (bane 4). Både lavmolekylære tRNA og 5,8S rRNA, men ikke 5S rRNA, syntes mere modtagelige for 24-h barnase behandling. Det fremgår af de yderligere bånd (bane 3, asterisker) angiver den enzymatiske spaltning af høj molekylvægt rRNA ved barnase. Digital billedanalyse af gelen i figur 6 (bane 2 og 3) viser, at den relative forekomst af tRNA og 5,8S rRNA blev reduceret til 30% og 16% af kontrolceller, hvorimod niveauer af 5S, 18S og 28S rRNA blev reduceret til 60%, 43% og 54% af kontrolceller henholdsvis.

SKOV-3 celler blev udsat for 50 uM barnase i 24 timer (bane 3) eller 48 timer (bane 4). Totalt RNA blev isoleret som beskrevet i Materialer og metoder og analyseret på en 9% polyacrylamidgel indeholdende 7,5 M urinstof. Hver prøve bane blev fyldt med RNA fra 2 × 10

5 behandlede (+) eller ubehandlede (-) celler. Bane 2 svarer til mock-behandlet kontrol. Positionerne af RNA molekylvægtstandarder (bane 1) er vist som antallet af baser til venstre for panelet. Stjerner angiver de mest fremtrædende bands, der vises som et resultat af enzymatisk spaltning af høj molekylvægt rRNA ved barnase (bane 3).

Virkningsmekanisme af barnase og scFv- 4D5-dibarnase på SKOV-3 celler

for at identificere og karakterisere tilstanden af ​​celledød udløst af barnase eller scFv- 4D5-dibarnase behandling, SKOV-3 celler blev fremstillet som beskrevet i materialer og metoder. Både barnase og scFv 4D5-dibarnase inducerede en karakteristisk apoptotisk blæredannelse af den cellulære membran, der var detekterbar i visse celler så tidligt som 6 timer efter behandling og fortsatte med at være indlysende for de følgende 72 timer (figur 7).

(A) de mock-behandlede celler blev fastgjort til pladen og var flad. (B og C) Celler inkuberet med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase blev afrundet og fritliggende. Membranblæredannelse (B og C, asterisker) og nedbrudte celler (B, pilespids) blev observeret. Fase-kontrast mikroskopi af et tilfældigt felt ved en forstørrelse på 400 ×.

DNA-fragmentering i døende celler er en generel slutpunkt, der er fælles for begge nekrotiske og apoptotiske mekanismer celledød. For at bestemme om barnase og scFv 4D5-dibarnase inducerer DNA-brud i SKOV-3-celler, blev propidiumiodid (PI) farves cellerne analyseret for ændringer i cellecyklusfordeling anvendelse af DNA indhold målinger via flowcytometri. Behandling af SKOV-3-celler med enten barnase eller scFv 4D5-dibarnase resulterede i en gradvis forøgelse af andelen af ​​celler i sub-G1-fasen (celler indeholdende mindre DNA end 2N), sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (figur 8A). Barnase-behandlede SKOV-3-celler viste stigninger på 2,1%, 4,5% og 23,9% i antallet af celler i sub-G1-fasen og fald i 4,0%, 0,2% og 19,5% i antallet af celler i G1-fasen af cellecyklussen sammenlignet med kontroller efter 24, 48 og 72 timers behandling hhv. Tilsvarende scFv 4D5-dibarnase-behandlede SKOV-3-celler viste stigninger på 8,5%, 8,1% og 19,7% i antallet af celler i sub-G1-fasen og fald på 7,5%, 3,0% og 20,6% i antallet af celler i G1-fasen i forhold til deres respektive kontroller. Desuden blev antallet af celler i S-fase faldt med 4,9% og 3,1% i barnase–behandlede celler efter 48 og 72 timer henholdsvis og med 3,6% i scFv 4D5-dibarnase-behandlede celler efter 48 timer. På den anden side, cellecyklus-analyse viste ingen signifikante forskelle i celler i G2 /M fase af cellecyklussen mellem kontrol og behandlede celler (figur 8A). Disse resultater antyder, at både barnase og scFv 4D5-dibarnase induceret DNA-brud, overvejende G1 celler. I modsætning hertil serumudsultede SKOV-3-celler udviste en stigning i procentdelen af ​​celler i sub-G1-fasen (35,7%), der ledsager fald i de andre tre faser [G1 (12,7%), S (9,1%), og G2 /M (13,8%)] i forhold til kontrolceller.

(A) Flowcytometrisk analyse af fordelingen cellecyklusen blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. Histogrammer repræsenterer forskelle i procentdele af celler mellem barnase- eller scFv 4D5-dibarnase-behandlede og ubehandlede celler for hver celle cyklus fase (sub-G1, G1, S og G2 /M) målt efter 24 timer (sorte søjler), 48 h (blå søjler) og 72 timer (grønne søjler) af behandlingen. Fejlbjælker viser standardafvigelsen. Positive kontroller for DNA fragmentation var SKOV-3 celler dyrket i 7 dage i serumfrit medium (orange søjler). (B) DNA-elektroforese assay. Celler blev behandlet med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase. Tooghalvfjerds timer senere, genomisk DNA fra begge behandlede (+) og ubehandlede (-) celler blev isoleret og DNA fra lige mange celler blev løst i ikke-denaturerende 1,5% agarosegeler. DNA’et blev visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. Kromatin fragmenter som følge af internukleosomal spaltning var til stede i prøver af DNA fra celler behandlet med barnase (bane 2) og scFv 4D5-dibarnase (bane 6). DNA af serum-udsultede (SS) celler blev spaltet uregelmæssigt (bane 7). Bane 3 og 5 repræsenterer ubehandlede kontroller. Banerne 1 og 4 er molekylvægtmarkører ((M) HyperLadder I, Bioline). (C) Celler blev eksponeret for 50 nM scFv 4D5-dibarnase i 72 timer og derefter farvet med acridinorange, analyseret ved fluorescensmikroskopi, og fotograferet. Et repræsentativt tilfælde af nuklear pyknosis og fragmentering (karyorrhexis) vises (indsat). Forstørrelse, 400 × (1200 ×, indsat).

For at belyse hvilke apoptotiske eller nekrotisk form for DNA-fragmentering blev udløst af barnase og scFv- 4D5-dibarnase, genomisk DNA, der blev isoleret fra SKOV-3 celler behandlet med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase blev elektroforeret gennem en 1,5% agarosegel (figur 8B). Tooghalvfjerds timer efter barnase eller scFv 4D5-dibarnase behandling, SKOV-3 celler udviste karakteristisk internukleosomal chromatin spaltning (figur 8B, bane 2 og 6), som adskiller sig fra den uregelmæssige DNA-spaltning af serum-sultede SKOV-3-celler (figur 8B, bane 7). Desuden behandling af SKOV-3 celler med scFv 4D5-dibarnase inducerede en distinkt mønster af nuklear pyknosis og fragmentering (karyorrhexis) som observeret ved fluorescens mikroskopi efter farvning af celler med acridinorange (figur 8C).

Vi har også brugte Annexin-V-FITC /PI-farvning til at måle forekomsten af ​​phosphatidylserin, en markør af apoptose, på den ydre blad af plasmamembranen i SKOV-3-celler (figur 9, a-C). Celler behandlet i 72 timer med enten 50 uM barnase eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase fandtes at være Annexin-V-FITC positive og PI negative ved en højere procentdel (21,7% og 32,7%, henholdsvis) end i ubehandlede celler (1,5% ). Disse resultater indikerer, at arten af ​​den celledød induceret af både barnase og scFv 4D5-dibarnase er apoptotiske. En stigning i nekrotiske celler (Annexin-V-FITC positive og PI positive) var 2,0% for barnase–behandlede celler og 2,6% for scFv 4D5-dibarnase-behandlede celler sammenlignet med kontroller, ti gange mindre end for apoptotiske celler.

(A-C) SKOV-3-celler blev mock-behandlede (A) eller behandlet med enten 50 uM barnase (B) eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase (C) i 72 timer. Celler blev analyseret for tidlig apoptose med Annexin-V-FITC /PI-farvning. De lavere venstre kvadranter af hvert panel viser de levedygtige celler, som udelukker PI og er negative for Annexin-V-FITC binding. Den øverste højre kvadranter indeholder de ikke-levedygtige, nekrotiske celler, som er positive for både Annexin-V-FITC-binding og PI-optagelse. Nederste højre kvadranter repræsenterer apoptotiske celler, Annexin-V-FITC positive og PI negative. Et repræsentativt eksperiment ud af tre er vist. (D og E) caspase-3-lignende enzymatiske aktiviteter af celler behandlet med enten 50 uM barnase (D, ubesatte top) eller 50 nM scFv 4D5-dibarnase (E, ubesatte peak) i 72 timer blev vurderet ved spaltning af det fluorogene substrat PhiPhiLux-G

1D

2 og sammenlignet med den for ubehandlede celler (udfyldte toppe). M1 og M2 markører svarer til niveauet af caspase-3 aktivering i ubehandlede og behandlede celler.

For yderligere at undersøge tilstanden af ​​celledød induceret af barnase og scFv- 4D5-dibarnase, vi målte aktivering af en apoptose-specifikke caspase-3 ved proteolytisk spaltning assay af PhiPhiLux-G

1D

2 substrat (figur 9, D og E). Caspase-3-lignende aktivitet blev forøget med 13,1% for barnase- og med 11,6% for scFv 4D5-dibarnase-behandlede SKOV-3-celler sammenlignet med ubehandlede kontroller.

Som konklusion evne barnase og scFv 4D5 -dibarnase at inducere membranblæredannelse, udseendet af phosphatidylserin på den ydre blad af plasmamembranen, internukleosomal chromatin fragmentering, og aktiveringen af ​​caspase-3 støtter tanken om, at disse proteiner udløser apoptotisk celledød.

diskussion

Barnase er med held blevet anvendt i en række undersøgelser til fjernelse af celler i forskellige arter [3] – [5 og 9-14]; dog har de cytotoksiske virkninger af barnase på kræftceller ikke undersøgt tilstrækkeligt. Her blev rekombinant barnase vist at være toksisk for humane carcinoma-cellelinier med IC

50 værdier fra 0,2 til 13 pM og leukæmi cellelinjer med IC

50 værdier fra 2,4 til 82 uM (tabel 1). Sammenlignet med andre RNaser [29], barnase er moderat toksisk for humane cancerceller. Virkningerne af barnase på forskellige cancercellelinier varierede 400-fold. Den mest følsomme cellelinie var BT-474 (IC

50 = 0,21 uM), og den mindst følsomme ene var HL-60 (IC

50 = 82 uM). Den store spredning i IC

50 værdier for forskellige cellelinjer er også uløseligt forbundet med kvæg skelsættende ribonuklease (BS RNase) og onconase, en ribonuklease fra

Rana pipiens

. Virkningerne af BS RNase på carcinomcellelinjer varierede 570-fold; og virkningerne af onconase på carcinom og leukæmicellelinjer varierede 6000-fold [30]. Den observerede variation i modtagelighed cellelinjer til barnase kan være forårsaget af forskelle i ændringer og /eller sammensætningen af ​​celleoverflademolekyler der bestemmer binding af barnase til celleoverfladen. Den måde og styrken af ​​bindingen indflydelse effektiviteten af ​​cellulære optagelse af RNase [31] eller internaliseringen pathway RNase.