PLoS ONE: Galiellalactone Hæmmer Stem Cell-Like ALDH-Positiv Prostata Cancer Cells

abstrakt

Galiellalactone er en potent og specifik inhibitor af STAT3 signalering som har vist sig at besidde væksthæmmende effekter på prostatacancerceller udtrykker aktiv STAT3. I denne undersøgelse sigtede vi at undersøge effekten af ​​galiellalactone på prostatacancer stamcellelignende celler. Vi undersøgt ekspressionen af ​​aldehyddehydrogenase (ALDH) som markør for cancer stamcellelignende celler i forskellige human prostatacancer-cellelinier og virkningerne af galiellalactone på ALDH udtrykker (ALDH +) prostatacancerceller. ALDH + subpopulationer blev påvist og isoleret fra human prostatacancer-cellelinier DU145 og langsigtede IL-6 stimulerede LNCaP-celler ved anvendelse ALDEFLUOR® assay og flowcytometri. I modsætning til ALDH- celler, viste ALDH + prostatacancerceller cancer stamcellelignende karakteristika såsom øget selvfornyende og kolonidannende kapacitet og tumorigenicitet. Desuden viste ALDH + celler en forøget ekspression af formodede prostatakræft stamcelle markører (CD44 og integrin α2β1). Endvidere ALDH + -celler udtrykte phosphoryleret STAT3. Galiellalactone behandling faldt andelen af ​​ALDH + prostatacancerceller og induceret apoptose af ALDH + -celler. Genet udtryk for

ALDH1A1

blev nedreguleret in vivo i galiellalactone behandlet DU145 implanteret. Disse resultater understreger, at målrette STAT3 vej i prostata cancer celler, herunder prostatakræft stamceller celle-lignende celler, er en lovende terapeutisk tilgang, og at galiellalactone er en interessant stof til udviklingen af ​​fremtidige prostata cancer medicin.

Henvisning : Hellsten R, Johansson M, Dahlman A, Sterner O, Bjartell A (2011) Galiellalactone Hæmmer stamcelle-lignende ALDH-Positiv Prostata Cancer Cells. PLoS ONE 6 (7): e22118. doi: 10,1371 /journal.pone.0022118

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: December 22, 2010; Accepteret: 17 juni 2011; Udgivet: 11. juli 2011

Copyright: © 2011 Hellsten et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den svenske Kræftens Bekæmpelse, Det svenske Forskningsråd, MAS Cancer Foundation, Holger Knud Christensens Donation, Percy Falck Foundation og Gunnar Nilsson Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatakræft er den mest almindeligt diagnosticeret tumor blandt mænd, og der er et stort behov for nye behandlingsformer mod kastrationsresistent prostatacancer [1]. Ifølge cancer stamceller teori, kun en lille delmængde af cancerceller er i stand til tumorvækst og fornyet [2], [3]. Prostatacancer stamceller synes at være resistent over for konventionel cancerterapi og kan derfor være involveret i avancerede prostatatumorer og forårsage tilbagefald og metastase [4], [5]. Prostatatumorer består af kun 0,1% stamceller, men manglende udrydde denne celle subpopulation kan forårsage regenerering af tumoren og lægemiddelresistens og for at undgå gentagelse er det vigtigt at målrette alle celletyper i tumoren [5], [6 ], [7], [8]. Nye målrettede behandlinger, der er målrettet prostata cancer stamceller celle-lignende celler er stærkt berettiget.

I søgen efter specifikke markører for cancer stamceller, har aldehyd dehydrogenase (ALDH) vist lovende som en sådan markør i forskellige kræftformer, herunder blære kræft [9], lungecancer [10], hoved og hals pladecellekræft [11], brystkræft [12] og prostatakræft [13], [14]. En høj ekspression af ALDH i prostata cancer stamceller har vist sig at være positivt korreleret med Gleason score og omvendt korreleret med patientens overlevelse hos patienter med prostatacancer [13]. Høj ALDH aktivitet har med succes været anvendt til at identificere tumorfremkaldende prostatacancerceller og metastaser [14].

Signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) er en vigtig transkriptionsfaktor i mange cancertyper, og det er blevet vist at være involveret i resistens og at have anti-apoptotiske virkninger i prostata kræftceller. Konstitutivt aktiv STAT3 bidrager til onkogenese gennem opregulering af gener, der koder for anti-apoptotiske proteiner, celle cyklus regulatorer og angiogenese stimulatorer, hvilket fører til forøget overlevelse og ukontrolleret vækst af cancerceller [15]. STAT3 ekspression er foreslået at være korreleret til malignt potentiale og metastatiske adfærd i prostatacancer [16], [17]. Desuden har genekspression analyse af prostatacancer stamceller afslørede en pro-inflammatorisk fænotype og at JAK /STAT3-signalvejen er aktiv i denne cellepopulation [18]. Flere undersøgelser fremhæve STAT3 som et gyldigt mål for udviklingen af ​​nye lægemidler til prostatakræft og andre maligniteter [19], [20], [21]. Vi har vist, både

in vivo

in vitro

, at STAT3 inhibitor galiellalactone besidder væksthæmmende virkning på prostata cancer celler, der udtrykker aktiv, phosphoryleret STAT3 [22]. Galiellalactone er en metabolit produceret af svampen

Galiella rufa

og det er blevet fremstillet syntetisk som beskrevet tidligere [23]. Galiellalactone er en yderst potent og selektiv inhibitor af IL-6-signalering gennem STAT3, og menes at inhibere STAT3 signalering ved at blokere bindingen af ​​aktiveret STAT3 til DNA [24].

I denne undersøgelse har vi til formål at udforske udtryk for ALDH som markør for cancer stamcelle-lignende celler i forskellige humane prostata cancer cellelinjer og virkningerne af STAT3 inhibitor galiellalactone på ALDH udtrykker prostata kræftceller.

Materialer og metoder

celledyrkning

human prostatacancer-cellelinier DU145, LNCaP (fra American Type Culture Collection, [ATCC]) og langsigtet interleukin-6 (IL-6) stimulerede LNCaP-celler (LNCaP-IL6-celler) [25] blev anvendt. Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. LNCaP-IL6 celler blev holdt i det ovennævnte medium tilsat IL-6 (5 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Alle celler blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% O

2 og 5% CO

2. Cellerne blev brugt ved lave passager og ikke dyrket i mere end to-tre måneders mellemrum. Celler blev rutinemæssigt testet for mycoplasma og fundet fri for mycoplasma. Cell identitet blev ikke bekræftet af de forfattere. Galiellalactone blev udarbejdet af syntese som beskrevet tidligere [23].

ALDEFLUOR assay og cellesortering

Prostata kræftceller (DU145, LNCaP- og LNCaP-IL6) blev udsat for ALDEFLUOR® assay (StemCell Technologies , Aldagen, Inc., Durham, NC) efterfulgt af flowcytometri til påvisning celler med høje aktivitet af ALDH (ALDH +). Det aktive reagens BODIPY®-aminoacetaldehyd blev tilsat til cellerne, som blev konverteret af ALDH til det fluorescerende BODIPY®-aminoacetat. Den ALDH inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB) blev anvendt som en negativ kontrol. DU145 og LNCaP-IL6-celler blev behandlet med 0,50 uM galiellalactone i 24 timer og andelen af ​​ALDH + blev analyseret med ALDEFLUOR® assay. DU145 og LNCaP-IL6-celler blev underkastet cellesortering baseret på ALDH aktivitet under anvendelse af ALDEFLUOR® assay. ALDH + og ALDH- celler blev sorteret under anvendelse af BD FACSAria cellesorteringsapparat (BD Biosciences, San Jose, CA). Ikke-levedygtige celler blev udelukket ved anvendelse af 7-amino-actinomycin D farvning. ALDH + og ALDH- subpopulationer fra DU145 og LNCaP-IL6 celler blev re-belagte efter sortering og analyseret med ALDEFLUOR® assay efter en uge i kultur for at undersøge deres selvfornyende kapacitet.

Cytospin og immunhistokemisk

ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6 celler blev direkte udsat for cytospin eller genudpladede og behandlet med galiellalactone, trypsiniseret og vasket i PBS før udsat for cytospin. Cellesuspensionen blev anbragt i en cytospin tragt fastspændt på et objektglas og roteret ved 800 rpm i 2 minutter. Glassene blev lufttørret, fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og permeabiliseret med 1% Triton-X i Tris-buffer, pH 7,6 i 1 time. Objektglassene blev underkastet immunhistokemisk under anvendelse Dako Autostainer Plus og EnVision ™ + kit (Dako). De anvendte antistoffer var CD44 (BD Pharmingen), integrin α2β1 (Abcam), CD133, (c-PARP), p-STAT3 og p-NF-KB p65 (Cell Signaling Technology). Salg

apoptotiske celler

Sorted ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6-celler blev behandlet med 25 pM galiellalactone i 24 timer, underkastes cytospin og farvet for den apoptotiske markør c-PARP. Et minimum af 500 celler blev talt fra to separate forsøg og antallet af mærkede c-PARP-celler blev beregnet i forhold det samlede antal celler. Antallet af apoptotiske celler blev udtrykt som en brøkdel af det totale antal celler.

WST-1 celleproliferationsassay

WST-1 proliferation assay blev udført for at undersøge virkningen af ​​galiellalactone på proliferation og levedygtighed ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6 celler. ALDH + og ALDH- celler blev dyrket i plader med 96 brønde med en densitet på 2 000 celler /brønd i 200 pi medium. Cellerne fik lov at sætte i 24 timer. Cellerne blev behandlet med 0,50 uM galiellalactone i 24 timer. Prøver blev fremstillet i tre eksemplarer. 20 pi WST-1-opløsning (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) blev tilsat per brønd og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Absorbansen af ​​hver brønd blev målt ved anvendelse af et scanning multi-brønds spektrofotometer, ELISA-læser ved en bølgelængde på 450 nm og reference bølgelængde på 690 nm. Resultaterne er vist som procent af ubehandlede kontrolceller.

Kloning effektivitet analyse Salg

ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6-celler blev dyrket i 24-brønds plader ved en densitet af 200 celler pr. Den kolonidannelse blev målt efter en uge. Kloner blev visualiseret med krystalviolet farvning og talt. Kloningseffektiviteten blev beregnet som procent af udpladede celler.

prostatatumorxenograftmodel

Seks til otte uger gamle mandlige nøgne NMR1 mus blev holdt på en 12 timers lys-mørke-cyklus med adgang til mad og vand

ad libitum

. Eksperimentelle procedurer blev godkendt og udføres i overensstemmelse med de retningslinjer, som Malmö-Lund Komité fastsat for brug og pleje af forsøgsdyr. Nøgne mus med subkutane DU145 prostatacancercelle xenotransplantater (1 × 10

6 DU145 celler) blev underkastet daglig i.p. injektioner af galiellalactone (1 mg /kg) eller vehikel i tre uger [22]. Efter 21 dage blev musene aflivet ved ketamin injektion (50 mg /kg) efterfulgt af cervikal dislokation, og xenotransplantater blev dissekeret ud og straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere forarbejdning. Totalt RNA blev isoleret fra frosne DU145 xenotransplantater fra ubehandlede mus (n = 6) og mus behandlet med 1 mg /kg galiellalactone per dag i tre uger (n = 3).

Tumorigenicitet assay

frisk sorteret ALDH + og ALDH- populationer af DU145 og LNCaP-IL6 celler blev suspenderet i serumfrit medium /Matrigel (BD Biosciences) blanding (01:01 volumen). Seks til otte uger gamle mandlige nøgne NMR1 mus (n = 5) blev injiceret med ALDH + eller ALDH- celler subkutant i højre og venstre flanke af musen, henholdsvis i koncentrationer 10 000 eller 100 000 celler pr injektionssted. Den tumorvækst blev monitoreret under hele forsøget. Tumorstørrelse blev målt efter seks uger ved anvendelse af en skydelære og volumenet tumor (pi) blev beregnet ved formlen længde (mm) x bredde x højde x 0,5632. Musene blev aflivet med isofluran og cervikal dislokation efter 6 uge.

Kvantitativ realtids-PCR

genekspressionen af ​​CD44, CD133, integrin α2 og ALDH1A1 blev undersøgt med kvantitativ real-time PCR (q-PCR). Celler blev høstet ved kort centrifugering direkte efter cellesortering eller efter behandling med galiellalactone, og pellets blev opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-isolering. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse QIAshredder spin-søjler, og længere mRNA berigelse og yderligere vask blev udført under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen Sciences). At udelukke DNA forurening, prøver blev DNAse behandlet i 30 minutter under anvendelse RQ1 RNAse-fri DNAse (Promega). Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret under anvendelse vilkårlige hexamerer og revers transkriptase Superscript II (Invitrogen). Totalt RNA blev isoleret fra DU145 xenotransplantater under anvendelse af Trizol (Invitrogen). Fem mikrogram totalt RNA blev opnået for cDNA-syntese under anvendelse af en HPLC-oprenset Oligo dTprimer med en T7-sekvens.

Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse 6-20 ng cDNA, 250 nM forward og reverse primer i 2 × SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) i et 25 pi reaktion. Cykliseringsbetingelserne var: 10 min ved 95 ° C for at aktivere enzymet, derefter 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek. Relative ekspressionsniveauer blev kvantificeret ved den sammenlignende Ct-metoden [26] og normaliseret til ekspressionen af ​​de tre mest stabile interne kontrol gener (

HPRT

,

UBC

, og

YWHAZ

), udvalgt af geNorm software analyse som de mest stabile referencepunkter gener. Primere sekvenser var som tidligere rapporteret:

HPRT

,

UBC

og

YWHAZ

[26],

ALDH1A1

[27], CD133 [28], CD44 [29], og integrin α2 [30]. Alle primere blev syntetiseret af Invitrogen og kontrolleret for specificitet inden brug.

Statistik Salg

Resultater udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Statistisk analyse af data blev udført ved Dunnetts test eller Students t-test under anvendelse af JMP software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Resultaterne blev anset for at være statistisk signifikant ved p. 0,05

Resultater

ALDH udtryk i prostatakræft-cellelinier

DU145, LNCaP og LNCaP-IL6 celler blev undersøgt for deres ALDH aktivitet ved anvendelse af ALDEFLUOR® assay og flowcytometri. I DU145-celler 2,62 ± 0,23% af cellerne udtrykte høje ALDH aktivitet (ALDH +), 2,84 ± 0,5% af LNCaP-IL6 celler blev ALDH + og i LNCaP-celler 0.57 ± 0.34% celler viste ALDH aktivitet (n = 3-4) (Figur 1).

DU145, LNCaP og LNCaP-IL6-celler blev underkastet ALDEFLUOR® assay for at identificere celler med høj ALDH ekspression (ALDH +). Den ALDH inhibitor DEAB blev anvendt som en negativ kontrol (venstre panel). Cellerne uden inhibitor flyttet til højre blev anset ALDH + celler (højre panel).

Karakterisering af isolerede ALDH + celler

karakteristika ALDH + og ALDH- cellepopulationer isoleret fra DU145 og LNCaP-IL6 celler blev undersøgt med hensyn til selvfornyende og kolonidannende kapacitet og tumorgenicitet.

sorteres ALDH + og ALDH- subpopulationer fra DU145 og LNCaP-IL6 celler blev re-belagte efter sortering og analyseret med ALDEFLUOR ® assay efter en uge i kultur for at undersøge deres selvfornyende kapacitet. Efter en uge i kultur små populationer af ALDH + celler blev påvist blandt ALDH- DU145 og ALDH- LNCaP-IL6-celler (0,26 ± 0,24% og 0,36 ± 0,05% henholdsvis, n = 2). Men efter en uge i kultur efter sortering de ALDH + LNCaP-IL6 og ALDH + DU145 cellekulturer reetableret deres parentale fænotype og udgjorde en population ligner det oprindelige parentale cellelinje med 2,24 ± 1,23% og 1,24 ± 0,14% ALDH + -celler henholdsvis (n = 2).

kolonidannende effektivitet var signifikant større i ALDH + -celler sammenlignet med ALDH- celler fra både LNCaP-IL6 og DU145 celler (figur 2A). Den ALDH + kloner dannet var synligt større end ALDH- kloner. Tumorigeniciteten af ​​ALDH + og ALDH- celler frisk sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6-celler blev undersøgt ved at injicere 10 000 eller 100 000 celler subkutant i flanken af ​​nøgne mus (n = 5) og tumorvækst blev monitoreret ugentligt. ALDH + -celler viste en større tumor dannelse kapacitet i forhold til ALDH- celler fra både DU145 og LNCaP-IL6-celler og opdagelsen af ​​tydelige tumorer blev forsinket i ALDH- celler (figur 2B). De ALDH + tumorer var signifikant større end de ALDH- tumorer efter seks uger (Figur 2C).

ALDH + celler viser stamceller celle-lignende egenskaber i form af øget kolonidannende kapacitet og tumorgenicitet. A. klongenicitetsassayet. 200 celler /brønd blev podet, og kolonier blev talt efter 1 uge. Clonogenicity blev beregnet som procent dannede kolonier i forhold til celler podet (n = 2; p 0,05). B. Tumorigenicitet assay. Tumor tage efter subkutane injektioner af 10 000 eller 100 000 celler frisk sorteret ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6 (n = 5). C. tumorstørrelse af ALDH + og ALDH- celle xenotransplantater efter 6 uger (n = 5). ALDH + celle tumorer fra 100 000 celler injiceret subkutant var betydeligt større end de ALDH- celletumorer til både DU145 celler (p = 0,0002) og LNCaP-IL6 celler (p = 0,0077).

Angivelse af diverse biomarkører relateret til stamceller

ekspression af forskellige biomarkører formodentlig relateret til cancer stamceller blev undersøgt i frisk sorteres ALDH + og ALDH- fraktioner af DU145 og LNCaP-IL6 celler (Figur 3). CD44 blev påvist ved immunhistokemi i både ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 celler, og ekspressionen var mere intens i ALDH + -celler sammenlignet med ALDH- celler (figur 3A). CD44 immunfarvning blev observeret i de fleste ALDH + LNCaP-IL6-celler i modsætning til ALDH- LNCaP-IL6 celler, hvor færre celler blev farvet for CD44. Integrin α2β1 blev udtrykt i både ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 celler, og ekspressionen var mere intens i ALDH + celler sammenlignet med ALDH- celler. Integrin α2β1 blev udtrykt i ALDH + celler fra LNCaP-IL, men kun nogle få celler udtrykte integrin α2β1 i ALDH- celler. CD133 var ikke påvises i ALDH + og ALDH- celler fra både DU145 og LNCaP-IL6 celler. Ekspressionen af ​​aktiv STAT3 og NF-KB blev undersøgt i ALDH + og ALDH- fraktioner af DU145 og LNCaP-IL6-celler (figur 3A). Øget p-STAT3 ekspression blev observeret i ALDH + celler sammenlignet med ALDH- celler fra begge cellelinier. P-NF-KB-p65 blev påvist i ALDH + DU145 celler, men ikke i ALDH- DU145, ALDH + LNCaP-IL6 eller ALDH- LNCaP-IL6 celler.

A. Frisk sorteret ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6-celler blev underkastet cytospin og farvet for CD44, integrin α2β1, p-STAT3 og p-NF-KB p65. B. Den relative mRNA ekspressionen af ​​CD44 og integrin α2 i ALDH + og ALDH- celler frisk sorteret fra DU1145 og LNCaP-IL6 celler.

genekspressionen af ​​CD44, integrin α2 og CD133, blev undersøgt med kvantitativ -PCR. (Figur 3B). mRNA ekspressionsniveauer af CD44 og integrin α2 blev forøget i ALDH + celler sammenlignet med ALDH- celler fra LNCaP-IL6-celler. Der var ingen forskel i mRNA niveau af CD44 og integrin α2 i ALDH + og ALDH- celler fra DU145. mRNA-niveauer af CD133 var ikke påviselig i ALDH + og ALDH- celler fra både DU145 og LNCaP-IL6-celler.

Galiellalactone formindsker andelen af ​​ALDH + -celler

DU145 og LNCaP-IL6-celler blev behandlet med galiellalactone (5, 10, 25 eller 50 uM) i 24 timer og underkastet ALDEFLUOR® assay for at undersøge virkningen af ​​galiellalactone på andelen af ​​ALDH + -celler sammenlignet med vehikel. Galiellalactone faldt andelen af ​​ALDH + celler af både DU145 og LNCaP-IL6-celler på en dosisafhængig måde (figur 4A). Inkubation med galiellalactone ved 25 uM i 24 timer faldt betydeligt andelen af ​​ALDH + DU145 celler med 51% (p = 0,0013), og andelen ALDH + LNCaP-IL6 celler med 75% (p = 0,0441).

A. DU145 og LNCaP-IL6-celler blev behandlet med galiellalactone (5-50 uM) i 24 timer og underkastet ALDEFLUOR® assay. Andelen af ​​ALDH + celler faldt betydeligt grundet galiellalactone behandling på en dosisafhængig måde. Andelen af ​​ALDH + -celler er udtrykt som middelværdi ± SEM (n = 2-4). Andelen af ​​ALDH + DU145-celler blev signifikant nedsat ved galiellalactone ved koncentrationerne 10 uM (p = 0,0060), 25 pM (p = 0,0013) og 50 pM galiellalactone (P 0,0001). Andelen af ​​ALDH + LNCaP-IL6-celler blev signifikant reduceret med galiellalactone ved koncentrationerne 25 uM (p = 0,0441) og 50 pM (p = 0,0445). B. Relativ mRNA ekspression af ALDH1A1 i DU145-xenotransplantater i mus behandlet med 1 mg /kg /dag galiellalactone i tre uger. Kontrolmus modtog vehikel. Den relative mRNA ekspressionen af ​​ALDH1A1 blev reduceret i galiellalactone behandlede mus sammenlignet med kontrol (0,139 ± 0,107 og 0,644 ± 0,161 henholdsvis p = 0,07, n = 3-6).

Galiellalactone nedsætter ALDH1A1 mRNA-ekspression i DU145 xenotransplantater

Mus med DU145 xenotransplantater blev behandlet med vehikel eller 1 mg /kg galiellalactone dagligt i tre uger, blev tumorerne høstet og genekspressionen blev analyseret. MRNA udtryk for

ALDH1A1

var 4,6 gange lavere i galiellalactone behandlede xenotransplantater sammenlignet med kontroller (figur 4B).

Galiellalactone hæmmer formeringen og fremkalder apoptose af ALDH + celler

Sorteret ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6-celler blev behandlet med 25 pM galiellalactone i 24 timer og immunfarvet for den apoptotiske markør c-PARP (Figur 5A). Et øget antal c-PARP-positive celler blev påvist i galiellalactone behandlet ALDH + og ALDH- celler sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A). Den apoptotiske respons i ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6-celler behandlet med 25 pM galiellalactone i 24 timer blev kvantificeret ved tælling c-PARP udtrykkende celler (figur 5B). Behandling med galiellalactone forøgede signifikant mængden af ​​c-PARP udtrykkende celler i ALDH + DU145, ALDH + LNCaP-IL6 og ALDH- LNCaP-IL6-celler sammenlignet med ubehandlede kontroller. De ALDH + celler viste en større apoptotisk respons på galiellalactone forhold til ALDH- celler som målt ved C-PARP ekspression. Men denne forskel var ikke signifikant (p = 0,059 for DU145 celler og p = 0,119 for LNCaP-IL6 celler, n = 2). Effekten af ​​galiellalactone levedygtighed og spredning af ALDH + og ALDH- celler blev undersøgt (figur 5C). Galiellalactone reducerede proliferation af både ALDH + og ALDH- celler isoleret fra DU145 og LNCaP-IL6-celler på en dosisafhængig måde (figur 5C). De ALDH + -celler var betydeligt mere følsomme over for galiellalactone behandling end de ALDH- celler sorteret fra DU145 celler. Der var imidlertid ingen signifikant forskel i følsomhed over for galiellalactone mellem ALDH + og ALDH- LNCaP-IL6-celler.

A. ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6-celler blev behandlet med 25 pM galiellalactone i 24 timer. Apoptotiske celler blev detekteret ved C-PARP-farvning. B. Kvantificering af c-PARP farvede apoptotiske celler i ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6-celler og behandlet med 25 pM galiellalactone i 24 timer. Behandling med galiellalactone forøgede signifikant mængden af ​​c-PARP udtrykkende celler i ALDH + DU145, ALDH + LNCaP-IL6 og ALDH- LNCaP-IL6-celler sammenlignet med ubehandlede kontroller (p = 0,019, 0,035 og 0,009 henholdsvis; n = 2). Forskellen i apoptotisk respons mellem galiellalactone behandlet ALDH + og ALDH- celler fra DU145 og LNCaP-IL6-celler var ikke signifikant (p = 0,059 og p = 0,119, henholdsvis n = 2). C. Galiellalactone faldt levedygtighed ALDH + og ALDH- celler sorteret fra DU145 og LNCaP-IL6 celler. De ALDH + DU145-celler var signifikant mere følsomme over for galiellalactone sammenlignet med de tilsvarende ALDH- celler ved 5 uM (p = 0,0017), 10 pM (p = 0,0010), 25 pM (p = 0,0019) og 50 pM (p = 0,0025). Resultater er præsenteret som gennemsnit procent af ubehandlet kontrol (n = 2).

Discussion

Prostatacancer stamceller vist sig at være androgenuafhængig og mangler ekspression af et funktionelt androgenreceptor [6], [18], som gør dem immune over for androgen deprivation terapi (ADT). I en musemodel for prostatacancer, forøget ekspression af stamcellemarkører blev observeret efter ADT [31]. Endvidere cancer stamceller er resistente over for nuværende kemoterapi og ALDH udtrykkende cancer stamceller har vist modstand mod og berigelse af paclitaxel behandling [32]. Kræften stamceller karakteristika såsom langsom vækst, multiresistens, øget DNA-reparation, høj ekspression af anti-apoptotiske proteiner [33], og i prostatakræft den manglende reaktion på ADT, gør disse celler meget vanskeligt at målrette med konventionel prostata cancerterapi. skal derfor udvikles nye terapeutiske modaliteter, for at målrette både tumor bulk og de cancer stamceller.

I den foreliggende undersøgelse vi identificeret kræft stamceller celle-lignende subpopulationer i dyrkede prostatakræft-cellelinier, der responderede på behandlingen med STAT3 inhibitor galiellalactone. En lille del (2-4%) af cellelinjen populationer udviste høj ALDH aktivitet. Disse ALDH + celler afslørede stamcellelignende karakteristika såsom øget kolonidannende og selvfornyende kapacitet og høj tumorigenicitet samt ekspression af formodede prostatacancer stamcellemarkører. Disse celler reagerede på behandling med galiellalactone.

evne rekonstituering en heterogen masse er en definition af cancer stamceller, og vi fandt, at isolerede ALDH + prostatacancerceller var i stand til selv-fornyelse og reetablering af den parental cellelinie og besad høj tumorgenicitet

in vivo

in vitro

. Den ALDH + population af LNCaP-IL6-celler havde en høj ekspression af det formodede prostata cancer stamceller markører CD44 og integrin α2β1 [34] i forhold til ALDH- befolkning. Men vi ikke registrere CD133 udtryk i ALDH + eller ALDH- prostata kræftceller. Dette er i overensstemmelse med den seneste undersøgelse fra Pfeiffer og Schalken [35] tyder på, at CD133 er ikke en markør for stamceller i prostata cancer cellelinjer. Øget JAK /STAT3 og NF-KB-aktivitet udtrykkes i stamceller og tumorfremkaldende stamceller-lignende celler i prostatacancer [18], [36] og vores fund af aktiv STAT3 og NF-KB i ALDH + -celler er i overensstemmelse med dette forslag . Tilsammen vores resultater og andre [14], viser, at ALDH udtryk kan være et middel til at identificere kræft stamceller celle-lignende celler i prostatakræft.

kræft stamcelle-lignende ALDH + populationen var større i lang udtrykket IL-6 stimulerede LNCaP-celler sammenlignet med LNCaP-celler, der understøtter det synspunkt, at prostatakræft stamceller viser en pro-inflammatorisk fænotype [18], [37]. Genekspressionsprofilering af prostatacancer stamceller viser, at STAT3 signalvejen overudtrykkes i disse celler [18] og flere undersøgelser peger på STAT3 som mål for terapeutisk indgriben i tumor stamceller [38], [39]. Dette er i overensstemmelse med vores fund, at ALDH + stamcelle-lignende celler fra prostatacancercellelinjer udtrykte aktiv STAT3 og at disse ALDH + -celler reagerede på STAT3 inhibitor galiellalactone, som tidligere er blevet vist at inducere apoptose af prostatacancerceller med konstitutiv ekspression af aktiv STAT3 [22]. Dosis-respons relateret fald i andelen af ​​ALDH + -celler i DU145 og LNCaP-IL6 cellepopulationer og induktion af apoptose af disse celler efter galiellalactone behandling antyder, at disse cancer stamcellelignende celler er følsomme for STAT3-inhibering. Noteably, viste DU145 xenografter fra galiellalactone behandlede mus reduceret genekspression af

ALDH1A1

sammenlignet med ubehandlede DU145 xenografter indikerer, at galiellalactone kan målrette prostatakræft stamceller celle-lignende celler også

in vivo

. Vi har tidligere vist, at ekspressionen af ​​de STAT3 gener

BCL2L1

MCL1

blev nedreguleret ved galiellalactone yderligere bekræftelse af STAT3 hæmmende virkning af lægemidlet

in vivo

[22].

Andre naturlige produkter udover galiellalactone er blevet vist at inhibere cancer stamceller. Sesquiterpenlacton parthenolid og curcumin er cytotoksiske for cancer stamceller og målrette cellerne ved at hæmme aktiviteten af ​​NF-KB og STAT3 [40], [41]. Målretning af STAT3 vej i prostata cancer stamceller celle-lignende celler med naturlige produkt afledte forbindelser kan være et lovende terapeutisk tilgang til udviklingen prostata cancer medicin.

Som konklusion, prostatakræft-cellelinier indeholdt ALDH + subpopulationer med stilk celle- lignende egenskaber som udtrykte phosphoryleret STAT3. Disse subpopulationer blev tydeligt hæmmet af STAT3 inhibitor galiellalactone. Disse resultater understreger, at målrette STAT3 pathway i prostatacancerceller, herunder prostatacancer stamcellelignende celler, kan være en hidtil ukendt potent behandlingsstrategi hos patienter med fremskreden prostatacancer resistente over for ADT og cytotoksisk terapi og at galiellalactone er en vigtig forbindelse for at studere STAT3 signalering i prostatakræft og en potentiel udgangspunkt for udviklingen af ​​fremtidige prostata cancer medicin.

Tak

på Institut for Klinisk Institut, Malmö, Lunds Universitet, Skåne Universitetshospital, Malmø, Sverige ønsker vi at takke Susan Evans Axelsson for fremragende hjælp med dyreforsøg, Elise Nilsson til at udføre immunhistokemi og Per-Anders Bertilsson for fremragende hjælp med cellesortering. Vi ønsker også at takke professor Zoran Culig ved Institut for Urology, Innsbruck Medical University, Innsbruck, Østrig for den generøse gave af LNCaP-IL6 celler.