PLoS ONE: Gemcitabin inducerer Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) Nedbrydning gennem Autophagy i pancreas Cancer

Abstrakt

Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), og autophagy spille mere og mere vigtige roller i DNA-skader reparation og celledød. Gemcitabin (GEM) er fortsat den første linje kemoterapeutiske stof til kræft i bugspytkirtlen (PC). Men lidt om forholdet mellem PARP-1-ekspression og autofagi som reaktion på GEM. Her demonstrerer vi, at GEM inducerer DNA-skade responset og nedbrydning af mono-ADP ribosyleret PARP-1 gennem autophagy vej hos PC celler, som er reddet ved at hæmme autofagi. Hypoxi og serumudsultning inhiberer autophagic aktivitet på grund af ophævet GEM-induceret mono-ADP-ribosyleret PARP-1 nedbrydning. Aktivering af ekstracellulære regulerede proteinkinaser (ERK) induceret af serum sult viser forskelle i intracellulær lokalisering samt modulation af autophagy og PARP-1 nedbrydning i GEM-følsomme KLM1 og resistente KLM1-R-celler. Vores undersøgelse har afsløret en ny rolle autophagy i PARP-1 nedbrydning i respons på GEM, og de forskellige virkninger af MEK /ERK signalvejen på autophagy mellem GEM-følsomme og resistent PC celler

Henvisning:. Wang Y, Kuramitsu Y, Tokuda K, Baron B, Kitagawa T, Akada J, et al. (2014) Gemcitabin inducerer Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) Nedbrydning gennem Autophagy i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (10): e109076. doi: 10,1371 /journal.pone.0109076

Redaktør: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: 11 oktober, 2013; Accepteret: September 8, 2014; Udgivet: 1 okt 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af tilskud nr. 24501352, www.jsps.go.jp/g-grantsinaid. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gemcitabin (GEM) er i øjeblikket den standard behandling for avanceret og metastatisk pancreascancer (PC) i både adjuvans og palliative indstillinger, men modstanden mod GEM har været et stort problem som sin svarprocenten er blevet reduceret til 20% [1] – [4]. GEM kan hæmme DNA-syntesen ved at målrette ribonukleotidreduktase, hvilket fører til dets optagelse i cellulære DNA, der forårsager DNA replikation fejl [5], [6]. En tidligere undersøgelse har rapporteret, at GEM-induceret DNA-replikation stress, gået i stå replikationsgafler og udløste checkpoint signalveje [7]. Hæmning af checkpoint kinase 1 (Chk1) med kemiske inhibitorer induceret sensibilisering af PC celler som reaktion på GEM [8], [9]. Desuden mismatch reparation-mangelfulde HCT116 celler er mere følsomme

in vitro

til GEM-medieret strålingssensibilisering [8]. Selvom beviserne har vist sammenhængen mellem DNA-reparation og sensibilisering af celler til GEM, er de mekanismer, der er ansvarlige for reparation af GEM-induceret DNA-skader ikke klart forstået.

Autophagy er en cellulær sti involveret i den rutinemæssige omsætning af proteiner eller intracellulære organeller med tætte forbindelser til sygdom hos mennesker og fysiologi [10]. Autophagic dysfunktion associeret med cancer, neurodegeneration, mikrobiel infektion og såvel som resistens af cancerceller til anticancerterapi [11], [12]. GEM induceret autophagy i Panc-1 og MiaPaCa-2-celler, og inhibering af autophagy med 3-methyladenin (3-ME) eller vacuolen membranprotein 1 knockdown faldt apoptose i gemcitabin-behandlede celler [13]. dette beviser indikerer derfor, at autofagi kan spille en væsentlig rolle i apoptose af PC celler som respons på GEM.

Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) spiller kritiske roller i mange molekylære og cellulære processer , herunder DNA beskadigelse reparation, genomstabilitet, transkription og apoptose [14]. PARP1 er involveret i reparation af både enkeltstrenget DNA (ssDNA) og dobbeltstrenget DNA (dsDNA) pauser ved binding med DNA-ender og /eller interaktion med DNA reparation proteiner, eksempel (ataksi Telangiectasia Muterede) ATM og Ku-underenheder [15 ] – [18]. Inhibering af PARP-1 øger cytotoksiciteten af ​​DNA-skadelige midler og stråling

in vitro

[19]. PARP-1 inhibitorer er blevet rapporteret som potentielle kemoterapeutiske lægemidler for BRCA1 /BRCA2-deficient brystcancer og lungecancer [20] – [21]. Derfor er det nødvendigt at vurdere ændringer af PARP-1 er ansvarlig for GEM-induceret DNA-skader i PC.

I den foreliggende undersøgelse viser vi, at mikrotubulus-associeret protein 1A /1B-let kæde 3 (LC3) , en vigtig faktor autophagosome dannelse, nedreguleres i KLM1-R i forhold til KLM1 celler. GEM inducerede en DNA-skader respons og autofagi i KLM1 og KLM1-R-celler og nedreguleret PARP-1-ekspression. Inhibering af autophagy blokeret GEM-induceret nedbrydning af mono-ADP ribosyleret PARP-1. MEK /ERK signalvej viste en anden effekt på autofagi og GEM-induceret PARP-1 nedbrydning mellem KLM1 og KLM1-R-celler. Således fremhæver vi ny indsigt om autophagy vej i reguleringen PARP-1 nedbrydning i PC celler.

Materiale og metoder

Materialer

U0126 (9903S) og wortmannin (9951S) blev købt fra Cell Signaling Technology. Antistofferne er specifikke for p-ERK (sc-7383), ERK (sc-94200), p21 (sc-65595), Hsp27 (sc-13132), PARP-1 (sc-8007 til Western blot og sc-1562 om bekræftelse og immunfluorescens), CTIP (sc-3970) og actin (sc-1616) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Antistofferne er specifikke for LC3A /B (4108S), SIRT6 (12486), caspase-3 (9665) og PI3KCIII (4263S) blev købt fra Cell Signaling Technology. Antistofferne er specifikke for Bcl2 (B3170), Ulk1 (SAB4200106) og Beclin1 (B6061) blev indkøbt fra Sigma. Antistofferne er specifikke for AMPKa1 (07-350) blev købt fra Millipore.

Cell kultur

Alle cellelinier, der anvendes i denne undersøgelse blev tidligere offentliggjorte cellelinjer, som blev leveret til os som en gave . Menneskelig bugspytkirtlen cellelinie KLM1 (ID: TKG0490) blev klonet og etableret af Dr. Kobari M fra Institut for afdelingen, Aldring og Kræft, Tohoku Universitet (Sendai, Japan) i 1996 [39]. GEM-følsomme KLM1 og resistente KLM1-R humane bugspytkirtelkræft cellelinjer var generøst leveres som en gave ved Institut for Kirurgi og videnskab på Kyushu University Graduate School of Medical Science. KLM1-R er blevet etableret udsætte KLM1 celler til GEM i tidligere undersøgelser [40] – [41]. Disse celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640; GIBCO, 05.918), suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, GIBCO, 26.140-079), og 2 mM L-glutamin og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2.

Transient transfektion

KLM1 celler blev podet og inkuberes ved 37 ° C i en CO

2 inkubator indtil cellerne er 70% sammenflydende. Cellerne blev transficeret med validerede human LC3B siRNA (sc-43.390, Santa Cruz Biotechnology) eller kontrol siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology) ved at følge en siRNA Transfektion Protocol (Santa Cruz Biotechnology).

Western blotting

cellerne blev lyseret med lysepuffer ((1% NP-40, 1 mM natriumvanadat, 1 mM PMSF, 50 mM Tris, 10 mM NaF, 10 mM EDTA, 165 mM NaCl, 10 ug /ml leupeptin og 10 ug /ml aprotinin) på is i 1 time. Cellelysater blev derefter centrifugeret ved 15.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. supernatanten blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved Lowry-assay. Lige mængder af protein (20 ug) blev opløst ved 5-20% SDS-polyacrylamidgel og derefter overført på PVDF membran (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA).. membranen blev inkuberet med det passende primære antistof ved 4 ° C natten over derefter membranen blev vasket og inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. de immunblots blev visualiseret med et kemiluminescens-reagens (Immunostar, Wako). Alle forsøg blev gentaget tre gange.

Immunofluorescens

Celler blev dyrket på 15 mm runde dækglas i 12 brønds plader ved en densitet på 1 x 10

5 celler pr. Celler på dækglassene blev fikseret under anvendelse af frisk 3,7% paraformaldehyd i phosphatpufret saltopløsning (PBS) i 30 minutter, når de nåede 70-80% konfluens. Prøver blev derefter vasket med PBS, efterfulgt af permeabilisering med 0,1% Triton X-100 i 15 min. Efter vask med PBS blev de inkuberet i blokerende opløsning (1% gedeserum eller 1% donkey serum i PBS med 0,1% Tween 20) i 1 time ved stuetemperatur. Celler blev behandlet med et primært antistof i blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C. Efter inkubation med primært antistof blev celler skyllet med PBS med 0,1% Tween 20 (PBS-T) og inkuberet med et sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS-T, deres kerner var modfarvet med 1,43 uM DAPI (4,6′-diamidino-2-phenylindol) i 5 minutter. Dækglas blev vasket med PBS-T og derefter monteret med forsiden nedad på objektglas med Fluoromount (Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Konfokal billeder blev opnået ved hjælp af Nikon Plan Apo 60X /1,40 mål, BZ-9000-serien (BIOREVO) og BZ-II Viewer software (Keyence, Osaka, Japan) af en operatør, der var uvidende om den eksperimentelle tilstand. Alle parametre blev holdt konstant inden for hvert eksperiment. Digitale billeder blev analyseret og den gennemsnitlige intensitet blev målt under anvendelse Billede J. software.

Apoptose assay

Et passende antal celler blev udpladet og behandlet i 24 timer. Celler blev farvet ved anvendelse af Apo-BrdU

In Situ

DNA fragmentation Assay kit (80101, BioVision, Inc.) (data ikke vist) eller Caspaser 3/7 assay kit (12D51, Immunochemistry Technologies, LLC.). Disse forsøg blev udført nøje følge instruktionerne for de relative protokoller.

Resultater

Gemcitabin (GEM) inducerer autofagi i PC celler

To PC kræft cellelinjer GEM-sensitiive KLM1 og resistent KLM1-R, blev anvendt i denne undersøgelse. Disse cellelinier er defineret ved deres ekspression af varmechokprotein 27 (Hsp27) (Fig 1 A og B.), Som er blevet rapporteret som en potentiel markør for PC-resistent over for GEM [22] – [24]. Desuden ekspressionen af ​​p21 viste sig at blive reduceret i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler (Fig. 1 B), hvilket indikerer de forskellige fænotyper af cellecyklus mellem dem. Vi derefter undersøgt autophagic aktivitet i KLM1 og KLM1-R-celler, som blev bestemt ved ekspression af LC3 [25]. Vi viste, at både LC3-I og II blev nedreguleret i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler (Fig. 1 B). Desuden nedregulering af AMP-aktiveret protein kinase A1 (AMPKa1) og unc-51-lignende kinase 1 (Ulk1) blev vist, i modsætning phosphatidylinositol 3- kinase (PI3K CIII) eller spiralsnoet myosin-lignende BCL2-interagerende protein ( Beclin-1), i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler (fig. S1 A og B), hvilket indikerer, at reduktionen af ​​autophagic aktivitet i GEM-resistent KLM1-R-celler kan være relateret til den nedregulering af AMPKa1 og /eller Ulk1 ekspression. For at bestemme virkningen af ​​autofagi induceret af GEM blev celler behandlet med GEM i 5 timer (h) og aflæses derefter ved immunofluorescens-mikroskopi under anvendelse af anti-LC3 antistoffarvning. I denne forsøgsopstilling, demonstrerede vi, at LC3 II pletter blev forøget efter at cellerne blev udsat for GEM (fig. 1 C). Disse data antydede, at GEM inducerer autofagi i PC celler.

(A) Ekspressionen af ​​Hsp27 blev testet ved Western blot og den relative intensitet blev målt ved studenterrelaterede

t

test (n = 3 ) (B) KLM1 og KLM1-R-celler blev lyseret og opløst ved SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer. Actin blev anvendt til at normalisere lastning niveauer af protein. (C) De angivne celler blev behandlet med 100 ug /ml GEM i 5 timer og ekspressionen af ​​LC3A /B og dannelse af LC3-positive autophagosomes blev undersøgt ved konfokal mikroskopi. LC3A /B: grøn og DAPI: blå. Pile angiver autophagosome. Scale bar, 20 pm.

GEM specifikt nedregulerer mono-ADP ribosyleret PARP-1 i en caspase-uafhængig måde

Vi yderligere testet effekten af ​​GEM på PARP-1 ekspression i PC celler under anvendelse af en western blot-analyse. KLM1 og KLM1-R viste en bemærkelsesværdig reduktion af PARP-1, når celler blev udsat for 10 eller 100 ug /ml GEM i 24 timer (fig. 2 A). Interessant nok blev det observeret, at de reducerede bånd af PARP-1 i GEM-inducerede paneler udviste en lille stigning i molekylvægt end i de ubehandlede paneler. Således Dette antydede, at GEM specifikt inducerede nedregulering af PARP-1, som var mono-ADP ribosyleret (fig. 2 A). Zhiyong Mao

et al.

Havde defineret det øvre bånd af PARP-1 som mono-ADP ribosyleret form ved lysinrest 521, som blev induceret ved sirtuin 6 (SIRT6) [26]. SIRT6 er en mammal homolog af gæren SIR2 deacetylase og involveret i cytokinproduktion og migrering af PC [27]. Desuden viste KLM1-R en højere følsomhed over for GEM-induceret nedregulering af PARP-1 end KLM1 celler. Ti ug /ml GEM var nok til at reducere meget af PARP-1-ekspression i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler (Fig. 2 A). For at finde forklaringen, derefter sammenlignet vi udtryk for SIRT6 mellem KLM1 og KLM1-R-celler. Forventeligt SIRT6 viste stærkere ekspression (ca. 1,5 gange) i KLM1-R end KLM1 celler (Fig. 2 A). Dette indikerede, at effektiviteten af ​​perle på nedregulering af mono-ADP ribosyleret PARP-1 kan afhænge af ekspressionen af ​​SIRT6. Vi bemærkede også, at GEM inducerede overekspression af CtBP-interagerende protein (CTIP) i både KLM1 og KLM1-R-celler (Figur 2 A). Fordi caspasefamilien protease spalter død substrat PARP-1 til en specifik 85 kDa formen observeret under apoptose [28], Derefter undersøgte vi, om caspase-3/7 henholdsvis relateret til PARP-1 nedregulering heri. Vi viste, at niveauet af caspase-3/7 Aktivitetsmenutast samt apoptose viste ingen forskelle mellem KLM1 og KLM1-R-celler, selv når cellerne undergik GEM behandling i 24 timer som vist ved Western blotting (fig. 2 A) og caspase-3 /7-aktivitet assay (fig. 2 B). Disse data antydede, at GEM specifikt nedreguleret mono-ADP ribosyleret PARP-1 i en caspase-uafhængig måde.

(A) KLM1 og KLM1-R-celler blev behandlet ved GEM med de angivne koncentrationer i 24 timer. Cellelysater blev opløst i SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer. Ekspressionen af ​​PARP-1 blev bekræftet gentagne gange ved et tydeligt PARP-1-antistof er beskrevet i Materialer. En pil hoved indikerede mono-ADP ribosyleret form af PARP-1. Pile angivne position området spaltet caspase-3. (B) De angivne celler blev behandlet som i (A) og derefter farvet under anvendelse af en caspaser 3/7 assay kit (A). Caspase 3/7 aktivitet blev testet og målt ved konfokal mikroskopi og Image J. N.S., ikke-signifikant. Fejl barer, SD.

GEM undertrykker ekspressionen af ​​mono-ADP ribosyleret PARP-1 gennem autophagy nedbrydningsvej

Som GEM induceret autophagy og mono-ADP ribosyleret PARP-1 nedregulering i en caspase-uafhængig måde, undersøgte vi, om mono-ADP ribosyleret PARP-1 kunne nedbrydes direkte af autofagi. KLM1 og KLM1-R-celler blev farvet med både anti-LC og anti-PARP-1-antistof efter celler blev udsat for GEM i 5 timer og derefter undersøgt ved immunofluorescens-mikroskopi. GEM-induceret autophagosome formation viste sig at co-localizate med PARP-1 i både KLM1 og KLM1-R-celler (fig. 3 A), der angiver forholdet mellem autofagi og PARP-1. For at teste GEM-induceret nedregulering af mono-ADP ribosyleret PARP-1 til autofagi blev LC3B siRNA, wortmannin (a PI3K inhibitor) og PMSF (a vakuolær proteasehæmmer) anvendes til at inhibere autofagi af celler som respons på GEM. GEM induceret PARP-1 mono-ADP ribosylering og nedregulering i KLM1 og nedregulering af PARP-1 blev vendt ved LC3B knockdown (Figur 3 B). Denne reduktion af PARP-1-ekspression ved GEM i både KLM1 og KLM1-R celler blev også reddet af behandling med enten wortmannin eller PMSF (fig. 3 C). Sammen demonstrerede disse data, at GEM-induceret nedregulering af mono-ADP ribosyleret PARP-1 blev medieret af autophagy nedbrydningsvej.

(A) KLM1 og KLM1-R-celler blev behandlet med 100 ug /ml af GEM i 5 timer. Behandlede celler blev farvet med specifikke antistoffer mod LC3A /B og PARP-1 og derefter detekteret ved konfokal mikroskopi. LC3A /B: grøn, PARP-1: rød og DAPI: blå. Scale bar, 20 pm. Pile angiver den gule farvning af co-lokaliseringer mellem autophagosome og PARP-1. (B) KLM1 celler blev udsat for GEM i 24 timer efter LC3B knockdown. (C) KLM1 og KLM1-R-celler blev udsat for GEM i 24 timer i stede eller fraværende af enten PMSF eller wortmannin ved de angivne koncentrationer. Cellelysater blev opløst ved SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer mod at PARP-1. Pilen hoved angiver mono-ADP ribosyleret form af PARP-1. Udtrykket af PARP-1 blev bekræftet gentagne gange af en distinkt PARP-1 antistof beskrevet i Materials.

Serum sult inducerer aktivering og anderledes lokalisering af ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK) i KLM1 og KLM1- R-celler

for at bestemme virkningen af ​​serum sult på ERK aktivitet og autofagi blev celler dyrket i frisk medium med eller uden FBS i 24 timer og undersøgt ved Western blot og immunofluorescens-mikroskopi. Vi påviste, at ERK blev aktiveret ved serumudsultning i KLM1 og KLM1-R-celler, og at GEM har nogen virkning på ERK-aktivitet (fig. 4 A). Næste vi undersøgte den intracellulære lokalisering af phospho-ERK ved immunfluorescens i KLM1 og KLM1-R-celler. Interessant nok blev en bemærkelsesværdig forskel i intracellulær lokalisering af p-ERK vist mellem dem. Under serum sult, blev p-ERK delvis translokeres til kernen i KLM1 celler; tværtimod aktiverede ERK var til stede alene i cytoplasmaet i KLM1-R-celler (fig. 4 B). Disse resultater antydede, at serumudsultning induceret aktivering af ERK i begge KLM1 og KLM1-R, men resulterede i en forskel i intracellulær lokalisering mellem dem.

(A) KLM1 og KLM1-R-celler blev dyrket i medium med eller uden FBS eller udsættes for 10 ug /ml GEM i 24 timer. Cellelysater blev opløst ved SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer mod p-ERK og ERK. (B) og (C) De angivne celler blev farvet med specifikke antistoffer mod p-ERK, Hsp27 og LC3A /B, efter celler blev dyrket i medium med eller uden FBS i 24 timer. DAPI: blå og p-ERK: rød i (B) og LC3A /B: grøn og Hsp27: rød i (C). Scale bar, 20 pm.

Serum sult undertrykker GEM-induceret PARP-1 nedbrydning ved at hæmme autophagy via ERK signalvejen

Vi næste undersøgte autophagic aktivitet efter serum deprivation i KLM1 og KLM1-R-celler i kombination med et ekstracellulært signal-reguleret (ERK) kinase (MEK) inhibitor, U0126, at vurdere virkningerne af MEK /ERK vej på autofagi. Vi viste, at ekspressionen af ​​LC3 blev reduceret med serumudsultning over et tidsforløb på 24 timer i KLM1 og KLM1-R-celler (fig. 5 A og B) og reddet af U0126 i KLM1 (fig. 5 A), men meget mindre i KLM1-R (fig. 5 B). Aktiviteten af ​​ERK stadig viste en stigende tendens i KLM1-R ved behandling med U0126 (fig. 5 B), hvilket indikerer en tolerance over for U0126 i KLM1-R sammenlignet med KLM1 celler. Disse data indikerede, at serumudsultning-induceret autophagy inhibering blev medieret af MEK /ERK signalvej. Under serum sult, U0126 havde ingen virkning på ekspressionen af ​​B-celle leukæmi /lymfom 2 (Bcl2) i KLM1 og KLM1-R-celler og reduktion af p21 blev forsinket ved behandling med U0126 i KLM1 men ikke i KLM1-R-celler ( fig. S2 A og B), hvilket antyder, at MEK-inhibitor havde forskellige virkning på cellecyklusprogression mellem KLM1 og KLM1-R-celler. Fordi MEK-inhibitor viste anderledes effekt på modulationen af ​​autophagy mellem KLM1 og KLM1-R-celler under serum sult, undersøgte vi dens effektivitet på PARP-1 nedbrydning som reaktion på GEM. Faktisk var GEM-induceret PARP-1 nedbrydning inhiberes af serum sult i både KLM1 og KLM1-R-celler i et caspase-uafhængig måde og blev tilbageføres i KLM1 celler ved U0126 (fig. 5 C og D). Desuden behandling af U0126 alene havde ingen indflydelse på PARP-1-ekspression. Disse data antydede, at serum sult undertrykker autofagi og GEM-induceret PARP-1 nedbrydning gennem aktivering af ERK signalvejen, med KLM1 og KLM1-R-celler viser forskellige følsomheder til MEK-inhibitor U0126.

(A) KLM1 og KLM1-R-celler blev udsat for 10 ug /ml GEM i nærvær eller fravær af 20 uM U0126 for de angivne tidspunkter kurser. Cellelysater blev opløst ved SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer mod p-ERK og LC3A /B. (B) og (C) KLM1 og KLM1-R-celler blev dyrket i mediet med eller uden FBS og i mellemtiden udsat for den ene eller begge GEM og U0126 på den angivne koncentration. Cellelysater blev opløst ved SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer. Pilen hoved angiver mono-ADP ribosyleret form af PARP-1. Pile viser positionen området spaltet caspase-3. Udtrykket af PARP-1 blev bekræftet gentagne gange af en distinkt PARP-1 antistof beskrevet i Materials.

Hypoxi undertrykker autofagi og GEM-induceret PARP-1 nedbrydning

Hypoxi fører til celle cyklus anholdelse via nedsat p21 syntese [29]. Vi bekræftede, at ekspressionen af ​​p21 blev nedreguleret og Hsp27 var opreguleret med 1% O

2 hypoxi i 24 timer i KLM1 og KLM1-R-celler; dog hypoksi ikke havde nogen indflydelse på ekspressionen af ​​phospho-ERK og Bcl2 (fig. 6 A). Under hypoxiske tilstand, blev begge AMPKa1 og Ulk1 ekspression nedreguleres i KLM1 og KLM1-R-celler, og ekspressionen af ​​LC3 i KLM1 var ned til samme niveau som i ubehandlede KLM1-R-celler (fig. 6 A), hvilket viser, at hypoxi inducerede fænotypiske ændringer i KLM1 fører til en KLM1-R-lignende tilstand og inhibering af autofagi. testede vi dermed hvis hypoxi inhiberede GEM-induceret PARP-1 nedbrydning. Western blot-analyse viste, at GEM-induceret PARP-1 nedbrydning bemærkelsesværdigt blev afskaffet af hypoxi i en caspase-uafhængig måde i både KLM1 og KLM1-R-celler (Fig. 6 B). Disse resultater indikerede, at hypoxi undertrykker GEM-induceret PARP-1 nedbrydning ved at reducere autophagic aktivitet. Salg

(A) KLM1 og KLM1-R-celler blev dyrket under normale forhold eller 1% O

2 hypoxi i 24 timer og derefter cellelysater blev opløst ved SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer. (B) De angivne celler blev dyrket under normale forhold eller 1% O

2 hypoxi sammen med 10 ug /ml GEM i 24 timer. Cellelysater blev opløst ved SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer. En pil hoved angiver mono-ADP ribosyleret form af PARP-1. Pile viser positionen området spaltet caspase-3. Udtrykket af PARP-1 blev bekræftet gentagne gange af en distinkt PARP-1 antistof beskrevet i Materials.

Diskussion

Autophagy kan være forhøjet ved GEM i behandlingen af ​​PC celler [13 ]. PC celler viste sig at være mere følsomme over for den cytotoksiske virkning af perle, når dette blev kombineret med cannabinoider via reaktive oxygenarter (ROS) -medieret autophagic celledød [30]. I denne undersøgelse har vi vist, at autophagic aktivitet blev reduceret i GEM-resistent KLM1-R sammenlignet med -følsom KLM1 celler. Derfor reaktivering af autophagy kan være en nyttig strategi for resensitising PC til GEM. Men lidt er kendt om den rolle, autophagy i DNA-skade respons induceret af GEM. Der er vigtigt tegn på, at autofagi er forbundet med behandlingen af ​​dobbelt-strenget pauser (DSBs) og celledød som respons på DNA-skade i gær ved nedbrydning af acetyleret rekombinationsprotein Sae2 (human CTIP) [31]. Hæmning /ablation af histondeacetylaser (HDAC’er) inducerer autofagi og acetylering af en række DNA-skader respons (DDR) proteiner, herunder søvejen2 og Exo1 [31], [32]. Her viser vi, at GEM inducerer en DNA-skade respons (observeret gennem CTIP overekspression ved Western blot) og mono-ADP ribosyleret PARP-1 nedbrydning fører til øget autofagi. Således autophagy involveret i DNA-skader reparation kan være gennem styring af PARP-1 nedbrydning snarere end CTIP (gær Sae2) i human PC. Men uanset om det mono-ADP ribosylering af PARP-1 er nødvendig for autophagy nedbrydning og hvordan denne specifikke nedbrydning gennemføres som reaktion på GEM bør præciseres i yderligere undersøgelse.

Ablation af PARP-1 ikke forstyrrer DSBs reparation, men forsinkelser reaktivering af strandede replikationsgafler [33]. Derfor kan GEM-induceret nedbrydning af PARP-1 bidrager til GEM-gået i stå replikationsgafler. DSB Kalibreringsfaktorerne ATM, Mre11, og RAD50 er nødvendige for celleoverlevelse efter replikationsgaffel motorstop i afhængighed af GEM-induceret DNA-beskadigelse [34]. Genstart af strandede replikationsgafler og reparation af kollapsede replikationsgafler kræver RAD51 aktivitet og RAD51-medieret homolog rekombination (HR) vej, henholdsvis [35]. Desuden har vi vise, at CTIP er overudtrykt i respons på GEM i KLM1 og KLM1-R-celler (fig. 2 A). Taget sammen antyder disse resultater, at DSBs reparation er nødvendig for overlevelse af celler såvel som PC celler efter GEM-induceret DNA-beskadigelse. CTIP viste sig at være opreguleret i både KLM1 og KLM1-R induceret af GEM, men dens stabilitet virker stærkere i KLM1-R, navnlig i en koncentration raseri af 10-100 mikrogram /ml GEM, som udtrykker et højere SIRT6 sammenlignet med KLM1 celler (fig. 2 A). SIRT6 fremmer DNA stabilitet og aktivering og stabilisering af CTIP ved deacetylering [31], [35], hvilket indikerer en mulig mekanisme for den lavere følsomhed KLM1-R til GEM forhold til KLM1 celler. Desuden nyere undersøgelser tyder på, at PARP-inhibitorer er særligt dødelige for celler, der mangler i homolog rekombination (HR) proteiner gennem deregulering af fejlbehæftet non-homolog ende sammenføjning [36]. Ligeledes derfor kombination af en slags HR inhibitor med GEM (som PARP-1 suppressor) kan være en potentiel terapeutisk strategi til PC. Der er imidlertid en væsentlig begrænsning, idet serum sult og hypoxi (efterligne tumor mikromiljøer

in vivo

) inhiberer GEM-induceret PARP-1 nedbrydning ved at reducere autophagic aktivitet (fig. 5 og 6). Således bør den foretrukne kandidat til kombinationsterapi med GEM ikke kun inhiberer bestanddelene i DSBs men også fremme autophagy, for eksempel en histondeacetylaser inhibitor, nemlig valproinsyre [37]. er behov for yderligere undersøgelser for at teste, om denne inhibitor kunne øge PC celledød som respons på GEM.

MEK inhibitor U0126 viser forskellige effekter på niveauet for autophagy og PARP-1 nedbrydning i respons til GEM mellem KLM1 og KLM1 -R celler, hvilket indikerer, at der muligvis begrænsninger findes på den terapeutiske strategi for at målrette EGFR /Ras /ERK vej hos PC. Det formodes, at de observerede forskelle afhænger en af ​​tre muligheder:. 1) forskellene i intracellulær lokalisering af aktiverede ERK mellem KLM1 og KLM1-R-celler (figur 4 B); 2) en ukendt tilbagemelding signalvejen for ERK reaktivering som reaktion på MEK-inhibitor (figur 5 B) [37], [38].; 3) serum-induceret nedregulering af ULK1 i KLM1-R-celler, der fører til autophagy ikke kontrolleret af ERK (fig. S1 B).

I denne undersøgelse vi afslører nye højdepunkter, som GEM fungerer som en suppressor af PARP-1 ved at fremme autophagy nedbrydningsvej og fremsætte de relaterede forslag om de ønskede egenskaber af mulige kandidater til kombinationsbehandling med GEM til PC.

Støtte oplysninger

figur S1.

(A) KLM1 og KLM1-R-celler blev lyseret og løses i SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer. Actin blev anvendt til at normalisere lastning niveauer af protein. (B) KLM1 og KLM1-R-celler blev dyrket i medium med eller uden FBS eller udsættes for 10 ug /ml GEM i 24 timer. Cellelysater blev løst i SDS-PAGE og undersøgt med specifikke antistoffer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0109076.s001

(TIF)

Figur S2.

KLM1 (A) og KLM1-R (B) celler blev udsat for 10 ug /ml GEM i stede eller fraværende af 20 uM U0126 for de angivne tidsforløb. Cellelysater blev opløst i SDS-PAGE og probet med specifikke antistoffer mod at p21 og Bcl2. De relative intensiteter af western blot blev målt og vist i denne figur

doi:. 10,1371 /journal.pone.0109076.s002

(TIF)

Tak

Vi takker Ikeda E. og Cui D. at lad os bruge en hypoxi inkubator.