PLoS ONE: Målretning Anticancer Drug Delivery til bugspytkirtelkræftceller Brug en Fucose-Bound Nanopartikel Approach

Abstrakt

På grund af sin aggressivitet og manglen på effektive behandlingsformer, pancreas duktalt adenocarcinom har en dystre prognose. Nye strategier til forbedring af behandling og overlevelse er derfor et akut behov. Talrige fucosylerede antigener i sera tjener som tumormarkører for kræft påvisning og evaluering af behandlingseffekt. Forøget ekspression af fucosyltransferaser er også blevet rapporteret for kræft i bugspytkirtlen. Disse enzymer fremskynde malign transformation gennem fucosylering af sialylerede forstadier, hvilket antyder en afgørende forudsætning for fucose af pankreatiske cancerceller. Med dette i tankerne, har vi udviklet fucose nanopartikler som køretøjer til levering af anticancer narkotika specifikt til kræftceller. L-fucose-bundne liposomer indeholder Cy5.5 eller Cisplatin blev effektivt leveret i CA19-9 udtrykker bugspytkirtelkræftceller. Overskydende L-fucose faldt effektiviteten af ​​Cy5.5 introduktion af L-fucose-bundne liposomer, hvilket tyder L-fucose-receptor-medieret levering. Intravenøst ​​injiceret L-fucose-bundne liposomer der bærer Cisplatin blev leveret til bugspytkirtelkræftceller, mediere effektiv tumorvækstinhibering samt forlængelse overlevelse i mus xenograftmodeller. Denne modalitet repræsenterer en ny strategi for kræft i bugspytkirtlen celle-targeting terapi

Henvisning:. Yoshida M, Takimoto R, Murase K, Sato Y, Hirakawa M, Tamura F, et al. (2012) Målretning Anticancer Drug Delivery til bugspytkirtelkræftceller Brug en Fucose-Bound nanopartikler Approach. PLoS ONE 7 (7): e39545. doi: 10,1371 /journal.pone.0039545

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA

Modtaget: 15. marts 2012; Accepteret: 22 maj 2012; Udgivet: 11. juli 2012 |

Copyright: © 2012 Yoshida et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist støttet af Ministeriet for Undervisning, Videnskab, sport og kultur, Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B), 21.390.231, 2009, til JK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bugspytkirtelkræft duktalt adenokarcinom er en af ​​de mest aggressive. maligniteter og har en dystre prognose. Det anslås, at kræft i bugspytkirtlen dødelighed rangerer ottende i kræftrelaterede dødsfald på verdensplan. Den samlede 5-års overlevelse på kun 1% til 4% skyldes manglende evne til at detektere denne sygdom på et tidligt stadium, dets aggressivitet, og manglen på effektive konservative terapier [1] – [4]. Selv de patienter, der er i stand til at undergå kirurgisk resektion meste tilbagefald, hvilket resulterer i en generelt ugunstig resultat [3]. Selvom næsten 80% af patienter diagnosticeret ved en meget avanceret inoperabel stadium (IV) behandles med gemcitabin, gemcitabin i kombination med erlotinib, eller FOLFIRINOX, er den mediane overlevelsestid rapporteret at være kun 5,7 måneder, 6,8 måneder, og 11,1 måneder, respektivt [1], [5], [6].

En plausibel forklaring på den ringe respons af avancerede kræft i bugspytkirtlen er, at systemisk kemoterapi resulterer i ekstremt ineffektiv levering af anticancer narkotika til tumoren på grund af sin hypovascularity [7 ]. I et forsøg på at overvinde dårlig levering af anti-cancer medicin, har vi udviklet arteriel infusion kemoterapi med gemcitabin og 5-fluorouracil til inoperabel fremskreden kræft i bugspytkirtlen efter vaskulær forsyning omfordeling via superselektiv embolisering [8]. I et fase I /II studie, en samlet responsrate på 33,3% og en median overlevelsestid på 22,7 måneder (95% CI; 9,5-24,5) blev opnået, et bedre resultat end med intravenøs gemcitabin monoterapi [1]. Men 2 års samlet overlevelse var stadig kun 25% på grund af dårlig styring af metastatiske læsioner [8]. Dette indikerer, at endnu mere effektive terapier er nødvendige. Specifik levering af anticancer lægemidler til kræftceller kan resultere i forbedret effektivitet.

Anti-cancer drug delivery specifikt til kræftceller fortsat en stor udfordring. Flere tilgange, såsom liposomer, polymerer, polymersome og miceller bærer anti-cancer medicin, er blevet anvendt til levering af medicin til kræftceller, med forventning om passiv målretning gennem øget permeation og fastholdelse (EPR) virkninger [9]. Imidlertid er rapporteret, lipidbaserede bærere, der skal hurtigt fra blodbanen af ​​det reticuloendotheliale system (RES) [9]. For at overvinde dette problem, har kemisk modifikation af lægemiddelbærere med visse syntetiske polymerer været hyppigt anvendt i et forsøg på at øge

in vivo

levetid [10]. Den mest populære og succesfulde modifikation coating med polyethylenglycol (PEG) for at opnå “sterisk stabilisering”, hvilket hindrer interaktionen af ​​blodkomponenter med deres overflade og reducerer binding af plasmaproteiner, toksicitet, immunogenicitet, og akkumulering i RES [11 ], [12]. Et sådant eksempel er doxorubicin i PEG-coatede liposomer (Doxil® og Caelyx®), som er meget udbredt i klinisk praksis til behandling af solide tumorer hos patienter med brystcarcinoma [13]. Imidlertid har nylige beviser vist, at PEG, der tidligere blev anset for at være biologisk inert, kunne stadig fremkalde visse uønskede virkninger gennem aktivering af komplementsystemet [14]. Andre metoder, der anvender polymer-baserede eller organiske nanopartikler (Abraxan®) anvendes klinisk, men disse er begrænset af manglen på kontrolleret lægemiddelfrigivelse på specifikke steder på grund af levetiden i blodet, hvilket fører til skadelige virkninger [15].

En anden måde til aktivt målrette kræftceller er gennem brug af nanocarriers konjugeret med molekyler, som binder til antigener eller receptorer på cancerceller [17], [18]; dog forhindringer fortsat med denne strategi, såsom ikke-specifik optagelse af RES og af ikke-målrettede celler [9], [16]. For eksempel, når antistoffer anvendes i deres native tilstand for modifikation af nanocarriers, Fc-domænet af et intakt monoklonalt antistof kan også binde til Fc-receptorer på normale celler, som forekommer med makrofager, hvilket fører til øget immnunogenecity og optagelse af RES [ ,,,0],19], [20]. Selv om effektiviteten af ​​disse modifikation er blevet bevist, har dødelige bivirkninger er ligeledes observeret, sandsynligvis på grund af ikke-specifik binding [21] mellem målretningsdelene agent og ikke-target på celleoverfladen. Således er en specifik kræftcelle-targeting luftfartsselskab, der ikke undergår fældefangst af RES eller ikke-målrettede sites presserende behov.

Derfor har vi fokuseret på de biologiske karakteristika af kræft i bugspytkirtlen, især fucosylerede antigener, såsom sialyl Lewis XI (SLX) antigen og kulhydrat-antigen-19-9 (CA19-9), som findes i sera og tumorvæv fra patienter [22] – [25]. Disse bruges som tumormarkører for kræft påvisning og evaluering af behandlingseffekt. Af flere sådanne fucosylerede antigener, har CA19-9 blevet identificeret som en alment anvendelig tumormarkør for pancreas adenocarcinom grund af dens hyppige elevation i denne sygdom (-80%) [26], [27]. Det har også vist sig, at den postoperative overlevelse er betydeligt værre i pancreas adenocarcinom patienter, hvis CA19-9 niveauer er mere markant forhøjet [28].

fucose en deoxyhexose sukker, spiller en fysiologisk rolle i ændringen af forskellige molekyler i pattedyr. For eksempel, fucosylering spiller en vigtig rolle i blodtype bestemmelse, immunologiske reaktioner, og signaltransduktionsveje [29]. Syntese af fucose forekommer via to primære veje [30]; dvs.

de novo

og bjærgning. I førstnævnte, BNP-fucose syntetiseres fra BNP-mannose af to enzymatiske reaktioner. I sidstnævnte, fri fucose stammer fra ekstracellulære eller lysosomale kilder [31], eller fra kilder i kosten (eller dyrkningsmedium

in vitro

) transporteres over plasmamembranen ind i cytosolen. Selvom de præcise mekanismer er fortsat uklare, er forhøjede niveauer af fucose ofte findes i sera og urin fra patienter med kræft, herunder kræft i bugspytkirtlen, kolorektal cancer, og gastrisk kræft [32] – [34], hvilket tyder på, at fucosylering øges i kræft celler.

Øget udtryk for fucosyltransferaser (FUTs) er også blevet rapporteret i forskellige kræftformer. For syntese af CA19-9, FUTs tilføje L-fucose i α (1,3) og α (1,4) binding til sialylerede forstadier [35] – [37]. FUTs er centrale enzymer accelererende malign transformation gennem fucosylering forskellige sialylerede forstadier [32], [35] – [37]. Det er blevet rapporteret, at en øget aktivitet af FUT3 er forbundet med forøget metastatisk potentiale i pancreas adenocarcinom-celler [38], kan tyder på, at fucosylering spille en vigtig rolle i sygdommens progression. Disse observationer indikerede en høj krav til L-fucose af forskellige cancerceller [22], [24].

Med dette i tankerne, har vi udviklet L-fucose nanopartikler som køretøjer til levering af lægemidler mod cancer specifikt til disse celler

via

receptor-medieret endocytose. Vi modificerede størrelsen af ​​nanopartiklerne at tillade indtrængen gennem de mindste kapillære porer i kræft vaskulatur, men ikke gennem blod-hjerne-barrieren, via EPR virkninger [16]. Endvidere for at forhindre ikke-specifik indfangning af RES, hydrofilisering af liposomoverfladen blev udført i et forsøg på at forlænge systemisk fastholdelse og indkapsling af anticancerlægemidlet, Cisplatin. Heri rapporterer vi, at intravenøst ​​injiceret L-fucose-bundne liposomer indeholdende cisplatin held kan leveres til pancreasceller cancer, som udtrykker fucosylerede antigener. Dette resulterede i en effektiv tumor væksthæmning samt forlænget overlevelse i tumor-bærende mus.

Resultater

Produktion og fysisk-kemiske egenskaber L-fucose-bundne liposomer

amineret L -fucose blev tværbundet via 3,3′-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionat] (DTSSP) til liposomer fremstillet med den modificerede cholat dialyse metode til at opnå en slutkoncentration på 25 ug /ml (F25) eller 50 ug /ml (F50). BS

3 og Tris blev derefter koblet til hydrofilisere liposomoverfladen (figur 1A), hvilket kan forhindre optagelse af RES i leveren og milt og af makrofager og vaskulære endotelceller, og kan også forhindre adsorption til opsonin proteiner i plasma. Følgelig er systemisk retention af liposomerne forlænget [39]. Undersøgelse ved transmissionselektronmikroskopi viste, at næsten alle L-fucose-bundne liposomer (Fuc-liposomer) var sfæriske i form og, i tilfældet med Cy5.5-indkapsling, var ca. 80 – 90 nm i størrelse (figur 1B, C, og tabel S1). Denne partikelstørrelse stemmer godt med målinger foretaget af Zetasizer Nano-S90 (fig 1C). Zeta-potentialet, der repræsenterer den negative elektriske ladning af liposomoverfladen, var under -40 mV (figur 1 D, og ​​tabel S1, S2), som er tilstrækkeligt hydrofiliseret for stealth funktion. Partikelstørrelsesfordeling forblev stabil efter opbevaring ved 4 ° C i 6 måneder.

(A) liposompræparat skema, der viser sukkerkæder. HSA, BS

3, Tris, og DTSSP betegner følgende henholdsvis: humant serumalbumin; bis (sulfosuccinimidyl) suberat; Tris (hydroxymethyl) aminomethan; 3,3-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionat). (B) Elektronmikroskopisk billede af L-fucose-bundet liposom. Scale bar viser 50 nm. (C, D) fysisk-kemiske karakterisering af Fuc-liposom-Cy5.5. Gennemsnitlig partikelstørrelse (C) og zeta-potentiale (D) af liposomer, der blev udarbejdet i vand blev bestemt ved dynamisk lysspredning spektrofotometri.

Overførsel af Fuc-Liposom-Cy5.5 og -FAM ind cancer Cells

i

in vitro

eksperimenter, vi vurderede produktionen af ​​CA19-9 i bugspytkirtelkræftceller og fandt, at BxPC-3, AsPC-1, PK59, og HuCCT1 udskilles store mængder dette molekyle (figur 2A). Endvidere flowcytometrisk analyse viste også, at mængden af ​​membranbundet CA19-9 var høj i celler, som secernerede CA19-9 (fig S1). Membranbundet CA19-9 kunne ikke påvises ved ELISA i cellelinier, der ikke udskiller CA19-9 (fig S1). Baseret på disse resultater, vi delte bugspytkirtelkræft cellelinjer i to grupper i henhold til niveauet af CA19-9; dvs. CA19-9 høj producent- og ikke-producerende celler.

(A) Koncentration af CA19-9 udskilt fra forskellige bugspytkirtelkræft cellelinjer. Fem millioner celler blev inkuberet i serumfrit medium i 48 timer og CA19-9 koncentrationen blev målt ved ELISA. (B) BxPC-3-celler blev inkuberet med Fuc-Liposom-FAM i nærvær eller fravær af overskud af L-fucose i 2 timer, derefter vasket og observeret ved konfokal laser mikroskopi. Scale bar, 10 um. (C) Flowcytometrisk analyse af Fuc-liposom-Cy5.5-behandlede celler. BxPC-3, PK59, AsPC-1 (CA19-9 producerende kræftceller) og PANC-1, PK45H, MIA PaCa-2, KP4 (CA19-9 ikke-producerende bugspytkirtelkræftceller) celler blev behandlet med Fuc-Liposom-Cy5 .5 i 2 timer med eller uden overskydende L-fucose og blev analyseret ved flowcytometri. Cy5.5 positive celler var angivet. NT, ingen behandling: F0, F0-Liposom-Cy5.5: F25, F25-Liposom-Cy5.5: F50, F50-Liposom-Cy5.5: F50 + Fuc, overskydende L-Fucose. (D) HuCCT1 (CA19-9 producerende) celler blev inkuberet med Fuc-Liposom-Cy5.5 for angivne timer i nærvær eller fravær af overskud af L-fucose, derefter vasket to gange med phosphatbufret saltvand og analyseret ved flowcytometri. (E) Effekt af monosaccharider om indførelse af Cy5.5 i bugspytkirtelkræftceller af Fuc-liposomer. Flowcytometrisk analyse af Fuc-liposom-Cy5.5-behandlede celler. Celler blev behandlet med Fuc-Liposom-Cy5.5 eller Lipsome-Cy5.5 i 2 timer med eller uden overskydende monosaccharider og blev analyseret ved flowcytometri.

Vi undersøgte derefter, om CA19-9-producerende cancerceller kan målrettes under anvendelse disse Fuc-liposomer. Baseret på resultaterne af indledende forsøg har vi tilføjet Cy5.5 eller FAM indkapslet L-fucose-liposomer (Fuc-Liposom-Cy5.5, Fuc-Liposom-FAM) at CA19-9 producerer eller ikke-producerende cancerceller for at bekræfte specificiteten levering. Som vist i figur 2B, afslørede fluorescensmikroskopi at F50-Fuc-Liposomer men ikke F0-Fuc-liposomer herved indført FAM i cytosolen af ​​BxPC-3. Desuden viste flowcytometrianalyse, at F50-Fuc-Liposomer men ikke F0-Fuc-liposomer herved indført Cy5.5 i cytosolen af ​​BxPC-3 aspC-1, og PK59-celler, som secernerede rigelige CA19-9 inden for 2 timer (figur 2C og 2D, figur S2). Overskydende L-fucose inhiberede optagelsen af ​​Cy5.5 ind i CA19-9 producerende celler, men ingen bemærkelsesværdig ændring i CA19-9 ikke-producerende celler, hvilket antyder L-fucose specifik introduktion. Endvidere er mængden af ​​Cy5.5 overført til bugspytkirtelkræftceller syntes at stige direkte proportionalt med niveauet af CA19-9 ekspression (figur 2C, og fig S2A). Overskydende L-fucose, men ikke D-glucose, D-mannose, D-xylose eller D-galactose faldt effektiviteten af ​​denne proces (figur 2E), hvilket viser, at indførelsen af ​​Cy5.5 af Fuc-Liposomer er faktisk L-fucose afhængige .

Receptor medieret-optagelse af Fuc-Liposome i cellerne

for at verificere L-fucose afhængig optagelse af Fuc-Liposom, optagelsen af ​​

14C-mærket L-fucose af AsPC -1 blev undersøgt. Inkorporering af

14C-mærket-L-fucose i AsPC-1 blev forøget i en tidsafhængig måde, og blev inhiberet i nærvær af overskydende koldt L-fucose (Figure3A), hvilket antyder tilstedeværelsen af ​​L-fucose-specifikt bindende protein. Inhibering af endocytose af chroloquine førte til suppression af Cy5.5 optagelse i BxPC-3-celler (figur 3B). Vi udførte derefter en

14C-L-fucose receptorbindingsassay hjælp AsPC-1-celler og detekteret en høj affinitet L-fucose-specifikke receptor (3,25 × 10

6 receptorer /celle, Kd = 28.74 nM), hvilket viser at optagelsen af ​​L-fucose medieres af dets receptorer (figur 3C, 3D).

(A) anvendelse af

14C-mærket-L-fucose i AsPC-1 celler. Celler blev inkuberet i nærvær eller fravær af overskud af L-fucose (overskud kold) i

14C-mærket-L-fucose-holdigt medium i den angivne tid, derefter

14C-mærket-L-fucose inkorporering var målt. (B) BxPC-3-celler blev inkuberet med eller uden chroloquine i 24 timer, behandlet med F50-Liposom-Cy5.5 i 2 timer ved 37 ° C, og derefter analyseret ved flowcytometri. (C, D)

14C-mærket-L-fucose bindingsassay under anvendelse AsPC-1-celler. Scatchard plot-analyse afslørede 3,25 × 10

6 receptorer /celle, en K

D af 28.74 nM og en Bmax på 5,49 pmol /10

6 celler. Metoder er beskrevet i

Materialer og metoder

.

Effekt af Fuc-Liposome-Cisplatin på væksten af ​​kræft i bugspytkirtlen cellelinier

Vi derefter indkapslet cisplatin i Fuc -Liposomes. Fuc-Liposom-Cisplatin partikler var ca. 200 nm i størrelse, og den endelige koncentration af cisplatin blev anslået til 2 mg /ml (figur S3 og Tabel S3). Denne størrelse nanopartikel bør give indtrængen gennem de mindste kapillar porer i kræft kar ved EPR virkninger, men bør ikke bryde blod-hjerne-barrieren [16]. Cytotoksicitet af Fuc-liposom-Cisplatin blev testet under anvendelse af WST-1 assay (figur 4). Bugspytkirtelkræftceller blev udsat for Fuc-Liposom-Cisplatin eller Liposom-Cisplatin i 2 timer og derefter vasket to gange med phosphatbufret saltvand for at teste effektiviteten og specificiteten af ​​cisplatin overførsel til CA19-9-producerende celler. Fordi vi observeret den største cytotoksicitet under anvendelse F50-Liposom-Cisplatin (50 pg /ml Fuc-liposomer) (figur 4A), valgte vi denne betingelse for de følgende eksperimenter. I CA19-9-producerende celler (BxPC-3, aspC-1, PK59), F50-Liposom-Cisplatin udøvede mere potente virkninger end kontrol- liposomer (F0-Liposom-cisplatin), hvilket indikerer fucose-afhængig cytotoksicitet (figur 4B). Ud over virkningerne på pancreas adenocarcinom cellelinier, væksten af ​​andre cancere, såsom gastriske og CRC-cellelinien Colo205, som producerer CA19-9 blev også effektivt undertrykt af F50-Liposom-Cisplatin, angiver den potentielle anvendelighed af denne nanopartikel teknologi til behandling af forskellige typer cancer (data ikke vist). Ingen cytotoksiske virkninger af dette middel blev observeret hos ikke-CA19-9 producerende celler (MIA PaCa-2, PANC-1, PK45H). Desuden blev der ikke cytotoksicitet i normale celler, såsom perifere mononukleære blodceller, fibroblaster, humane navlevene-endotelceller (HUVEC), eller primære keratinocytter set sandsynligvis på grund af deres lave krav til L-fucose (fig S4). Fordi blodtypeantigener bestemmes af mønstret af glycoproteiner, herunder molekyler med vedhæftede L-fucose grupper molekyler udtrykt på erythrocyt membran, var vi bekymret for, at erythroblast forstadier også kan inhiberes. Derfor undersøgte vi CFU-E /BFU-E-kolonidannelse af CD34 + -celler i nærvær eller fravær af F50-liposom-Cisplatin. Imidlertid blev kolonidannelse ikke inhiberes, uanset hvilken blodgruppe af CD34 + -celler afprøvet (figur S5).

(A, B) Celler blev behandlet med Fuc-Liposom indeholdende cisplatin i 2 timer, derefter vasket og inkuberet i 72 timer. Levedygtige celler blev målt ved WST assay.

Administration af D-mannose forøger Fordeling af Fuc-liposomer i CA19-9 producerende tumorer i en xenograftmodel

Vi næste undersøgt tumor- specifik levering af Fuc-liposomer i tumor-bærende mus

in vivo

. Det er blevet vist, at clearance af L-fucose er forsinket i D-mannose receptor-deficiente mus [40], i overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​mannose /fucose receptorer i leveren og Kupffer-celler [41] – [44]. Endvidere mannose-bundne liposomer akkumuleret i ikke-parenchymale celler og Kupffer-celler, når de administreres via halevenen [45]. Baggrund af disse rapporter, vi samtidigt administreret D-mannose med Fuc-liposomer i tumorbærende mus til at inhibere optagelse af L-fucose via D-mannose receptor. Først testede vi virkningen af ​​D-mannose på effektiviteten af ​​Fuc-medieret optagelse ved anvendelse af flowcytometri. Som vist i figur 2, bekræftede vi, at Fuc-liposomer effektivt blev indført i BxPC-3-celler

in vitro

selv i nærvær af overskydende D-mannose. Derefter vi administrerede Fuc-liposomer

in vivo

og observeret en ophobning af Cy5.5 i tumoren, men reduktionen i leveren, når D-mannose blev administreret før Fuc-Liposom injektion (figur 5A og 5B, fig S6 ). Endvidere akkumulering af Cy5.5 blev kun observeret i CA19-9 producerende tumorceller, BxPC-3 og AsPC-1, men ikke i CA19-9 ikke-producerende tumorceller, (dvs. MIA PaCa-2). Akkumulering af Cy5.5 i tumoren blev opretholdt op til 1 uge efter Fuc-Liposom administration (data ikke vist) og ingen påviselige bivirkninger blev observeret.

(A) Fuc-liposom- eller Liposom-Cy5. 5 blev administreret via halevenen (50 gl /mus). Tumor regioner af MIA PaCa-2, BxPC-3 og AsPC-1-celler (bagsiden af ​​en bilateral flanke læsion) i mus blev observeret og Cy5.5 akkumulering blev kvantificeret under anvendelse IVIS imaging system ved 96 timer efter injektion. D-mannose (1000-fold af L-fucose) blev injiceret samtidigt med liposom injektion. (B) Samlet flux af tumoren og leveren blev beregnet ved anvendelse af Living Billede software i henhold til producentens anvisninger.

Fuc-Liposomer Carrying Cisplatin Undertrykt tumorvækst og forlænget overlevelse af mus i xenotransplantatmodellen

for at teste effekten af ​​Fuc-Liposome-Cisplatin på tumorvækst

in vivo

, udviklede vi en pancreas adenocarcinom xenograft model i mus. Disse dyr blev behandlet med Fuc-Liposom-Cisplatin to gange om ugen. Tumorvækst blev væsentligt inhiberet ved behandling med F50-Liposom-cisplatin sammenlignet med ingen behandling, F0-Liposom-Ciplatin eller cisplatin alene, hvilket antyder, at F50-Fuc-Liposome kunne levere cisplatin specifikt og effektivt (figur 6A og 6B). I HE farvning af tumorvæv blev mange levedygtige celler observeret i ubehandlede mus. Antallet af tumorceller faldt i cisplatin-behandlede og F0-liposom-Cisplatin behandlede-mus sammenlignet med ubehandlede mus. I mus behandlet med F50-Liposom-Cisplatin, tumorceller næsten helt forsvundet. TUNEL-farvning afslørede tilstedeværelsen af ​​et større antal apoptotiske celler i tumorer behandlet med F50-Liposom-Cisplatin end i kontroller (figur 6C), muligvis på grund af mere markant akkumulering af cisplatin i tumorvæv (figur 6D). Vi har også testet effekten af ​​Fuc-Liposome-Cisplatin på overlevelse i en ortotopisk og levermetastaser model

in vivo

hjælp BxPC-3-Luc celler. Som vist i figur 6E, overlevelsen af ​​mus behandlet med Fuc-Liposom-Cisplatin var signifikant forlænget i forhold til ubehandlede mus, eller i forhold til mus behandlet med cisplatin alene eller F0-Liposom-Ciplatin. I orthotopisk model, tumorstørrelsen i mus behandlet med cisplatin alene eller F0-Liposom-Cisplatin var næsten den samme størrelse, men tumorerne i begge grupper var mindre i forhold til ubehandlet. Omvendt blev tumoren i mus behandlet med Fuc-Liposome-Cisplatin ikke opdaget af

in vivo

imaging (figur 6F).

(A, B) Sammenligning af tumorvækst undertrykkelse med cisplatin, F0-Liposom-Cisplatin, og F50-Liposom-Cisplatin i AsPC-1-bærende mus. Cisplatin (2 mg /kg), F0-Liposom-cisplatin (2 mg /kg), eller F50-Liposom-cisplatin-opløsning (2 mg /cisplatin /kg) blev injiceret via halevenen i aspC-1-bærende mus to gange uge. Ved 4, 8, 11, 15, 18 og 22 dage efter transplantation, tumorvolumener blev målt. Repræsentativt billede af mus behandlet med cisplatin (B). Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD (n = 6). * P 0,01 sammenlignet med NT, cisplatin, og F0. (C) Tumorvæv blev fremstillet på dag 22 efter behandlingen. HE farvning (øvre panel) og TUNEL-farvning (nederste panel) er præsenteret. (D) Koncentration af platin i tumorvævet målt ved ICP. (E) overlevelsesraten for mus behandlet med cisplatin alene, F0-Liposom-Ciplatin, og F50-liposom-Ciplatin i levermetastaser model ved hjælp BxPC-3-celler. Statistisk analyse blev udført ved generaliseret Wilcoxon test. * P 0,01 sammenlignet med NT, cisplatin, og F0. (F) Lokalisering af BxPC3-Luc celler i ortotopisk model opdages ved hjælp af et IVIS billedbehandlingssystem efter 3 ugers behandling.

Ingen bivirkninger, herunder kroppens vægt ændringer, der kan henføres til administrationen af ​​enten D -mannose eller F50-Liposome-Cisplatin blev observeret i denne undersøgelse (tabel S4).

diskussion

Vi har genereret og karakteriseret L-fucose-bundne liposomer indeholder cisplatin, og har vist, at Fuc -Liposome-Cisplatin er langt mere effektiv end cisplatin alene til at hæmme proliferation af CA19-9-producerende kræftceller

in vitro

og tumorvækst

in vivo

. Farmakokinetiske forsøg sammen med kvantificering af cisplatin i målrettet versus ikke-målrettet fremføringsmidler, både i

vitro

in vivo

yderligere bekræftet, at hæmning af tumorvækst skyldtes målrettet levering. Således er vores strategi at udnytte biologiske karakteristika af CA19-9 producerer bugspytkirtelkræftceller er lovende med hensyn til specifik kræftcelle målretning.

Vi ændrede liposomoverfladen ved at koble Tris via BS

3, og cross-linking aminerede L-fucose via DTSSP at opnå tilstrækkelig stealth og målretning funktion (figur 1A). Partikelstørrelsesfordeling forblev stabil efter opbevaring ved 4 ° C i 6 måneder. Vores liposomer er i stand til at bære forskellige former for lægemidler, der almindeligvis anvendes til behandling af cancer, såsom doxorubicin, oxaliplatin, og CPT-11 (data ikke vist).

Mens det er blevet rapporteret, at den postoperative overlevelsesraten er betydeligt værre i adenocarcinom patienter, hvis CA19-9 niveauer er markant forhøjet [28], vores resultater viste, at disse patienter med pancreascancer udtrykker CA19-9 ville være passende kandidater til behandling med fuc-liposomer transporterer lægemidler mod cancer.

Fucose anvendes fysiologisk for fucosylering af glycoproteiner i mange celletyper, især i leveren via mannose /fucose receptorerne, som rigeligt udtrykt deri [41] – [43]. I indledende forsøg observerede vi høj ophobning af Cy5.5 sandsynligvis gennem ikke-parenkymceller og Kupffer celler. Ikke desto mindre lykkedes det at fastholde liposom ophobning ved at administrere mannose via halevenen, hvilket resulterede i tumor målretning og prækliniske bekræftelse af sikkerheden for potentiel klinisk anvendelse [45].

I

Escherichia coli

, den cellulære optagelse af L-fucose medieres af væsentlig facilitator familie proton symporter, fucP [46]. For nylig blev strukturen af ​​L-fucose transportør identificeret i

E. coli

[47]. Men hos mennesker, mekanismen for L-fucose cellulær optagelse er stadig kontroversiel, med både diffusion og det aktive transportsystem foreslået som større veje for optagelse af L-fucose i cellen [31]. Vores fuc-liposomer trænger ind i CA19-9-producerende celler i 10 minutter og inhiberes af overskydende L-fucose, hvilket indikerer eksistensen af ​​en transportør eller internalisering systemet medieret af specifikke receptorer på cellerne, i stedet for blot en ikke-specifik diffusion system. Faktisk receptor-bindingsassays afslørede L-fucose-specifikke højaffinitetsreceptorer på AsPC-1-celler (figur 3). Imidlertid er yderligere undersøgelser nødvendige for at løse dette problem.

Negative virkninger på hæmatopoiese, især på produktionen af ​​røde blodlegemer, var et stort problem med brugen af ​​fuc-liposomer transporterer lægemidler mod cancer, men der var ingen ændring i enten kolonidannelse

in vitro

eller knoglemarvssuppression

in vivo

under behandlingen. Selvom disse bivirkninger også skal screenes for ved brug af fuc-liposomer bærer andre end cisplatin anti-cancer medicin, såsom doxorubicin, vi har mistanke om, at i betragtning af det begrænsede krav om normale celler til L-fucose eller dens begrænsede levering via normal blodkar, ville EPR effekt og toksicitet for tilskuer celler være minimal.

denne rapport er den første til at beskrive, at målrettet levering af et cytotoksisk lægemiddel som en L-fucose nanoconjugate effektivt kan hæmme

in vivo

vækst bugspytkirtelkræftceller. Endvidere kan L-fucose nanopartikler, som vi har udviklet udnyttes som leveringsvehikler for andre anticancerlægemidler. Denne strategi kunne udvides som en generel metode til behandling af en lang række andre CA19-9-producerende carcinomer, såsom colorektal (~ 80% CA19-9 positiv), galdevejene (70~80% positive), og gastrisk carcinom (20~50% positive) [48], i tillæg til pancreas adenocarcinom (-80% positive) [26], [27]. Afslutningsvis bør Fuc-liposom indeholder anticancermedicin give en ny strategi for aktiv målrettet kræftbehandling.

Materialer og metoder

Materialer

Cis-diamminplatin (II) dichlorid ( cisplatin), kaliumtetrachlorplatinat (II), kaliumiodid, ammoniak vandig opløsning (28%), sølvnitrat, dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), cholesterol (Chol), dicetylphosphat (DCP), natrium cholatehydrate (cholsyre), humant serumalbumin ( HSA), natriumperiodat, deuteriumoxid (D

2O), natrium hexachloroplatinate, tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris), og L-fucose blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Gangliosid blev købt hos Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE) blev købt fra Alexis (Plymouth Meeting, PA, USA). N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-amino-propansulfonsyre (TAPS) og N- (2-hydroxyethyl) piperazin-N ‘- (2-ethansulfonsyre) syre blev indkøbt fra Dojin Chemical (Kumamoto, Japan). Natriumcyanoborhydrat blev købt fra Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS

3) og 3,3-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP) blev erhvervet fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA). Kolesterol E-test Wako blev købt fra Wako (Osaka, Japan). Kalium dichloroplatinum blev købt fra Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). Chroloquine blev købt fra Sigma.

Udarbejdelse af Cy5.5, FAM og cisplatin indkapslet i liposomer

Se tekst S1 afsnit.

cellelinier

kræft i bugspytkirtlen cellelinjer KP4, PK-59, PK-45h, MIA Paca-2, Panc-1, og HuCCT1 blev opnået fra Riken BRC Cell Bank. AsPC-1 og BxPC-3 blev indkøbt fra American Type Culture Collection. BxPC-3, AsPC-1, PANC-1, PK-45H, PK-59, og HuCCT1 celler blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco) suppleret med 10% FBS, L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. KP4 og MIA PaCa-2 blev dyrket i DMEM (Gibco) suppleret med 10% FBS, L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin.