PLoS ONE: Funktionel karakterisering af CLPTM1L som lungekræft Risk Kandidat Gene i 5p15.33 Locus

Abstrakt

læbe-ganespalte transmembrane protein 1-Like (CLPTM1L), bor i en region af kromosom 5 for hvilke kopiantallet gevinst har vist sig at være den hyppigste genetiske begivenhed i de tidlige stadier af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Dette locus er fundet af flere forening bred genom undersøgelser være forbundet med lungekræft i både rygere og ikke-rygere. CLPTM1L er blevet identificeret som et overudtrykt protein i humane ovarie tumorcellelinier, der er resistente over for cisplatin, som er den eneste indsigt hidtil i funktionen af ​​CLPTM1L. Her finder vi CLPTM1L udtryk øges i lunge adenokarcinomer i forhold til matchede normale lungevæv og i lunge tumor cellelinier ved mekanismer ikke eksklusiv at kopiere nummer gevinst. Ved tab af CLPTM1L akkumulering i lunge tumorceller, blev cisplatin og camptothecin induceret apoptose steg i direkte forhold til niveauet af CLPTM1L knockdown. Bd-XL akkumulation blev signifikant nedsat ved tab af CLPTM1L. Ekspression af eksogen Bd-XL afskaffet sensibilisering på apoptotiske drab med CLPTM1L knockdown. Disse resultater viser, at CLPTM1L, et overudtrykt protein i lunge tumorceller, beskytter mod genotoksisk stress induceret apoptose gennem regulering af Bcl-xL. Denne undersøgelse implicerer anti-apoptotisk CLPTM1L funktion som en potentiel mekanisme af følsomhed over for lunge tumorigenese og resistens mod kemoterapi

Henvisning:. James MA, Wen W, Wang Y, Byers LA, Heymach JV, Coombes KR, et al. (2012) Funktionel karakterisering af CLPTM1L som lungekræft Risk Kandidat Gene i 5p15.33 Locus. PLoS ONE 7 (6): e36116. doi: 10,1371 /journal.pone.0036116

Redaktør: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: 13 august, 2011; Accepteret: 30 marts 2012; Udgivet: 4 juni 2012

Copyright: © 2012 James et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af et NCI Cancer center Support Grant # P30 CA91842, det humane protein Atlas-projektet, og NCI U19CA148127 tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CLPTM1L er dette navn baseret på dens homologi med læbe-ganespalte transmembrane protein 1, der blev identificeret som forstyrret i en familie med læbe-ganespalte [1]. CLPTM1L blev identificeret som en opreguleret transkript i et cisplatin i æggestokke tumorcellelinie [2]. Imidlertid fortolkningen af ​​resultaterne af denne undersøgelse er vanskelig, da der ikke er nogen kritik af mekanismen og virkningen af ​​overekspression af CLPTM1L i cisplatin følsomhed blev modstridende i forskellige æggestokkene tumorcellelinjer, afhængigt af deres allerede eksisterende niveau af resistens. Ikke desto mindre blev foreslået en rolle for CLPTM1L i resistens over for cisplatin. Interessant er fundet, homologen CLPTM1 skal udtrykkes i højere niveauer i doxorubicin-resistente brysttumorer, og ekspression af CLPTM1 forudsiger reaktion på doxorubicin [3]. En nylig undersøgelse viste, at en genetisk variant af CLPTM1L genet (rs402710) er forbundet med akkumuleringen af ​​DNA-addukter i tumor tilstødende lungevæv [4]. Denne samme SNP, blandt andre i området ved CLPTM1L og tert-gener er forbundet med risiko for lungekræft [5], [6], [7]. I en nylig undersøgelse af livmoderhalskræft integrere gendosis og udtryk data blev CLPTM1L /TERT locus sig at have kopiantal gevinst i tumorer og ekspressionsmønstre der korrelerede med kopiantal gain [8]. En anden nylig undersøgelse viste, at med kopiantal gain tværs 5p blev CLPTM1L ekspression forøget ca. 5 gange i cervikale cancercellelinier end normale cervikale epitelceller, mens ekspression af de andre gener på 5p15.33 ikke blev ændret [9]. Disse indsigt i funktionen af ​​CLPTM1L, og det faktum, at kopiere nummer gevinst i regionen af ​​kromosom 5p indeholder CLPTM1L er den hyppigste cytogenetiske begivenhed i de tidlige stadier af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [10] er overbevisende begrundelse for studiet af den rolle, CLPTM1L i lungekræft samt andre cancertyper.

DNA skader, som den, der forårsages af genotoksiske kemoterapeutiske midler, inducerer apoptose gennem dobbeltstrengede bryde i forbindelse kinaser, og efterfølgende transkriptionel regulering af apoptotisk effektorer primært gennem p53 [11]. Bcl-2 familiemedlemmer reguleret af p53 herunder Bax er centrale for aktivering af apoptose via denne vej og handle ved permeabilisering mitokondriemembranen [12]. Anti-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem Bd-XL beskytter cancerceller fra p53 induceret apoptose [13] og virker gennem binding og inaktivering af Bax [14] og binding af proteiner, der rekrutterer Bax til mitokondriemembranen [15]. Bd-XL ofte overudtrykkes i lungetumorer, er forbundet med dårlig prognose [16], [17] og spiller en vigtig rolle i resistens over for genotoksiske kemoterapeutiske midler i lungen og andre cancertyper [18], [19], [20] , [21], [22], [23]

Selv om en tilslutning af CLPTM1L til kræft er foreslået af kopi nummer gevinst, genom bred forening og studier i æggestokkene tumorcellelinjer.; funktionen af ​​CLPTM1L og dets rolle i tumorigenese er hidtil ukendt. Her rapporterer vi, at CLPTM1L er et almindeligt overudtrykt anti-apoptotisk faktor i lungetumorer. Knockdown af CLPTM1L transkript i NSCLC-celler resulterer i en stigning i følsomhed over for genotoksisk stress medieret apoptotisk aflivning og mindsker ekspression af Bd-XL på en måde afhængige af dosis af CLPTM1L ekspression. Endvidere ekspression af exogent Bd-XL ophæver sensibilisering til genotoksisk stress induceret apoptose ved CLPTM1L knockdown. Denne beskyttende virkning er ikke eksklusivt til cisplatin medieret drab. Snarere CLPTM1L virker indirekte som en generel inhibitor af mitokondriel pathway af apoptose gennem Bd-XL regulering. Disse resultater viser en rolle for CLPTM1L i kemoterapeutisk modstand i lunge tumorceller, og foreslå en rolle for CLPTM1L i lunge tumorigenese via beskyttelse mod apoptose gennem øget akkumulering af Bel-XL.

Resultater

Expression af CLPTM1L i lungetumorer

i betragtning rapporter om kopi nummer gevinst i lungekræft, GWAS beviser, og forøget ekspression af CLPTM1L i cisplatin resistente æggestokkene tumorceller, vi søgte at afgøre, om CLPTM1L blev overudtrykt i lungetumorer. Ekspression af CLPTM1L mRNA i NSCLC-patient- tumorer blev sammenlignet med den af ​​matchede tumor-tilgrænsende væv ved qPCR. CLPTM1L blev øget med gennemsnitligt 2,24 gange nåede en samlet betydning for differentiel ekspression i 30 Trin I NSCLC patienter (p = 0,0028, Two-tailed t-test) (figur 1A). Selvom TERT udtryk var i gennemsnit 1,76 gange højere i tumorvæv, gjorde overordnede forskelle i TERT udtryk ikke nå betydning og blev ikke signifikant korreleret med CLPTM1L udtryk (r

2 = 0,0018, p = 0,994) (Figur S1A). Prøven bestod af 22 adenocarcinom og 8 pladecellekræft patienter Tabel S1 beskriver de kendte karakteristika af undersøgelsespopulationen. Der var ingen forskel i tumor overekspression mellem planocellulært karcinom og adenokarcinomer (data ikke vist). Analyse af udtryk microarray data fra 148 lunge tumor cellelinjer og 59 “normale” cellelinjer udødeliggjort med TERT og Cdk4 bekræftet disse resultater, afslører en 2.02 fold gennemsnitlige forskel i CLPTM1L udtryk i forhold til immortaliserede cellelinjer (p = 1.48E-9, Two -tailed t-test) (figur 1B). Disse data viser også, at ekspression af CLPTM1L er forøget i tumorceller af andre end kopiantal variation mekanismer, som analyse med undtagelse af de tumorcellelinier med kopital variation forblev signifikant (p = 1.28E-8, to-halet t-test) og lignende i størrelsesorden (1,83 gange) (fig 1C). Kopiér nummer ændring var identisk mellem CLPTM1L og tert gener. Der blev imidlertid ingen korrelation mellem CLPTM1L ekspression og TERT-ekspression observeret inden tumorcellelinier (r

2 = 0,0126, p = 0,175) (figur S1B). Analyse af ekspression blev også udført for forskellige lunge tumor undertyper. Adenocarcinom cellelinjer viste en gennemsnitlig 2,15 gange større CLPTM1L udtryk i normale immortaliserede cellelinier (p = 3.59E-7, Two-tailed t-test) og småcellet lungekræft-cellelinjer viste en gennemsnitlig 2,07 gange større udtryk (p = 1,15 E-9, to-halet t-test) (figur 1D). Derfor forekommer forøget CLPTM1L ekspression at være en funktion af lungetumorer uanset subtype.

A) CLPTM1L transkript akkumulering målt ved qPCR i lunge adenocarcinom væv i forhold til gennemsnittet af matchede normale tumor tilstødende væv i 30 patienter demonstrerer en 2.23 fold gennemsnitlig stigning i udtryk i tumorvæv. B) CLPTM1L transkript akkumulering målt ved mikroarray i lunge tumorcellelinier forhold til middelværdien af ​​ikke-transformerede immortaliserede cellelinjer der påviser en 2.02 fold gennemsnitlig stigning i ekspression i tumorcellelinier. C) Cellelinie ekspression data udelukker de tumorcellelinjer med kopiantal variation demonstrerer en 1,83 ganges forøgelse af tumorcellelinier. D) Cellelinie opdelt i adenocarcinom-cellelinjer og småcellet lungecancer-cellelinjer. Sorte søjler repræsenterer gennemsnitsværdier. p-værdier blev opnået under anvendelse af en to-halet t-test.

CLPTM1L giver resistens mod Genotoksisk Stress apoptose i lungetumorceller

Siden forøget ekspression af CLPTM1L er forbundet med lungetumorer, vi havde til formål at modulere CLPTM1L niveauer i lunge adenocarcinom cellelinjer og bestemme reaktionen på genotoksiske stoffer. Knockdown af CLPTM1L i A549 og H838 lungeadenocarcinom cellelinjer blev udført under anvendelse af tre uafhængige virale shRNA vektorer og resulterede i en række virkningsgrader på op til 90% som målt ved kvantitativ realtids-PCR og ved immunoblot (figur 2A og B). Virkningen af ​​CLPTM1L knockdown på aflivning af cisplatin blev bestemt i disse cellelinier. Celler blev talt, udpladet Samme antal ca. 50% konfluens, og analyseret for levedygtighed ved celletælling efter 48 timers cisplatin behandling. Aflivning af lunge tumorceller af cisplatin blev forøget ved tab af CLPTM1L på en dosisafhængig måde, der spænder fra 53% levedygtighed i A549-celler med vektor alene til 12% levedygtighed i celler med shCLPTM1L-3 (figur 2C). Ligeledes vi induceret apoptose i A549 celler med stabil knockdown af CLPTM1L hjælp camptothecin blev en topoisomerase I-inhibitor A549 celler forgyldt i lige stort antal, og analyseret for levedygtighed ved MTS assay efter 48 timers behandling med camptothecin. Igen, tab af CLPTM1L gennem shRNA Knockdown sensibiliserede lunge tumorceller til dosisafhængig apoptotisk drab i overensstemmelse med niveauet af CLPTM1L udtryk (figur S2), viser, at de anti-apoptotiske virkninger af CLPTM1L er ikke eksklusivt til cisplatin. Lignende resultater blev observeret i H838-celler, hvilket viste øget følsomhed over for camptothecin induceret drab ved knockdown af CLPTM1L ekspression (figur 2D). I overensstemmelse med disse resultater, exogen overekspression af CLPTM1L i H1299-celler, som blev bestemt til at udtrykke relativt lave niveauer af endogen CLPTM1L transkript sammenlignet med A549-celler efter microarray analyse (data ikke vist), resulterede en stigning i cellelevedygtighed fra 27% med vektor alene til 36% med CLPTM1L overekspression (p 0,04) efter behandling med camptothecin forhold til dSmo opløsningsmiddel kontroller (figur 2E)

A) Knockdown af CLPTM1L udtryk i A549 celler via stabil shRNA.. Bekræftelse af knockdown ved Western blot (inset). B) Knockdown af CLPTM1L ekspression i H838 celler via stabil shRNA. Bekræftelse af knockdown ved Western blot (inset). C) Relativ celle levedygtighed A549 celler med CLPTM1L knockdown efter 48 timers behandling med medier eller cisplatin. D) Relativ celle levedygtighed H838 celler med CLPTM1L knockdown efter 48 timers behandling med DMSO køretøj eller en uM camptothecin. E) Relativ celle levedygtighed H1299 celler med CLPTM1L overekspression efter 48 timers behandling med DMSO køretøj eller 10 uM camptothecin. Fejl- søjler repræsenterer en standardafvigelse fra middelværdien af ​​biologiske triplikater.

Annexin V immunofluorescens påvist ved flowcytometri blev anvendt som en markør for tidlig apoptose i A549-celler med eller uden CLPTM1L knockdown og cisplatin-behandling. Vi observerede en dosisafhængig forøgelse af apoptose med tab af CLPTM1L (figur 3A). Mens kun 16% af celler med vektoren alene var apoptotiske efter 10 pM cisplatin behandling i 24 timer, 76% af celler med shCLPTM1L-3 apoptotiske. Resistens over for cisplatin-induceret apoptose blev fundet at være proportional med mængden af ​​CLPTM1L transkript akkumulering i disse celler, med en r

2 af 0,9808 (p = 2 × 10

-8) mellem procent knockdown og procent apoptotiske celler ( Figur S3A). Cisplatin koncentrationer ved de nedre grænser for følsomhed blev brugt til at tillade opløsning af følsomheder er knyttet til forskellige niveauer af CLPTM1L knockdown. De DNA-beskadigende midler cisplatin og nitrosamin 4- (methyl-nitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK) begge forårsaget akkumulering af DNA-strengbrud uafhængigt af CLPTM1L ekspression som detekteret af COMET fremgangsmåden (figur S4) . Derfor er den observerede stigning i følsomhed tositivity for cisplatin ved tab af CLPTM1L skyldes en virkning på apoptose eller apoptotiske signaler snarere end en effekt på niveauet af akut DNA beskadigelse. Følsomhed over for cisplatin-induceret apoptose blev også forøget med tab af CLPTM1L ekspression ved shRNA i H838-tumorceller (figur 3B), målt ved kolorimetrisk Caspase 3/7 aktivitetsassay. Igen resistens over for cisplatin-induceret apoptose var proportional med mængden af ​​CLPTM1L transkript ophobning i cellerne, med en r

2 af 0,8847 (p = 1,3 × 10

-4) mellem procent knockdown og relative caspase 3-aktivitet (figur S3B). Udseendet af celler i kultur er konsistent med forøget følsomhed over for cisplatin-induceret apoptose ved tab af CLPTM1L (figur 3C).

A) Annexin V binding ved flowcytometri af A549-celler med CLPTM1L knockdown efter 48 timers behandling med cisplatin . B) Relativ caspase 3/7 aktivitet i H838 celler med CLPTM1L knockdown efter 48 timers behandling med cisplatin. Fejl- søjler repræsenterer en standardafvigelse fra middelværdien. ** – P 0,01 * – p 0,02 af to-halet t-test. C) mikrografier af A549 celler med CLPTM1L knockdown efter 24 timers behandling med 50 pM cisplatin viser øget genotoksisk celledød ved tab af CLPTM1L.

Regulering af Bd-XL Expression er afgørende for CLPTM1L Virkninger på Apoptose

for at undersøge mekanismen for CLPTM1L beskyttelse mod apoptose, vi målte protein niveauer af apoptotiske regulatorer i ubehandlede A549 celler sammenlignet med dem behandlet med cisplatin. For vurdering af kravet om CLPTM1L for regulering af apoptose, blev de mest effektive Knockdown konstruktioner i A549-celler (SH2 og SH3) evalueret. Behandling af A549-celler med 20 pM cisplatin-induceret akkumulering af p53 og pro-apoptotiske p53 target, Bax og nedsat akkumulering af anti-apoptotiske protein Bcl-2, i overensstemmelse med den DNA beskadigelse induceret intrinsic apoptosecyklus (figur 4A). Angivelse af disse apoptotiske regulatorer var upåvirket af knockdown af CLPTM1L alene. Men det anti-apoptotiske protein Bcl-XL, mens upåvirket af cisplatin behandling i A549-celler, blev formindsket, da CLPTM1L niveauer blev squelched af shRNA ekspression. Knockdown af CLPTM1L med shRNAs reducerede Bd-XL protein niveauer med 81% og 76% i cisplatin behandlede celler (p 0,003, Two-tailed t-test) som målt ved tre uafhængige vestlige analyser (figur 4B). Vi har derfor udtrykkes stabilt exogen Bd-XL i celler med og uden knockdown af CLPTM1L at vurdere betydningen af ​​Bd-XL i CLPTM1L beskyttelse mod apoptose. Re-ekspression af Bd-XL blev bekræftet ved Western blot (figur 4C). Mens knockdown af CLPTM1L øget apoptose i tom vektor transficerede celler med 71%, exogent Bd-XL elimineret CLPTM1L afhængige apoptose (figur 4D). Modstand mod genotoksisk stress induceret apoptose nøje svarede til Bd-XL-niveauer, og Bd-XL rekonstituering helt ophævet overfølsomhed til genotoksisk stress induceret apoptose ved CLPTM1L.

A) Western blotting for apoptotiske regulatorer i A549 celler med CLPTM1L knockdown efter behandling med cisplatin viste reduceret Bd-xL udtryk ved tab af CLPTM1L. Bd-XL blots for to separate repræsentative klonale populationer af A549-celler med CLPTM1L knockdown (# 1 og # 2) er vist. B) Grafisk repræsentation af Bd-XL-ekspression i celler med CLPTM1L knockdown fra tre separate klonal populationsA549. Fejl- søjler repræsenterer en standardafvigelse fra middelværdien. * – P 0,003 ved t-test C) Western blots bekræfter ekspression af exogent Bd-XL i A549-celler med CLPTM1L knockdown. D) Relative levedygtige celletal i A549 celler med CLPTM1L knockdown og ektopisk Bd-XL udtryk efter behandling med cisplatin demonstrerer afskaffelse af apoptotiske effekt af CLPTM1L tab ved ektopisk Bd-XL udtryk.

Diskussion

Overlevelse af celler, der undergår DNA-skader fra genomisk ustabilitet eller genotoksisk stress fører til akkumulering af genetiske læsioner karakteriserer humane tumorer. Ophævelse af celle-cyklus checkpoint og apoptotiske garantier mod replikation af beskadiget DNA er kendetegnende for kræft. Resultatet af beskyttelse mod DNA-skade induceret apoptose omfatter både sårbarhed over for ukontrolleret somatisk mutation og nedsat følsomhed ved strålebehandling og kemoterapi. Den tidligere omtalte undersøgelse fra Zienolddinny et al. foreslår, at CLPTM1L polymorfismer kan påvirke DNA-skader akkumulering [4]. Baseret på vores observationer, er det plausibelt, at beskyttelse mod apoptose ved CLPTM1L bidrager til ophobning af DNA-skader og derved giver modtagelighed for tumorigenese. En alternativ hypotese er, at CLPTM1L spiller en rolle i genkendelse eller reparation af DNA-skade, der påvirker ophobningen af ​​sådanne skader. En anden er, at CLPTM1L direkte indflydelse på mængden af ​​DNA-skader, der er afholdt af genotoksiske stoffer. Vores data (figur S4) antyder, at CLPTM1L udtryk ikke direkte påvirker niveauet af akut DNA-skader afholdt af cisplatin eller NNK. Desuden den aktuelle undersøgelse viser, at CLPTM1L har en apoptotisk rolle nedstrøms DNA-skader og gennem regulering af Bd-XL udtryk, der kan forventes at påvirke ophobning af DNA-skader. Observation af differentieret ophobning af Bd-XL ved modulation af CLPTM1L udtryk, sammen med rekonstituere en apoptose resistente fænotype med udtryk for eksogen Bd-XL, bevise, at CLPTM1L virker opstrøms for Bd-XL til resistens over for genotoksisk stress induceret apoptose. I exogene Bd-XL ekspressionseksperimenter, fremgår det, at mindre Bd-XL udtrykkes i vektor indeholdende celler end blev observeret i tidligere forsøg, selvom formindsket akkumulering i celler med CLPTM1L knockdown forbliver indlysende. Samtidig apoptotisk drab er lidt mere robust i vektor indeholdende celler observeret i tidligere eksperimenter, men tendensen til øget følsomhed ved tab af CLPTM1L og Bd-XL er tilbage. Vigtigere er det, denne undersøgelse viser, at den anti-apoptotiske funktion CLPTM1L er ikke eksklusivt til cisplatin følsomhed, men er en generel hæmning af mitokondrie vej af apoptose.

Fælles overekspression af CLPTM1L i tumorer understøtter forestillingen om et onkogen eller tumor fremme rolle for CLPTM1L i lungekræft. Protein udtryk udført studier og kommenteret af Human Protein Atlas-projektet [24] bekræfter vores resultater. Immunhistokemi på humant normalt alveolære celler og lungetumorer demonstrerede negativ ekspression af CLPTM1L i normale væv, medens ekspression i 12 lungetumorer gennemsnit en score på 1,91 på en skala fra 0-3 (fig S5). En score på 0 er negativ, 1 er “svage”, 2 er “moderat” og 3 er “stærk”. Seks af disse patienter blev diagnosticeret med planocellulært karcinom og seks blev diagnosticeret med adenocarcinom. Ingen signifikant forskel i ekspression mellem de to patologier blev observeret. I alt 66 normale væv fra forskellige organer scorede et gennemsnit på 0,98 (svag). Ingen af ​​de testede lungetumorer var negative. Lunge tumorcellelinier A549 (NSCLC) og SCLC-21H (lille celle) viste stærk farvning og moderat farvning, henholdsvis.

Microarray data fra tumor og immortaliserede cellelinier viser, at andre end kopiantal gain resultat mekanismer i forøget ekspression i en undergruppe af tumorer. I genom brede foreninger, de 5 p15.33 locus regnskab for det største bidrag til lungekræft risiko for tre kendte loci hos mennesker [6]. De 5 p locus er også impliceret i kutant planocellulært karcinom og melanom [25], ovariecancer [26], testikelkræft kønsceller kræft [27] og livmoderhalskræft ved kopi nummer gevinst [8]. I livmoderhalskræft undersøgelse, CLPTM1L kom ud af 5 p locus som havende ekspressionsmønstre der korrelerede med kopi nummer gevinst. En anden nylig undersøgelse af kopital og udtryk ændringer i livmoderhalskræft cellelinjer viste, at med kopi nummer gevinst på tværs 5 p, blev CLPTM1L udtryk steget ca. 5 gange i løbet af normale cervikale epitelceller, mens ekspressionen af ​​de andre gener på 5 p15.33 ikke var ændret [9]. TERT-gen er også inden for denne genetiske region. I analysen af ​​SNPs i fem p-regionen, har vi fundet, at lungekræft er forbundet SNP’er ikke er forbundet med telomer længde (data ikke vist), efter aftale med to andre undersøgelser [28], [29]. I modsætning hertil en undersøgelse fra Rafnar et al. viste en forening (

s

= 0,017 og 0,027 henholdsvis) mellem 5 p varianter (rs401681 og rs2736098) og telomer længde, selv om dette kun virkning blev set, når kvinder ældre end 75 år med homozygote genotyper blev medtaget [30 ]. Så vidt vi ved, har ingen fælles kodning mutationer i enten CLPTM1L eller TERT blevet identificeret. Det er sandsynligt, at både TERT og CLPTM1L bidrage til modtagelighed på dette locus, der har en medstifter effekt. En nylig undersøgelse [5] indeholder flere linjer bevis for, at lungekræft sammenslutning af rs31489 i CLPTM1L genet er en uafhængig observation fra sammenslutningen af ​​rs2376100 i TERT genet. Den seneste tætte genotype undersøgelse af 5 p15.33 fundet flere foreninger på 5p15.33, med regionen foreningsfrihed bliver centreret over CLPTM1L [7]. Vores tidligere analyse viser, at rs31489 er varianten stærkest associeret med familiær lungekræft på dette locus. Den nuværende undersøgelse viser, at CLPTM1L også spiller en vigtig funktionel rolle i forhold til cancer, og at dette gen kan være i det mindste delvist ansvarlig for sammenslutningen af ​​varianter i 5p15.33 region med lungecancer. Fortsat indsats for yderligere at definere den genetiske variation kørsel lungekræft modtagelighed i denne genetiske region er et vigtigt næste skridt i at vurdere forholdet mellem CLPTM1L og andre gener i regionen med lunge tumor modtagelighed.

Fælles overekspression af CLPTM1L i lunge tumorer og en funktionel rolle i genotoksisk stress induceret apoptose identificere CLPTM1L som en vigtig faktor, der påvirker overlevelsen af ​​DNA beskadigede tumorceller og potentielt lungecancer modtagelighed. Målretning CLPTM1L samt Bd-XL kan vise sig at være nyttige tilgange til chemoprevention og lungekræft terapi. Målretning disse anti-apoptotiske proteiner kan også have potentiale for sensibilisering af tumorer til traditionelle kemoterapier og radiotherapies.

Materialer og metoder

RT-Quantitative Real-Time PCR

Patient matchede tumor og tumor-tilstødende normale RNA-prøver blev opnået fra Core vævsudtagningen ved Washington University i St. Louis under protokol godkendt af Institutional Review Board på Washington University i St. Louis School of Medicine, human Research Protection Office. Skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter, der deltager i dette væv bank. RNA blev isoleret fra cellelinjer under anvendelse Tri-zol reagens og protokoller (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitativ real-time PCR (qPCR) blev udført under anvendelse af fremgangsmåden som beskrevet tidligere (Chaparro, Wen et al. 2005). Kort fortalt blev et mikrogram af total RNA per prøve omdannes til cDNA under anvendelse af SuperScript First-Strand Synthesis for RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitativ RT-PCR assay blev udført under anvendelse af SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). En mikroliter af cDNA blev sat til en 25 pi totalvolumen reaktionsblanding indeholdende vand, SYBR Green PCR Master Mix, og primere. Hver realtid assay blev udført in duplo på et BioRad MyIQ maskine. Data blev indsamlet og analyseret med Stratagene Mx3000-software.

β-actin

gen (ACTB) blev anvendt som en intern kontrol til at beregne den relative ekspression niveau (ΔC

T) for hver prøve. Primersæt effektivitet og linearitet blev beregnet, og normalisering blev udført i overensstemmelse med MIQE retningslinjer. Fold ændring af genekspression i tumorvæv i sammenligning med de parrede normale væv blev beregnet som 2

d, hvor d = ΔC

T

normal -. ΔC

T tumor

microarray analyse

Expression mikroarrays blev udført ved hjælp af Illumina HumanWG-6 V3 platform, som indeholder 48,800 prober svarende til 20.700 unikke gener. RNA’er (500 ng) blev mærket og hybridiseret til de BeadChip arrays som angivet af fabrikanten (www.illumina.com). Array data blev forbehandlet med MBCB algoritmen (Ding, LH et al, Nucl Acids Research, 2008, 36:. E58). Og differential ekspression blev bestemt ved at beregne fold forandring og T-test

Cell Culture, knockdown og Overekspression

A549-celler (ATCC, Manassas, VA), for nylig bekræftet af Genetica Laboratores, Inc. (Cinncinati, OH), blev dyrket i RPMI-1640 plus 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Celler blev transduceret med lentivirale korte hårnål RNA (shRNA) vektorer baseret på pLKO.1 vektor og beregnet til specifikt at målrette humant CLPTM1L transkript (Sigma, St. Louis). Tom vektor eller vektor vælte CLPTM1L transkript blev først pakket i 293T-celler (Orbigen, San Diego, CA) med hjælper-plasmider og derefter transduceres ind A549-celler med 8 ug /ml polybren (Sigma, St. Louis, MO). Medier blev udskiftet 24 timer efter transduktion, og cellerne blev delt 1:4 48 timer efter transduktion. Ved 72 timer efter transduktion, blev celler indeholdende lentivirale konstruktioner vælges med 1 ug /ml puromycin i 2-4 dage, indtil mock-inficerede celler var døde. Overlevende celler blev samlet

pBABEpuro ekspressionsvektor eller pBABEpuro:. CLPTM1L, klonet ved PCR fra pOTB7-CLPTM1L, (Thermo Scientific), ind i EcoRI /Sall-stederne i pBABE-puro blev transficeret i H1299 celler. Transficerede celler blev selekteret med puromycin indtil mock-transficerede celler var døde.

pSSFV Bd-XL ekspressionsvektor (Addgene plasmid 8749) eller tom vektor blev transficeret ind i celler med og uden knockdown af CLPTM1L som beskrevet ovenfor. Transficerede celler blev selekteret med Geneticin (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Levedygtighed Assay

Celler, der stabilt udtrykker shRNA vektorer som beskrevet ovenfor blev podet på 12-brønds vævskulturskåle ved ens densiteter på ca. 50% i tre eksemplarer. Efter fastgørelse natten over efterfulgt af 48 timers behandling med de angivne koncentrationer af cisplatin (Sigma, St. Louis, MO) opløst i medier, camptothecin (Sigma, St. Louis. MO) opløst i DMSO (Sigma, St. Louis, MO) eller DMSO alene opløsningsmiddel. DMSO koncentrationer i dyrkningsmedier blev holdt konsekvent og var på eller under 0,08%. Celler blev analyseret for levedygtige celleantal ved trypanblåt-farvning og talt på en grevinde automatiseret celle-tæller (Invitrogen, Carlsbad, CA). For camptothecin assays blev cellelevedygtighed målt ved Cell Titer 96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay (MTS) på 24 brønds vævskulturplader i tre eksemplarer. P-værdier blev bestemt ved én-halet t-test.

Flowcytometri

De angivne cellelinier blev behandlet i 24 timer med de angivne koncentrationer af cisplatin på 10 cm vævskulturskåle. 10

6 celler blev vasket og suspenderet i PBS og farvet med Annexin V-FITC. Celler i farveopløsning blev fortyndet med 500 pi PBS og analyseret på et Coulter flowcytometer.

Caspase 3/7 Assay

De angivne cellelinier blev udpladet ved tætheder af 5 × 10

4 celler pr brønd af en 12-brønds vævskulturplade og behandles som anført med genotoksiske midler efter fastgørelse natten over. Caspase 3 og 7 aktivitet blev målt ved hjælp SensoLyte® Homogen Rh110 Caspase – 3/7 Assay Kit (Anaspec, Fremont, CA)

Western Blotting

De angivne cellelinier blev behandlet med cisplatin på. de angivne koncentrationer på 6-brønds plader i 72 timer. Cellerne blev lyseret med 100 pi 1X NP40 lysepuffer indeholdende proteinaseinhibitorer, forskydes 10 gange med en 28 gauge nål, centrifugeret ved 16.000 x g i 30 minutter, normaliseret ved koncentrering protein som bestemt ved Bradford-metoden, og supernatanten koges i 10 min. 20 pi normaliseret lysat blev opløst ved SDS-PAGE og immunoblotting analyseret med viste antistoffer. Følgende antistoffer blev anvendt: kanin anti-CLPTM1L (Sigma, St. Louis, MO), kanin-anti-beta tubulin (Sigma, St. Louis, MO), muse-anti-Bcl2 klon 124 (Dako, Carpinteria, CA), kanin anti-Bax # 2774 (Cell Signaling, Boston, MA), muse-anti-p53 (Ab-1) (Oncogene, San Diego, CA), Bd-xL – kanin Bcl2L1 (Abcam, Cambridge, MA). Kvantificering af vestlige analyser af tre uafhængige kulturer blev udført ved hjælp af billede J software tilgængelig online fra NIH på https://rsbweb.nih.gov. P-værdier bestemmes af ensidet t-test.

COMET Assay

blev gennemført Den gelelektroforese metode til påvisning af DNA-skader blev ændret fra Olive, et al.

Natur protokoller

1, 23-29 (2006). Celler blev behandlet med angivne koncentrationer af NNK, cisplatin eller DMSO opløsningsmiddel 0,1% i 24 timer. Mikroskopobjektglas blev præ-coatet med agarose med lavt smeltepunkt (Sigma, St. Louis, MO) 1% i dH2O og tørret. En ml agarose med lavt smeltepunkt 1% i dH2O holdt ved 40 ° C blev sat til 0,4 ml af en suspension af 2 × 10

4 celler /ml i kolde medier. Den agarose /celler mix (1 ml /slide) blev spredt på de forud overtrukne objektglas.