PLoS ONE: Tyrosin kinase ETK /BMX opreguleres i blærekræft og Forudsiger dårlig prognose hos patienter med Cystectomy

Abstrakt

Deregulering af den ikke-receptortyrosinkinase-ETK /BMX er blevet rapporteret i adskillige faste tumorer. I denne rapport, viste vi, at ETK udtryk gradvist øges under blærekræft progression. Vi fandt, at nedregulering af ETK i blære kræftceller svækkede STAT3 og AKT aktivitet mens eksogen overekspression af ETK havde modsatrettede effekter, tyder på, at deregulering af ETK kan tilskrive den forhøjede aktivitet STAT3 og AKT hyppigt påvist i blærekræft. Overlevelsen, migration og invasion af blære cancerceller var signifikant kompromitteret, da ETK udtryk blev slået ned af en specifik shRNA. Desuden viste vi, at ETK lokaliserer til mitokondrier i blæren kræftceller gennem interaktion med Bd-XL og regulering ROS produktion og narkotika følsomhed. Derfor kan ETK spille en vigtig rolle i regulering overlevelse, migration og invasion ved at modulere multiple signalveje i blæren cancerceller. Immunhistokemi analyse på væv microarrays indeholdende 619 humane vævsprøver blære viser, at ETK signifikant opreguleret under blærekræft udviklingen og progressionen og ETK ekspressionsniveauet forudsiger overlevelsesraten for patienter med cystektomi. Tilsammen tyder vore resultater, at ETK potentielt kan tjene som et nyt mål lægemiddel til blærekræft behandling samt en biomarkør, som kan anvendes til at identificere patienter med højere risiko for død, som kan nydt godt af terapeutiske midler rettet mod ETK aktivitet.

Henvisning: Guo S, Sun F, Guo Z, Li W, Alfano A, Chen H, et al. (2011) Tyrosin kinase ETK /BMX opreguleres i blærekræft og Forudsiger dårlig prognose hos patienter med Cystectomy. PLoS ONE 6 (3): e17778. doi: 10,1371 /journal.pone.0017778

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: Januar 20, 2011; Accepteret: 9. februar 2011; Udgivet: 7 Marts 2011

Copyright: © 2011 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH (CA106504) og DOD (W81XWH-08-1-0174) tilskud til YQ, Kina National Natural Science Foundation (30.872.584) og Guangdong Natural Science Foundation (8251008901000018) til SQ De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er en af ​​de mest almindelige cancertyper i USA. Det anslås, at der vil være 70,530 nye tilfælde og 14,680 dødsfald som følge af blærekræft i 2010 [1], [2], [3]. Flere genetiske og epigenetiske faktorer antages at bidrage til risikoen for at udvikle blærekræft. Ud over velkendte risikofaktorer såsom aldring, køn, udsættelse for cigaretrøg og industrielle kemikalier, flere genetiske læsioner, der giver signaler til celletransformation, formering, migrering og invasion i blærecancer er blevet identificeret [4]. Disse omfatter mutationer eller ændringer i ekspression af p53, pRb, E-cadherin, COX2, BLCA-4, CXCL1, MMP-2/9 og EGFR [5]. Akkumuleret stigning i disse genetiske defekter giver også prognostisk vurdering af udfaldet sygdom. Men yderligere forståelse af blære tumor biologi er nødvendigt at udvikle en mere effektiv behandling. Der er således et behov for identifikation og anvendelse af hidtil ukendte terapeutiske mål i blærekræft.

epitel- og endotelcelle tyrosinkinase (ETK), også kendt som Bone Marrow X kinase (BMX), er et medlem af Tec-familie ikke-receptortyrosinkinase. ETK indeholder en NH2-terminal pleckstrin homologi domæne, en Src homologi 3 domæne, en Src homologi 2 domæne og en COOH-terminalt tyrosinkinasedomæne [6]. ETK kan aktiveres ved flere ekstracellulære stimuli, herunder vækstfaktorer, cytokiner, ekstracellulær matrix og hormoner [7]. ETK protein er til stede i cytoplasmaet med stærk perinuklear farvning i celler, når undersøgt under anvendelse af immunfluorescensmikroskopi [8], [9], [10]. Aktivering af ETK kinaseaktivitet kan opnås ved interaktion af sit pleckstrin homologi domæne enten med phosphatidylinositol 3-kinase produkt phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphat eller FERM domænet af FAK, hvilket fører til plasmamembran translokation af ETK [6], [8]. ETK er blevet vist at spille en rolle i forskellige cellulære processer, herunder celleproliferation, transformation, differentiering, migration og metastase. ETK kan interagere med FAK og p130

Cas at regulere aktincytoskelettet og celle motilitet [8], [11]. Det har også vist sig, at ETK direkte interagerer med tumor undertrykke p53 og inhiberer dets nukleare translokation og dermed fremme kemoresistens i cancerceller [9]. Vi har tidligere vist, at ETK progressivt opreguleres under human udvikling prostatakræft og progression [12], [13]. Men rollen som ETK i blære cancerceller forbliver ukendt.

I denne rapport, viste vi, at ETK udtryk gradvist øges under blærekræft progression. ETK spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​overlevelse, migration og invasion ved at modulere multiple signalveje i blæren cancerceller. Vi viste desuden, at ETK også ligger i mitokondrier gennem direkte vekselvirkning med Bd-XL og regulering ROS produktion til behandling af kemoterapeutiske lægemidler. Desuden ETK udtryk positivt korrelerer tumor kvalitet og forudsiger patient resultat. Vores data tyder på, at ETK potentielt kan tjene som et mål narkotika og prognostisk markør for blærekræft.

Resultater

Funktionel ETK er overudtrykt i blærekræft

Vi undersøgte ETK udtryk i et panel af humane blærecancer cellelinier og fandt, at ETK ekspressionsniveau blev varieret i disse celler. Interessant nok blev påvist en signifikant højere niveau af ETK protein i UM-UC-3 og T24-celler, som er afledt af højkvalitets og invasive blæretumorer (fig. 1a). Vi derefter undersøgt, om ETK er funktionel i disse invasive celler. Vi først afprøvet, om vækstfaktor kunne aktivere ETK kinaseaktivitet under anvendelse phosphorylering af tyrosin 40 (Y40), en autophosphorylering websted ved ETK ved dens aktivering [8], som udlæsning. Som vist i fig. behandling 1B, EGF induceret Y40 phosphorylering, hvilket antyder, at ETK er aktiv i blæren cancerceller. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser viste, at ETK er opstrøms for STAT3 og AKT veje [15], [16], fandt vi phosphorylering niveau af både STAT3 og AKT blev kompromitteret, da ETK udtryk blev slået ned af en specifik shRNA (fig. 1C, Venstre ). Omvendt, når vi overudtrykt ETK i 5637 celler med et relativt lavere niveau af endogen ETK, vi registreret en øget aktivitet af både STAT3 og AKT (Fig. 1C, højre). Disse data sammen viste, at ETK er stærkt udtrykt i invasive blære cancer cellelinjer og involveret i reguleringen af ​​STAT3 og AKT-aktivitet.

A, Expression profil ETK i blære kræft cellelinjer. ETK ekspressionsniveau i totale cellelysater fra blæren cancercellelinier blev undersøgt ved immunoblotting med anti-ETK. Tubulin blev anvendt som en loading kontrol. B, Aktivering af ETK i blære cancerceller behandlet med EGF. UM-UC-3 og T24-celler blev serum sultet i 24 timer, derefter behandlet med 20 ng /ml EGF i 15 eller 30 min. Niveauet af aktiveret EGFR og ETK blev overvåget ved immunoblotting med anti-pEGFR (Y1175) og anti-pETK (Y40) hhv. For det samlede EGFR og ETK i cellelysaterne blev også påvist med anti-EGFR og anti-ETK hhv. C, Regulering af STAT3 og AKT aktivitet ved ETK i blæren kræftceller. UM-UC-3 og T24-celler blev inficeret med lentivirus koder for shRNA specifikt for ETK eller en vektorkontrol. Ved 24 timer efter infektion blev celler serumudsultet natten over og derefter lyseret. Niveauet af aktiv STAT3 og AKT blev undersøgt ved immunoblotting med anti-pSTAT3 (Y705) og anti-Pakt (S473) henholdsvis (Venstre panel). Effekten af ​​ETK overekspression på STAT3 og AKT-aktivitet blev også undersøgt i blærekræft 5637 celler (højre panel).

ETK er til stede i mitokondrier og forbundet med Bd-XL

Når vi undersøgte cellulære lokalisering af ETK i blære cancerceller, observerede vi en puncate fordeling af ETK i cytoplasmaet. Interessant nok blev ETK farvning delvist overlappet med Mitotracker mærkning i disse celler (fig. 2A). Vi har registreret også en signifikant mængde ETK protein i mitochondriefraktionen, sammen med andre kendte mitokondrielle proteiner Bd-XL og VDAC (fig. 2B). Som ETK mangler en mitokondrier målrettet signal, spekulerede vi om det kunne lokalisere til mitokondrier gennem en protein-protein-interaktion. Som vist i fig. 2C, endogene Bcl-XL blev co-udfældet med ETK i begge undersøgte blærekræft cellelinjer. Lignende resultater blev også opnået i 293T celler, der overudtrykker både T7-mærkede ETK og GFP-mærket Bel-XL. Disse data antydede, at ETK kan danne et kompleks med Bcl-XL og lokalisere til mitokondrier. På grund af Bcl-XL anti-apoptotiske funktion, undersøgte vi rolle ETK i regulering af apoptose i disse celler. Som vist i fig. 3A, knock-down af ETK ekspression ved en specifik shRNA steg signifikant antallet af apoptotiske celler i UM-UC-3 og T24-celler. Desuden inhibering af ETK aktivitet forøget ROS produktion og cytotoksicitet i blære cancerceller som respons på behandling af doxorubucin, mens overekspression af ETK havde beskyttende virkninger (Fig 3B . 3C). Tumorvækst og metastase reguleres delvist af evnen af ​​tumorceller til at nedbryde omgivende matrix væv og migrere. For at teste om ETK opregulering kan forårsage en sådan fænotype, vi yderligere undersøgt virkningerne af ETK knock-down på blærecancer cellemigrering og invasion under anvendelse af Boyden kammer assays. Fig. 3D viser, at migrering af ETK-knockdown UM-UC-3 og T24-celler blev reduceret til 40% og 60% sammenlignet med kontrollen shRNA behandlede celler. Lignende resultater blev også observeret, når vi undersøgt deres evne til at invadere gennem matrigel. Disse data antydede, at hæmning af ETK udtryk i blære cancerceller kompromitteret både migration og invasion.

A, ETK lokaliserer til mitokondrier i UM-UC-3 og T24 celler. Celler blev mærket med Rhodamin Mitotracker, efterfulgt af immunfluorescensfarvning med anti-ETK. Kerner blev modfarvet ved anvendelse af DAPI. Lokalisering af ETK blev bestemt ved konfokal mikroskopi. Gul viser colokalisering af ETK og Mitotracker. B, ETK protein påvises i mitochondriefraktionen. Mitokondrielle og cytosoliske fraktioner blev fremstillet som beskrevet i Methods. De fraktionerede ekstrakter blev underkastet immunoblotting med anti-ETK eller viste antistoffer til fraktionering markører. ERK blev anvendt som en cytosolisk markør, mens Bd-XL og VDAC som mitokondrielle markører. C, er ETK forbundet med Bcl-XL. Total celleekstrakter fra UM-UC-3 og T24-celler blev immunfældet med anti-ETK eller IgG kontrol, efterfulgt af immunoblotting med antistoffer som angivet (venstre panel). 293T-celler blev co-transficeret med T7-ETK og GFP-Bd-XL, immunfældning blev udført ved anvendelse af anti-T7 (midterpanelet) eller anti-GFP (højre panel), efterfulgt af immunoblotting med antistofferne som angivet.

A, nedregulering af ETK udtryk induceret apoptose i blære cancerceller. UM-UC-3 og T24-celler blev inficeret med lentivirus koder for det specifikke shRNA for ETK i 96 timer og apoptose blev vurderet ved TUNEL assays. Apoptotiske celler blev kvantificeret ved at tælle TUNEL-positive celler fra fem tilfældige uafhængige felter. B, ETK regulerer ROS-aktivitet og cytotoksicitet i blære cancerceller som respons på doxorubucin (DOX) behandling. Celler blev inficeret med lentivirus kodning af shRNA specifikt for ETK, ETK T7-taggede ETK eller en vektorkontrol. Efter 48 timer efter infektion blev celler behandlet med DOX (UM-UC-3, 0,5 ug /ml; T24-celler, 2,5 ug /ml) i 20 timer og derefter inkuberet med 10 nM 5 (6) -CDCFDA i 30 min. ROS-positive celler blev talt under fluorescensmikroskopi. Resultaterne blev udtrykt som procent af kontrol. C, ETK regulerer cytotoksicitet i blærekræft celler som reaktion på DOX behandling. Celler blev inficeret som beskrevet i B og behandlet med DOX (T24, 5 ug /ml; UM-UC-3, 0,5 ug /ml) i 48 timer. Cellernes levedygtighed blev vurderet ved WST-1 assays (Top panel). Niveauet af ETK ekspression blev overvåget ved immunoblotting med anti-ETK (Bundplade). *, P 0,05 sammenlignet med kontrollen; **, P 0,01 sammenlignet med kontrollen. D, Knockdown af ETK hæmmede migration og invasion in vitro. Cellemigration og invasion assay blev beskrevet som Metoder. Resultaterne blev udtrykt som procent af kontrol. *, P 0,05 sammenlignet med kontrollen; **, P. 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen

ETK er opreguleret i human blærekræft væv og forudsagde patientoverlevelse

For at undersøge ETK udtryk i humane blære tumorvæv, vi udførte immunhistokemi analyse på human blærevæv mikroarrays indeholdende 619 vævsprøver fra 233 patienter. ETK farvning syntes at være både cytoplasmiske og nukleare positive (fig. 4A), og ETK ekspression blev markant forøget i blære tumorvæv sammenlignet med deres godartede modstykker (tabel 1). Desuden ETK ekspressionsniveauet var signifikant højere i invasive T1-T4 tumorer end i ikke-invasive Tis /TA modparter (p 0,001); imidlertid havde ETK ekspression ikke signifikant inden for T1 til T4 tumorer (data ikke vist). Desuden ETK ekspression steg med tumorklassificering (p 0,001). ETK udtryk i CIS var en bemærkelsesværdig undtagelse, med en gennemsnitlig 12% i cytoplasma, hvilket er lavere end G1-G3 scores (tabel 1), hvilket tyder på en sammenslutning af ETK overepression med blære papillære tumorer. For at vurdere, om ETK kunne bruges som en potentiel prognostisk markør, blev kliniske resultat analyse udført på 118 patienter gennemgik cystectomy der blev fulgt op til en median på 92,3 måneder. Vi identificerede en cutoff punkt på 15% for optimal substratifikationskriterier af disse patienter i henhold til ETK cytoplasmatisk udtryk. Der var 75 tumorer (64%) med lav ekspression (≤15%) og 43 tumorer (36%) med høj ekspression ( 15%). Kaplan-Meier analyse viste, at patienter, der havde højere cytoplasmatisk farvning af ETK (farvning score 15%) havde dårligere samlet overlevelse sandsynlighed (Fig 4B, log-rank test p = 0,0028).. Desuden viste multivariable Cox regressionsanalysen, at ETK er en væsentlig indikator for overlevelse efter justering for andre vigtige klinisk-patologiske variabler, herunder alder, tumor klasse, scene og positiv lymfeknude status (tabel 2). Som anført i modellen, ETK var den eneste uafhængige prognostiske prædiktor for samlet overlevelse med hazard ratio på 1,7 (95% CI: 1,1-2,7, p = 0,0159). Tilsammen viste disse data, at ETK udtryk øges i blærekræft og er forbundet med tumor progression og dårlig prognose.

A, De repræsentative områder af menneskelig blærekræft TMA’er farvet med anti-ETK antistof. B, Kaplan-Meier analyse på sammenslutning af ETK cytoplasmatisk farvning med overlevelsesraten for patienter med cystektomi. Vejviser

Diskussion

Overekspression af ETK er blevet rapporteret i flere kræftformer, herunder prostata, bryst og lungekræft [8], [13], [17], [18]. Dette er den første rapport om deregulering af ETK udtryk i blærekræft. Ofte forhøjet ETK udtryk i blære kræftceller foreslog, at ETK kan spille en kausal rolle i sygdommens udvikling og progression. Dette blev støttet af vores observation, at ETK aktivitet kunne stimuleres af EGF, som tidligere blev påvist at fremkalde vækst og øge invasion af blære cancerceller ved at regulere af AKT-aktivitet [19], [20]. EGF-receptoren er blevet rapporteret stærkt udtrykt i blære cancerceller og er forbundet med cancer progression og dårlig prognose hos patienter [21], [22], [23]. Derfor kan ETK sandsynligvis virke som en nedstrøms effektor af EGF /EGFR at fremme blære tumorvækst og metastase. Det er blevet vist, at ETK overekspression kan øge proliferation i mus prostata epitel og resultere i udvikling af prostata intraepitelialneoplasi (PIN) dels ved at øge AKT og STAT3 aktivitet [13]. Vi fandt, at nedregulering af ETK i blære kræftceller svækkede STAT3 og AKT aktivitet mens eksogen overekspression af ETK havde modsatrettede effekter. Deregulering af STAT3 og PI3K /AKT pathways er blevet vist at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​urothelial carcinom og korrelerer med tumorprogression [24], [25]. Det er muligt, at ETK kan udøve sin rolle i blærekræft gennem regulering disse pathways. Tumormetastase er afhængig af evnen hos tumorceller at invadere normalt væv. Vi viste, at blære kræftceller effektivt kunne invadere en matrix barriere in vitro, og denne evne blev markant afskediget, da ETK udtryk blev slået ned af en specifik shRNA. Knockdown ETK fører til formindsket aktivering af STAT3, som spiller en rolle i blærekræft invasion, delvis forklares den mulige mekanisme for invasion hæmning. Effekten af ​​ETK på celle migration kunne forklares på grundlag af den etablerede rolle ETK i celle migration i prostata og brystkræft celler gennem FAK-medieret integrin signalering [8].

Udover STAT3 og AKT veje, som vides at blive aktiveret af ETK, vi også viste for første gang, at ETK lokaliseres til mitokondrierne i blære cancerceller og derved regulerer ROS produktion og lægemiddelfølsomhed. Andre tyrosinkinaser, herunder Src og EGFR, har vist sig at være til stede i mitochondrier. Salvi

et al

rapporterede, at Src ligger i mitokondrier i rottehjerne [26]. EGFR og Src kan translokere til mitokondrier ved binding underenheden af ​​mitokondrie cytochrom coxidase (Coxα) i en EGF-afhængig måde og modulerer mitokondrisk funktion gennem phosphorylering Coxα [27]. Men den nøjagtige funktion af ETK i mitokondrier har endnu ikke fastslået. Vi fandt, at ETK er forbundet med en Bcl-2 familiemedlem Bcl-XL i blære cancerceller. Knockdown af ETK udtryk fører til en stigning af ROS produktion og sensibilisering af blære caner celle til kemoterapeutiske lægemidler. Det er blevet vist, at DNA-beskadigelse, bestråling og hypoxi kan inducere ROS i cancerceller [28], [29]. Vi har tidligere vist, at ETK kan bibringe resistens i prostata kræftceller ved at interagere med p53 og hæmme dets nukleare transduktion funktion. Det er muligt, at ETK også kan fremme lægemiddelresistens gennem sin beskyttende virkning på mitokondrisk funktion. Vores resultater viste således, at ETK giver en malign og invasive fænotype til blære cancerceller gennem regulering multiple signalveje (fig. 5).

Det er påvist, at STAT3 aktivitet og ekspression er forøget i blærekræft tumor og forudsiger tumor tilbagefald og patient overlevelse [30], [31]. Vores IHC analyse på blærekræft TMA’er viste, at ETK udtryk øges i blærekræft væv sammenlignet med deres godartede modstykker. I betragtning af at målrettet ekspression af ETK i muse prostata fører til udvikling af PIN [13], er det muligt at ETK også kan spille en rolle i oncogen transformation i blæren urothelial celler. Vigtigere, ETK ekspression er højere i invasiv (T1-T4) end ikke-invasive blæretumorer (Tis /TA), hvilket antyder, at ETK også kan spille en rolle i tumorinvasion og metastase. Denne mulighed blev støttet af vores observation, at knockdown af ETK udtryk i blære cancerceller hæmmer deres aktivitet i

in vitro

invasion assays. Endvidere fandt vi, at ETK ekspressionsniveau også kan forudsige overlevelsen af ​​patienter med cystektomi behandling uafhængig af andre vigtige klinisk-patologiske variabler, herunder alder, tumorklassificering, fase og positiv lymfeknude-status. Derfor kan ETK potentielt tjene som et nyt mål lægemiddel til blærekræft behandling samt en biomarkør, som kan anvendes til at stratificere patienter med højere dødelighed risiko. Disse patienter kan være gavnligt fra terapi rettet mod ETK aktivitet.

Materialer og metoder

Cell Culture, transfektion og lentiviral infektion

Menneskelig blærekræft cellelinje T24, 5637, J82, RT-4 og UM-UC-3 samt 293T blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). UM-UC-3, T24 og 293T-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium. 5637, J82 og RT-4-celler blev opretholdt i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum og 1% (v /v) penicillin og streptomycin (100 ug /ml) og holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Celler blev transficeret med HD FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals) ifølge producentens instruktion. Lentivirus-infektion blev udført som tidligere [9].

Immunfældning og Western Blot

Celler blev lyseret i lysisbuffer (20 mM Tris /HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM Na

3VO

4, 1 mg /ml aprotinin, 1 mg /ml leupeptin og 1 mM phenylmethyl-sulfonyl-fluorid). Uopløseligt materiale blev fjernet ved centrifugering, og antistoffer blev tilsat til lysat i natten over ved 4 ° C. Antistoffer blev opsamlet under anvendelse af protein A eller protein G-Sepharose-perler, og proteinkomplekser blev vasket tre gange ved 4 ° C med lysisbuffer. Immunblotning blev udført som beskrevet tidligere [9]. Kort fortalt blev lige mængder af prøve opløst på en SDS-polyacrylamidgel og overført til en polyvinylidendifluoridmembran. Blots blev inkuberet med de angivne primære antistoffer natten over ved 4 ° C og efterfulgt af påvisning med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof. Det monoklonale anti-BMX antistof (BD Transduction Laboratories) blev anvendt ved 1:2000, mens anti-pSTAT3 (Y705), AKT, Pakt (S473), EGFR, pEGFR (Y1175) og pETK (Y40) (Cell Signaling Technology, Danvers , MA) blev anvendt ved 1:1,000. Anti-Bd-XL, anti-tubulin, ERK, VDAC og anti-signal transducere og aktivatorer af transkription 3 (STAT3) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blev anvendt ved 1:2,000.

WST -1, kolonidannelse og TUNEL assays

Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

3 celler /brønd og inficeret med lentivirus koder for ETK shRNA eller en kontrol shRNA. På hvert anført tidspunkt blev cellelevedygtighed målt ved WST-1 (Roche) assay efter fabrikantens protokol. For kolonidannelse assayet celler (1 x 10

4) blev udsået i 6-brønds plader og inficeret med lentivirus til styring shRNA eller ETK shRNA. Celledyrkning blev opretholdt i komplet medium i 14 dage. Cellekolonier blev derefter visualiseret ved Coomassie blue-farvning. UM-UC-3 og T24-celler blev inficeret med lentivirus kodende ETK shRNA eller en kontrol i 96 timer og apoptotiske celler blev detekteret ved TUNEL-assay ifølge producentens instruktioner (Roche). Apoptotiske celler blev kvantificeret ved at tælle TUNEL-positive celler fra fem tilfældige uafhængige felter.

cellemigrering og invasion assays

Cellemigrering vurderet ved transwell assay som tidligere beskrevet [8]. Kort beskrevet blev inficerede celler høstet, resuspenderet i serum-frit medium, og derefter overført til de bedste kamre (5 × 10

4 celler per brønd), mens de nederste kamre indeholdende 0,5 ml konditioneret medium fra NIH 3T3 fibroblaster. Efter 24 timers inkubation blev celler på den øvre overflade skrabes og skyllet væk, hvorimod cellerne migreret til den nedre overflade blev fikseret og farvet med 4 ‘, 6-diamidino- 2-phenylindol (DAPI) i 5 minutter og derefter talt under et fluorescensmikroskop, og det relative antal til vektoren bekæmpelse blev beregnet. Celleinvasion assay blev udført under betingelser på samme måde som ovenfor, bortset fra de transwell filtre blev præ-overtrukket med Matrigel (BD Biosciences) og 1 x 10

5-celler blev anvendt pr brønd.

Immunofluorescens og konfokal mikroskopi analyse

Celler blev mærket i frisk dyrkningsmedium med 200 nM Mitotracker (Invitrogen) ved 37 ° C i 30 min, og blev derefter fikseret med 3,75% formalin i 15 minutter efterfulgt af inkubering med blokerende opløsning [10% æsel serum 0,5% bovint serumalbumin, 0,3% Triton X-100 i PBS] og behandlet med ETK antistof til natten over ved 4 ° C. De immunreaktioner blev afsløret ved inkubering af cellerne med gede-anti-muse FITC 488-konjugeret IgG (Jackson Immuno Research) og DAPI (1:5000) i 5 min. Endelig blev dækglasset indeholdende immunolabeled celler monteret med et anti-fading monteringsmedium (Biomeda gel mount, Electron Microscopy Sciences). Cellerne blev vurderet ved hjælp af en vand nedsænkning 40X objektiv af en Zeiss 510 konfokal mikroskop udstyret med 347-, 488- og 543-nm laserstråler.

Mitokondrisk forberedelse og reaktive ilt arter (ROS) afsløring

Mitokondrier fraktion blev oprenset med Mitokondrier Isolation Kit til dyrkede celler (Pierce) ifølge producentens anvisninger. Intracellulær ROS blev målt ved hjælp af farvestof 5 (6) -CDCFDA (molekylære prober). Efter passage gennem plasmamembranen, er denne lipofile og ingen fluorescerende forbindelse deesterificerede til en hydrofil alkohol (H2DCF), som kan være oxideret til fluorescerende DCF ved en proces normalt anses for at involvere med ROS. Dyrkede celler blev fyldt med 10 pM 5 (6) -CDCFDA i normalt medium ved 37 ° C i 30 minutter. Efter inkubation blev cellerne vasket tre gange med medium og forlod den sidste vask medium for billeddannende undersøgelser. Imaging blev taget af fluorescens-mikroskop ved hjælp af et Nikon TE2000s inverteret mikroskop med 10x objektiv.

Tissue microarray, Immunhistokemi og Statistisk analyse

Tissue microarrays (TMAS) blev udarbejdet af afdelingen for patologi ved University of California, Los Angeles (UCLA) Medical center som tidligere beskrevet [14]. Efterforskere blev kun givet med kliniske-patologiske data såsom tumor scenen og lønklasse. Alle patientens identifikatorer blev fjernet, således at det ikke er muligt at spore helst væv til en bestemt patient. Derfor er patient fortrolighed beskyttes. Under den protokol, der er godkendt af IRB udvalget på UCLA, er ingen patient samtykke kræves til dette studie. TMA blev afparaffiniseret med xylen og farvet som tidligere beskrevet [13]. Kort fortalt blev objektglassene rehydreret og antigen-genvinding blev opnået ved mikrobølge i 15 min i citratpuffer. Objektglas blev derefter inkuberet i 0,3% hydrogenperoxid for at standse endogen peberrodsperoxidase (HRP) i 30 min. Objektglas blev præinkuberet med normal gedeserum i PBS (1:20) i 60 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter inkuberet med primært antistof ETK (1:2000) ved 4 grader natten over. Efterfølgende blev objektglas inkuberet med biotin-mærket anti-kanin-IgG og inkuberet med foruddannet avidin-biotin peroxidase-kompleks. Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxylin, dehydreret og monteret.

Objektglas blev analyseret ved anvendelse af ARIOL SL-50 automatiseret slide scanner (Applied Imaging, San Jose, Californien) for at kvantificere mængden af ​​positiv farvning for hvert område af interesse. Tærskler for hvert billede blev påført ved hjælp af den ARIOL analytisk software baseret på flere parametre: RGB algoritme, form og størrelse. Alle analyser blev udført med MultiStain script. Tærsklingsbehandlede klassificører blev tilpasset til hver plet.

For at vurdere nukleare farvning, blev positiv DAB farvning beregnes ved at anvende to tærskler farve med en anerkendelse af blå baggrund (hæmatoxylin farvede) celler og en anden genkender brune positive celler og blå, ikke- positive celler (total celle nummer). Individuelle celler blev diskrimineret ved at indarbejde tærskler form og størrelse, giver sammen med den farve tærskler, faktiske celletal. Procent af positivitet blev bestemt ved at dividere celleantallet detekteres af brune tærskel med det samlede celleantal, detekteres af summen af ​​de brune og blå tærskler. Samlet væv område analyseret blev også medtaget i den endelige analyse (um

2).

For at vurdere cytoplasmatisk farvning, blev området positive plet beregnes ved at anvende tærskler farve til at opdage positive brune pixels. Procent af positivitet blev bestemt ved at dividere den samlede positive pletareal (um

2) med det samlede væv areal analyseret (um

2).

immunreaktive score for hvert enkelt tilfælde blev kvantificeret af den gennemsnitlige af fire kerner. Foreninger mellem ETK udtryk og patologiske parametre blev vurderet med de parametriske Kruskal-Wallis test. Forskellige overlevelse /gentagelse endepunkter blev vurderet for patienter, som gennemgik TUR og patienter, som gennemgik cystektomi. Kaplan-Meier-kurver blev anvendt til at estimere overlevelse /fornyet-fri tidskurver og log rank test blev anvendt til at teste, om kurverne var forskellig mellem grupperne. COX flere Cox proportional hazards model blev brugt til at vurdere, hvilke kovariater påvirker overlevelse /tilbagefald-fri tid. For hver kovariat blev den relative fare sats og den tilhørende

P Drømmeholdet værdi rapporteret. Alle analyser blev udført med softwaren SAS-version 9.2.

Tak

Vi vil gerne takke Dr. Allan J. Pantuck for hans råd om dataanalyse.