PLoS ONE: Epigenetisk forordning af Elf5 er forbundet med Epithelial-Mesenchymale Transition i urothelial Cancer

Abstrakte

E74-lignende faktor 5 (Elf5) er blevet forbundet med tumor undertrykkelse i brystkræft. Men dens rolle i urotelial cancer (UC) er fuldstændig ukendt. Immunhistokemi (IHC) og methylering specifikke PCR (MSP) blev udført til påvisning Elf5 ekspressionsniveauet og dets promotor-methylering. Resultaterne viste, at lav ekspression af Elf5 på protein og mRNA-niveauer var associeret med tumorudvikling, tidlig tilbagefald og ringe overlevelse. In vitro, kan nedregulering af Elf5 øge epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Afvigende Elf5 methylering blev identificeret som væsentlig mekanisme til Elf5 gen stilhed. Følgelig genoprettelse af Elf5 ved infektion eller demethylering behandling effektivt vendt EMT processer. Afslutningsvis identificerede vi Elf5 som en ny biomarkør for UC på flere biologiske niveauer og etableret en årsagssammenhæng mellem Elf5 og EMT i UC

Henvisning:. Wu B, Cao X, Liang X, Zhang X, Zhang W Sun G, et al. (2015) Epigenetisk Regulering af Elf5 er forbundet med Epithelial-Mesenchymale Transition i urothelial Cancer. PLoS ONE 10 (1): e0117510. doi: 10,1371 /journal.pone.0117510

Academic Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: August 1, 2014 Accepteret: December 29, 2014; Udgivet: 28 januar 2015

Copyright: © 2015 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Vores data er faktisk fås fra tredjepart (Tianjin Institute of Urology), men de er kun tilgængelige efter anmodning på grund af etiske restriktioner, som The Second Hospital i Tianjin Medical University. Læsere kan kontakte Dongwen Wang ([email protected]) at anmode de data

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

EMT påvirker kritiske trin i markante ændringer i celleadhæsion, polaritet og vandrende ved interconverting epitelceller i celler med mesenkymale /stamcelle (SC) state [1, 2,3]. EMT og dens omvendte program, mesenkymale-epitelial overgang (MET), blev aktiveret i tumorceller og disse fremskridt gør disse celler til at erhverve cellulære træk forbundet med høj kvalitet, invasionsevne og tilbagefald [3,4,5]. I betragtning af kompleksiteten og dynamiske karakter EMT, er det umuligt at blive vedligeholdt af en enkelt signalvej. TGF-β, Wnt, Notch, Sonic Hedgehog, EGF og FGF veje har vist sig at være vigtige for styrende disse overgange i cancer udvikling og progression [2,3,6,7]. For nylig er epigenetiske modifikationer, såsom methylering /demethylering også vist sig at være involveret i EMT [8,9,10]. Imidlertid er de signaleringsmekanismer at inducere og vedligeholde denne mesenkymale /SC tilstand stadig uklart.

Elf5 er medlem af epitelet specifik undergruppe af det store E-seksogtyve (ETS) transkriptionsfaktor familie. Det er blevet bevist som en central transkriptionel faktor for brystkræft afstamning ved at undertrykke østrogen følsomhed i luminale celler og fremme basale karakteristika i basale brystkræftceller [11]. Nyere undersøgelser viser Elf5 er ikke kun som en nøgle celleafstamning regulator, men også som en undertrykker af EMT ved at undertrykke transskriptionen af ​​Snail2 [12]. Desuden er Elf5 gendæmpning udløst af dynamisk promotor hypermethylering i de processer af human placenta udvikling og embryonisk celle afstamning dannelse [13,14]. Men roller Elf5 i urotelial cancer (UC) udvikling og progression forblive udefineret.

Blære UC er den sjette mest almindelige kræftform i verden med omkring 386 tusind nye tilfælde i 2008 og anslået 150.000 dødsfald [15]. Ved den første diagnose af UC, næsten 80% af patienterne til stede med ikke-muskel invasiv blærekræft (NMIBC), mens de rester med muskel invasiv sygdomme [16,17]. Af disse patienter med NMIBC, 50% -70% vil have mindst én tilbagefald i 5 år, og over 20% vil udvise muskel infiltration [18] og forårsage en dødelighed på op til 50% inden for 2 år efter diagnosen [19] . Spørgsmålet er forbundet med UC er deres meget uforudsigelige potentiale for recidiv og progression. Derfor ønskede vi at undersøge, om epigenetisk inaktivering af Elf5 er forbundet med UC progression og tidlig recidiv

Materialer og metoder

Etik erklæring, Patienter og prøver

Kohorte 1.:

Der blev opnået i alt 182 formalinfikserede paraffinindlejrede blære UC prøver blandt de 275 konsekutive patienter mellem 2004 og 2008 fra patologiske afdelinger i Tianjin Institute of Urology (tabel 1). 10 moderne formalinfikseret paraffinindlejret normale urothelium (NU) blev også opnået. Blandt de analyserede patienter, 115 primære blærer professionshøjskoler undergik transuretral resektion af blæren tumor (TURBT) (

Kohorte 1A

), og de forblev 67 patienter undergik radikal cystektomi (

Kohorte 1B

). Ingen af ​​de primære patienter fik nogen præoperative kræftbehandlingen. Opfølgning oplysninger er indhentet fra de medicinske journaler på patienter, som opfyldte inklusionskriterier undersøgelse. Kort sagt, patienter præsenteret postoperativt hver 3. måned i de første 2 år efter terapi og halvårligt derefter. Gentagelse blev defineret som ny tumor observeret i blæren efter TURBT. Gentagelse overlevelse (RFS) blev beregnet som tiden fra TURBT til datoen for tilbagefald. Sygdomsspecifikke overlevelse (DSS) blev beregnet som tiden fra radikale cystektomi til datoen for død fra UC. Mean opfølgning var 49,4 måneder (spændvidde 6-90) og 56,4 måneder (interval 6-106) i

Kohorte 1A

Kohorte 1B

henholdsvis.

Kohorte 2:

En serie af 10 NU og 50 UC væv blev opnået fra retrospektiv registrering af Tianjin Institute of Urology. Disse væv blev flash-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C mellem 2010 og 2013. Der var ingen bekræftede tilbagefald og død i undersøgelsen.

patologiske diagnoser og klinik-patologiske faktorer i de to kohorter blev etableret baseret på den generelle retningslinje for primær blærekræft som defineret af TNM klassifikationen 2002 og 1973 WHO klassificeringssystem af erfarne patologer. Undersøgelsen Protokollen blev godkendt af den etiske komité i Second Hospital i Tianjin Medical University, og skriftligt informeret samtykke til brug af prøverne fra hver patient tilmeldt blev opnået i overensstemmelse hermed. Alle vævsprøver og journal data blev anonymiseret før at få adgang til og analyse af forskerne.

Cell kultur og behandling

De humane blære cellelinier UROtsa, RT112, HT1376, J82 og T24 var oprindeligt opnået fra ATCC. Cellelinjen EJ var en gave fra Dr. Ruifa Han (Tianjin Medical University, Kina. Han opnåede celle linje fra ATCC). UROtsa blev dyrket i DMEM (Gibco, Shanghai). HT1376 blev dyrket i Eagles Minimum Essential Medium (EMEM, ATCC). Andre cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640 (Gibco, Shanghai). Alle dyrkningsmedier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Melbourne) og 1% penicillin /streptomycin. Mycoplasma-infektion blev regelmæssigt testet ved hjælp af PlasmoTest

TM (InvivoGen, San Diego, CA). Når det er nødvendigt, blev celler behandlet med 5 uM 5-Aza-2′-deoxycytidin (5-AZA, Invivogen) efter i forvejen bestemte koncentration i 6 dage inkubation [20,21].

RNA-ekstraktion og kvantitativ RT -PCR

RNA blev isoleret under anvendelse af GenElute (Sigma-Aldrich, Shanghai) ifølge producentens instruktioner. Vendt transkription blev udført under anvendelse Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Shanghai). RT-PCR blev udført på en BioRad iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories) PCR-maskine (Applied Biosystem) ved anvendelse SYBR Green Master Mix. De genspecifikke primersæt blev anvendt ved en slutkoncentration på 0,2 uM og deres sekvenser er anført i S1 tabel. Hver prøve blev kørt og analyseret i tre eksemplarer.

bisulfit modifikation og MSP

Genomisk DNA blev opnået fra vævsprøver ved hjælp DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) ved at følge fabrikantens protokol. Det ekstraherede DNA blev behandlet med bisulfit til at konvertere ikke-methylerede cytosiner til uraciler før methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (MSP) under anvendelse EpiTect bisulfit Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Modificeret DNA blev opformeret ved hjælp MSP primere (S1 tabel), som der er anerkendt enten methylerede (produkt størrelse 258 bp) eller methylerede (258 bp) Elf5 promoter sekvens efter bisulfit konvertering. Normal DNA fra humane appendix vermiformis blev behandlet in vitro med SSSI methyltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA) til at generere en positiv kontrol for methylerede alleler [22].

IHC farvning

paraffin- indlejrede sektioner (4 um) blev afparaffiniseret og hydreret i xylen efterfulgt af graduerede alkoholer til vand. Antigen genfinding blev udført i 0,01 M citrat til to gange 10 minutter i en mikrobølgeovn efterfulgt af en 60-min køle ned. Objektglas blev derefter inkuberet med forskellige primære antistoffer, efterfulgt af Envision-plus mærkede polymer-konjugeret peberrodsperoxidase og DAB overvågning farvning (Zhongshan guld bro, Beijing). Derefter blev slides kontrastfarvet og dehydreret for visning og billeddannelse. Antistoffer var:. Anti-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-E-cadherin (Abcam, Cambridge, MA), anti-N-cadherin (Abcam), anti-vimentin (Abcam)

Scoring af IHC farvning

Elf5 score: hele afsnit blev evalueret af to respektive observatører være uvidende om de kliniske data. Tumorcellerne blev bestemt positiv, når en klart synlig farvning blev påvist i kernen. NU væv blev inkluderet for at være så interne kontroller. Procent af farvning positiv celle blev gradueret som 1% til 100% med en 5% interval. Tælles procenter blev afrundet til nærmeste gear. En cut-off værdi på 10% blev fastsat vilkårligt, og i henhold til denne værdi, to grupper (lav og høj Elf5 farvning) blev tildelt

Vimentin og E-cadherin score:. Fem tilfældige forstørrelse felter lave blev udvalgt , så andelen af ​​positive region blev bestemt ved ImageJ program. Cut-off-værdier blev bestemt af medianen, ifølge hvilke, to grupper (lav og høj ekspression) blev tildelt.

Molekylær kloning og virusinfektion

Plex plasmider (Open Biosystems) indeholdende komplementære DNA’er til kontrol GFP og Elf5 blev genereret ved rutinemæssige molekylære kloningsteknikker. HA-mærkede WT Elf5 cDNA’er blev subklonet fra pCMV-HA-vektoren til Plex plasmider ved anvendelse BamH1-Not1 restriktionsenzymer. Lentivirus produktion udførtes i det væsentlige som beskrevet tidligere [23]. Viralt inficerede celler blev selekteret med puromycin.

siRNA knockdown

I Knockdown eksperimenter, siRNA rettet mod Elf5 genet (5′-AGCCCTGAGATACTACTATAA-3 ‘, katalognummer GS2001) og siRNA negativ kontrol blev købt fra Qiagen. Derefter blev transfektioner udført ved anvendelse af Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen).

immunblotting

Protein blev ekstraheret med RIPA-lysepuffer. Proteinlysater blev opløst på 10% Bis-Tris Gel, overført til PVDF-membraner, probet med HRP-bundne sekundære antistoffer (GE Healthcare), og visualiseret med ECL-reagens (Thermo Scientific). Antistoffer var: anti-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-E-cadherin (Abcam, Cambridge, MA), anti-N-cadherin (Abcam), anti-vimentin (Abcam), anti-snail ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-ZEB1 (Abcam).

Cellelevedygtighed assay

Indiceret celler blev podet i 24-brønds plader ved en densitet på 5.000 per brønd i medium indeholdende 10% FBS. På det angivne tidspunkt tidspunkt blev mediet fjernet og serum-frit medium indeholdende 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; 0,5 mg /ml; Sigma) blev derefter tilsat til hver godt. Fire timer efter inkubation ved 37 ° C blev cellulære formazan produkter opløses med sur isopropanol, og absorbansen ved 570 nm blev målt ved spektrofotometri (Beckman Du640B). Seks replikatbrønde blev anvendt for hver prøve på hvert tidspunkt.

Migration assays

Femogtyve tusinde celler blev podet i 24-brønds cellekultur indsætter med 8 mm porer (BD Falcon). Efter 24-48 timer blev cellerne på den øvre overflade af filtrene fjernes med en vatpind. Til visualisering blev celler på lavere filteroverflader fikseret og farvet med en toluidinblåt. Hele områder af filteret blev talt. Data er præsenteret som migrerede celler pr

Sphere assay Salg

Assays blev udført som tidligere beskrevet med modifikationer [24]:. 1000 celler /brønd blev podet i 6-brønds ultralav friktion plader (Costar) i MEGM medium indeholdende 10% serum udskiftning (KnockOut) suppleret med 1 × MEM ikke-essentielle aminosyrer (Gibco), 20 ng /ml EGF (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Elf5 mRNA ekspression er faldet i human blære urotelial kræft

Relative Elf5 niveauer i tumorvæv fra 50 UC patienter blev bestemt ved QRT-PCR spanning 90 bp, normaliseret ved GAPDH, og blev sammenlignet med medianen af ​​10 normale væv kontrolprøver (fig. 1a). Relativ Elf5 ekspression i normale væv var variabel inden for et område på 0,39 til 10,56 gange af median niveauer. Tumorprøver viste et fald i Elf5 niveauer inden for en afstand på 0,03 til 2,02 gange i sammenligning med den samme kontrol som normalt væv, med en median på 0,40 gange lavere ekspression (fig. 1a). For at bestemme om Elf5 niveau viste nogen signifikant forskel mellem forskellige tumor etaper, blev fold ændring i Elf5 udtryk beregnes. Intermediate reduktion af Elf5 mRNA blev påvist i NMIBC og lav risiko UC, mens der blev observeret meget betydeligt tab af Elf5 mRNA udtryk i invasive (pT2-4,

P

. 0,01, figur 1b) og høj risiko UC (høj kvalitet pTA, CIS og invasive UC,

P

. 0,01, figur 1c), sammenlignet med NMIBC og lav risiko UC (lav kvalitet pTA), hhv. Baseret på disse resultater, nedsat Elf5 ekspression synes at være en vigtig begivenhed i UC udvikling og progression.

a, er Elf5 mRNA-ekspression undersøgt i 50 UC og 10 NU vævsprøver af Real-time PCR. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM). b og c, Box plots viser signifikant nedreguleret Elf5 mRNA i både invasive (pT2-4) og risikofyldte professionshøjskoler (Hg-R). Vandrette linjer: grupperede medianer. Kasser: 25-75% kvartiler. Lodrette linjer: minimum og maksimum; NS: ikke signifikant, *

P

0,05, **

P

0,01. Lav-risiko UC (Lw-r): lav kvalitet PTA; Hg-r UC: Høj kvalitet PTA, CIS og invasive UC. De viste resultater er fra to eller tre uafhængige forsøg.

Elf5 protein er faldet i urotelial Kræft og forbundet med tumor progression

Dernæst immunhistokemi analyser af humane NU og UC prøver blev udført at kontrollere, om Elf5 udtryk faldt i UC på protein niveau. IHC-farvning blev kvantificeret ved at tælle andel af positive-farvet kerne. I overensstemmelse med mRNA data, fandt vi Elf5 protein blev farvet i de fleste normale urothelial epithelceller (fig. 2a). I modsætning hertil blev Elf5 ekspression tydeligt reduceret i UC væv (fig. 2b) og næsten fuldstændigt tabt i invasive tumorer (fig. 2c). Derefter blev den Elf5 udtryk kvantificeret i henhold til tumor etaper. Stærk Elf5 farvning blev demonstreret i NU prøver med et gennemsnit på 34,10 ± 10.21 positiv sats, hvorimod der ikke blev observeret moderat og svag Elf5 farvning i PTA (19,36 ± 1,77,

P

0,05) og invasive professionshøjskoler (11,03 ± 2,56,

P

. 0,01, figur 2d), hhv. Dette antydede, at Elf5 lyddæmpning kan bidrage til UC invasiv. Vi yderligere evalueret den prognostiske værdi af Elf5 i to kliniske databaser (

Kohorte 1A og Kohorte 1B

) af UC ved univariate Kaplan-Meier analyse. Kohorte 1A var sammensat af patient med NMIBC, der modtog behandling af TURBT. Patienter fra denne gruppe er sjældent konfronteret med døden, men altid sygdomstilbagefald, så RFS blev anvendt. Vi fandt, at patienter med højt Elf5 udtryk tendens til at have bedre RFS (HR = 0,34,

P

= 0,001, Fig. 2e). I modsætning hertil patienter fra kohorte 1B tendens til at blive konfronteret med døden, så DSS blev valgt. Resultat afslørede også signifikant tendens til gunstig prognose for Elf5 høje patienter (HR = 0,49,

P

= 0,04, figur 2f.). Kodeværktøjer blev resultater baseret på cut-offs af 5% og 15% også udført (S1 Fig.). De samme tendenser med lignende resultater blev opnået, selv om en ikke-signifikant højere DSS blev påvist hos patienter med Elf5 ekspression mere end 15%. Samlet set støtter vores kliniske data den formodede rolle, Elf5 kan fungere til at modsætte blærekræft progression.

a, repræsentant stærk Elf5 IHC farvning i epitelceller fra NU (85%). Scale barer, 100mm. B, repræsentant moderat Elf5 farvning i ikke-invasive PTA tumorer (30%). c, Repræsentant svag farvning i invasiv NU ( 5%). d, Box plot viser Elf5 IHC-farvning i NU (n = 10), PTA-1 (n = 146) og invasive UCS (n = 36). Vandrette linjer: grupperede medianer. Kasser: 25-75% kvartiler. Lodrette linjer: minimum og maksimum; *

P

0,05, **

P

0,01. e, Kaplan-Meier kurver for tilbagefald overlevelse (RFS) i henhold til Elf5 farvning niveau i den primære NMIBC behandlet af TURBT. f, Kaplan-Meier kurver af sygdomsspecifikke overlevelse (DSS) i henhold til Elf5 farvning niveau i UC patienter efter radikal cystektomi.

Elf5 knockdown i epitel-lignende HT1376 celler inducerer EMT

Forrige beviser har afsløret en mekanisme Elf5 hæmme EMT i brystkræft [12]. At undersøge om Elf5 også kan regulerer EMT i forbindelse med UC, testede vi Elf5 ekspressionsmønstre i et panel af urothelial cellelinier. Et særlig lavt niveau af Elf5 blev bemærket i cellelinier karakteriseret ved mesenkymale markører (EJ og T24), mesenchymale-lignende celler, hvilket antyder en potentiel inhiberende rolle Elf5 i EMT (fig. 3a). I epitel-lignende UROtsa, RT112 og HT1376 celler (identificeret af høj ekspression af epitel markører), blev højt Elf5 udtryk påvist (fig. 3a). For at teste den mulige sammenhæng mellem Elf5 og EMT, lille interfererende RNA’er (siRNA’er) blev anvendt til at vælte Elf5 i epitel-lignende HT1376 celler. I modsætning til de epiteliale ø-dannende, parentale celler, siRNA-behandlede celler bestod af front-to-back polariserede, enkelte celler (fig. 3b). Svarende til tidligere rapporterede EMT celler [6,12], siRNA-behandlede celler udtrykte reduktion i E-cadherin og stigning i N-cadherin, vimentin samt EMT-fremmende transkriptionsfaktorer (fx. Sneglen og ZEB1) (fig. 3c) .

a, er Elf5 og EMT markører detekteret ved Western blot-analyse i urothelial cellelinier. B, Bright-fase mikroskopi: T24 celler transduceret med vektor eller HA-Elf5 og HT1376 celler behandlet med kontrol eller Elf5 siRNA. c, Western blot analyser af Elf5 og EMT markører i T24 celler transduceret med vektor eller HA-Elf5 og HT1376 celler behandlet med kontrol eller Elf5 siRNA. d og e, Sphere assay (n = 6) og Migration assay (n = 3): lys-fase mikroskopi billeder og kvantificering af forældrenes T24, T24-vektor, T24-Elf5, og forældrenes HT1376 samt kontrol og Elf5-siRNA behandlede HT1376 celler. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM, **

P

0.01.f og g, blev Cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse MTT assay. Data er vist som middelværdi ± SEM. Seks replikatbrønde blev udført for hver prøve på hvert tidspunkt.

Kuglen assay måler forankringsuafhængig proliferation ved klontæthed in vitro er blevet forbundet med tilstedeværelsen af ​​epitel-mesenkymale tilstand [6]. Vi undersøgte derfor sfære-dannende evner HT1376 celler at måle deres status EMT. I forhold til de parentale og kontrol siRNA (siRNA Ctrl) -celler, nedregulering af Elf5 var 3-fold beriget med kugle-dannende celler (Fig. 3d). For at teste en anden funktionel kendetegnende for mesenkymale tilstand, vi gennemførte i vitro invasive analyser. Elf5-knockdown celler var mere invasive (18-gange sammenlignet med forældre- og kontrol celler, Fig. 3e). Endvidere cellelevedygtighedsassays ved MTT bekræftet, at virkningen af ​​Elf5 tavshed kugle-dannende evne og invasionsevne er ikke en konsekvens af forøget celletal (fig. 3f og 3g). Sammen vores observationer indikerer, at Elf5 er en inhibitor af EMT i UC celler.

Elf5 fremmer MET i mesenkymale-lignende T24 celler

I mellemtiden, forholdet mellem Elf5 og EMT blev bekræftet af stabil overekspression af Elf5 i mesenkymale-lignende T24 celler, som ikke udtrykker påviselige endogene Elf5 (fig. 3a). Vi fandt Elf5 overekspression effektivt forøget dannelse af epitelial ø i T24-celler (fig. 3b). Desuden Elf5 overekspression faldt ekspressionsniveauet af flere mesenchymale cellemarkører, såsom N-cadherin og vimentin, og forøget ekspression af E-cadherin (fig. 3c). Desuden faldt EMT-relaterede transkriptionsfaktorer blev også påvist i Elf5-overeksprimeres T24-celler (Fig. 3c). Funktionelt, blev 5-fold kugle-dannende evner og 4-dobbelt invasionsevne faldet efter stabil håndhæves-ekspressionen af ​​Elf5 i T24 celler sammenligne med tomme plasmid gruppe (fig. 3d og 3e). Elf5-induceret MET blev yderligere bekræftet i PC3-celler, en mesenchymal-lignende prostatacancer-cellelinie med kraftig invasivitet (data ikke vist). Kollektivt, vores observationer indikerer, at Elf5 er en håndhæver af MET i UC celler.

Elf5 er forbundet med E-cadherin og vimentin udtryk i menneskelig UC

For at bekræfte in vitro finde, at Elf5 er en hæmmer af EMT og en håndhæver af MET i UC celler, vi analyserede ekspressionsniveauerne af Elf5, E-cadherin og vimentin ved IHC i

Kohorte 1

patientprøver (fig. 4a). Lav udtryk for Elf5 (f.eks tilfælde 2) er påvist i 56,6% (103 af 182) af prøverne og væsentligt forbundet med lav E-cadherinekspression (

P

0,05) og høj vimentin udtryk (

P

0,05, figur 4b).. Disse data tyder på, at Elf5 omvendt er associeret med mesenkymale fænotype hos patienter med UC.

A og B, IHC farvning af E-cadherin og vimentin i repræsentative sager med høj (tilfælde 1) og lav Elf5 udtryk prøve ( tilfælde 2). Scale barer, 100mm. b, Korrelation analyse af Elf5 og EMT markører E-cadherin /vimentin.

Elf5 promotor hypermethylering omvendt korrelerer med Elf5 mRNA-ekspression i human UC

Efter tabet udtryk for Elf5 i menneskelig UC væv er anerkendt, vi yderligere gå til at forespørge de potentielle årsager. Nylig undersøgelse har vist, at placenta Elf5 udtryk nedreguleret med gestationsalder stigning alder, og epigenetisk regulering blev vist sig at være som “gatekeeper” [13]. Vi derefter testet, om aktiviteten staten Elf5 i human UC også epigenetisk styret af dens DNA methylering. For det første, vi designet primere til MSP hjælp MethPrimer [25]. MSP til sekvensen af ​​Elf5 promotor mellem -1000 bp og transkriptionsstartstedet viste kun én methylering i 10 NU prøver (1/10, fig. 5a). Efterfølgende analyserede vi methylering status Elf5 promotoren i prøver blærekræft (

Cohort 2

, n = 50) (fig. 5a), og fandt en methylering frekvens på 72% (36/50). For at bestemme om Elf5 promotor methylering bidrager til Elf5 udtryk tab i UC, vi korreleret methylering og mRNA-ekspression niveau i patienter fra

Kohorte 2

. Som i fig. 1a, 10 NU væv fungerede som kontrol og deres median udtryk rate blev sat til absolut værdi 1,0. Sammenlignet med disse NU væv viste umethyleret UC en næsten lige Elf5 udtryk uden at overveje tumor stadie eller bedømmelse (median: 0,80,

P

= 0,08, figur 5b.). I modsætning hertil viste denatureret tumorvæv et betydeligt tab af Elf5 mRNA-ekspression (median: 0,33,

P

0,01, figur 5b.). Denne korrelation mellem tab af Elf5 mRNA-ekspression og Elf5 promotor methylering antyder aberrerende Elf5 methylering synes at være en vigtig mekanisme til Elf5 gendæmpning i UC.

a, repræsentant MSP resultaterne af Elf5 promotor-methylering i NU, PTA og invasive UC vævsprøver samt i negative og positive kontroller. U og M repræsenterer methyleret og methyleret DNA. Bisulfit omdannet methyleret genomiske er polymethylated genomisk DNA og ikke-skabelon anvendt som kontroller. b bliver Elf5 mRNA-ekspression af Real-time PCR undersøgt ifølge Elf5 promotor status for methylering i 10 NU og 50 UC vævsprøver. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. c, Box plot viser tab af Elf5 mRNA-ekspression i patienter med methylerede Elf5 promotor. Vandrette linjer: grupperede medianer. Kasser: 25-75% kvartiler. Lodrette linjer: minimum og maksimum. **

P

0.01.

Målretning promotor methylering fører til Elf5 udtryk i UC-cellelinjer

Promotor methylering i humane blære cancer cellelinjer blev analyseret ved hjælp af MFP. De mesenkymale-lignende UC cellelinjer T24 og EJ afslørede en hypermethylering i deres promotorområder, mens hypometylering blev påvist i lav-invasive HT1376-celler (Fig. 6a). Vi målte niveauet af Elf5 mRNA-ekspression under anvendelse af RT-PCR-assay. Dermed afslørede højere Elf5 mRNA udtryk i hypomethylated cellelinier (Fig. 6b). At bekræftede forholdet mellem promotor methylering status og Elf5 udtryk, vi behandlede disse UC cellelinjer HT1376, J82, EJ og T24 med 5 uM demethyleringsmiddel 5-AZA. Elf5 mRNA ekspression blev signifikant genoprettet efter 5-AZA behandling undtagen det var i hypomethylated HT1376 (fig. 6b). Derudover blev Elf5 proteinekspression også vendt ved demethylering i T24 og EJ cellelinjer (fig. 6c og 6d).

a, repræsentant MSP resultater illustrerer promotoren methylering status Elf5 af urothelial cellelinier. b Kvantitativ RT-PCR-analyse udtryk for Elf5 mRNA i forældrenes UC cellelinjer og 5-AZA-behandlede HT1376, J82, EJ og T24. NS: ikke signifikant, *

P

0,05, **

P

0,01. c og d, Western blot-analyser af Elf5 og EMT markører i EJ og T24-celler behandlet med eller uden 5-AZA. e og f, Migration assay: kvantificering af T24 samt EJ behandlet med eller uden 5-AZA, n = 3. g og h, Sphere assay: kvantificering, n = 6. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM, **

P

0.01.

For at afgøre, om den nyligt udtrykte Elf5 protein er funktionelt, EMT beslutningstagere og EMT-relaterede transkriptionsfaktorer blev analyseret ved immunblotting samt invasion og sfære dannelse analyser. Vi fandt epitelcelle markør steg og mesenchymale cellemarkører faldt efter 5-AZA behandling i to mesenchymal-lignende UC cellelinjer (fig. 6c og 6d). Efter 6 dages forbehandling, 5-AZA reduceret 2,4 gange og 2,7 gange invasivitet i T24 og EJ celler, (fig. 6e og 6f). For sfære dannelse, 5-AZA indført henholdsvis 3,2 gange og 4,7 gange reduktion i T24 og EJ celler (Fig. 6g og 6h). Det er rimeligt at konkludere, at promotor hypermethylering bidrager til tab af Elf5 udtryk i UC-cellelinjer.

Diskussion

Tre signifikante observationer blev noteret i denne undersøgelse. Først Elf5 er en prognostisk faktor hos patienter med UC. Vi viste, at Elf5 udtryk negativt var korreleret med tumor kvalitet og scene. Den tidlige tilbagefald og sygdomsspecifikke død blev også observeret hos patienter med lavt udtryk for Elf5.

In vitro

, lav Elf5 ekspression er forbundet med høj invasivitet, der effektivt kan reduceres med over-udtrykkende Elf5 med vilje. For det andet, resultater fra IHC farvning af UC prøver afslørede en negativ sammenhæng mellem transskription faktor Elf5 og EMT, som er afgørende for at opretholde cellulære træk forbundet med høj kvalitet, invasiv og gentagelse. Desuden blev denne observation påvist i cellelinjer ved kunstig regulering af Elf5 ekspression. For det tredje Elf5 genet hypermethyleret i cancerceller, således at udvidelse af mesenchymale rum og efterfølgende SCs induceres og opretholdes.

modsætning mus, det humane Elf5 gen huser fire slags transkript varianter med to alternative transkriptionsstart , ét, der identificerer med ortologe startsted af muse-genet og giver anledning til Elf5-2b isoformen, mens den anden er omfattet i intronen i Elf5-2b frembringer en længere variant Elf5-2a. En anden afskrift variant splejset isoform af Elf5-2b med ets konsensus motiv tilbageholdt mangler af de kodende exons 3 og 4 (SAM /Pointed domæne), et udbredt domæne signalering og nukleare proteiner [13]. I nyere undersøgelse blev Elf5-2b variant skelnes som en vigtig form for Elf5 udtrykt i menneskelig, så denne isoform blev valgt i vores undersøgelse såvel som i et andet papir, hvor Elf5 blev demonstreret at være en hæmmer af EMT i brystkræft [12].

Flere undersøgelser har vist, at epigenetisk regulering af Elf5 gen er en slægt gatekeeper mellem de embryonale og trofoblast afstamning rum, samt mellem basal og luminale epitelceller [14,26]. Her viser vi, at DNA-methylering fungerer som en barriere af EMT i UC celler. Den Elf5 promotoren er CpG rig, men ikke opfylder kriterierne for en CpG ø (https://cpgislands.usc.edu). Detaljeret karakterisering af Elf5 promotor methylering profil ved bisulfit sekventering afslørede, at langt størstedelen af ​​CpG rester i 1 kb opstrøms regionen blev methyleret i celler med tab af Elf5 udtryk [14,26]. Så primere kræsne sekvens i denne region blev designet i denne undersøgelse. I yderligere dataanalyse fandt vi, at tabet af Elf5 udtryk ikke kun var begrænset til patienter med hypermethylering i Elf5 gen promotor. Det er tydeligt fra dataene, at promotor-methylering er ikke den eneste determinant for Elf5 ekspression i UC-celler. Tidligere undersøgelser har demonstreret hormon som et effektivt stimuli, der kan fremkalde Elf5 ekspression i luminale epitelceller, selv om mekanismer bag disse virkninger er endnu ikke belyst [27,28]. Derudover kan nogle transkriptionelle repressorer såsom estrogen receptor (ER) undertrykke Elf5 ekspression i fravær af promotor-methylering, fordi vi fandt, at Elf5 overvejende udtrykkes i ER negative luminale epitelceller [29], og et potentielt DNA bindingssted for ER har blevet identificeret nær Elf5 genet [30].

Klinisk den besværlige problem med hensyn til NMIBC er uforudsigelighed af tilbagefald og progression i en muskel invasiv sygdom, så det er nødvendigt at kigge efter effektive prognostiske biomarkører for patienter på høj risiko.