PLoS ONE: Pterostilbene-isothiocyanat konjugat Undertrykker Vækst af prostatacancerceller uanset Androgen receptor status

Abstrakte

Kemoterapi og anti-hormonbehandlinger er de mest almindelige behandlinger for ikke-orgel-indesluttede prostatakræft (PCA). Imidlertid er effektiviteten af ​​disse behandlinger begrænses, hvilket nødvendiggør udviklingen af ​​alternative metoder. Nærværende undersøgelse omfattede en analyse af den rolle, pterostilbene (PTER) -isothiocyanate (ITC) konjugat – en ny klasse af hybrid forbindelser syntetiseret ved at tilføje en ITC-del på PTER rygrad – i regulering funktioner androgen receptor (AR), hvorved apoptose af PCA celler. Konjugatmolekylet forårsagede 50% vækstinhibering (IC

50) ved 40 ± 1,12 og 45 ± 1,50 uM i AR positive (LNCaP) og negative (PC-3) celler. Den reducerede proliferation af PC-3 samt LNCaP-celler ved konjugatet korreleret med akkumulering af celler i G2 /M-fase og induktion af caspase afhængig apoptose. Både PI3K /Akt og MAPK /ERK veje spillede en vigtig og differentieret rolle i konjugat-induceret apoptose af disse PCA celler. Mens inhibitoren af ​​Akt (A6730) eller Akt-specifik lille interferens RNA (siRNA) i høj grad sensibiliseret PC-3-celler til at konjugere-induceret apoptose, tværtimod, blev apoptose fremskyndet af inhibering af ERK (ved PD98059 eller ERK siRNA) i tilfælde af LNCaP-celler, både i sidste ende kulminerer i ekspressionen af ​​spaltet caspase-3-protein. Desuden blev anti-androgen aktivitet af konjugat medieret af reduceret ekspression af AR og dets co-aktivatorer (SRC-1, GRIP-1), således at blande sig i deres samspil med AR. Alle disse data antyder, at konjugat-induceret inhibering af celleproliferation og induktion af apoptose delvist medieres af nedreguleringen af ​​AR, Akt, og ERK-signalering. Disse observationer giver et rationale for at udtænke nye terapeutiske tilgange til behandling af PCa ved hjælp konjugat alene eller i kombination med andre terapeutiske

Henvisning:. Nikhil K, Sharan S, Chakraborty A, Roy P (2014) Pterostilbene-isothiocyanat konjugat undertrykker vækst af Prostata Cancer Cells Uanset af Androgen receptor status. PLoS ONE 9 (4): e93335. doi: 10,1371 /journal.pone.0093335

Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

Modtaget: September 30, 2013; Accepteret: 3 marts 2014; Udgivet: April 3, 2014

Copyright: © 2014 Nikhil et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Rådet for videnskabelig og industriel forskning og Ministeriet for Human Resources og Udvikling (MHRD), Indiens regering som forskningsstipendier til kN, og projektet assistentopholdet til PR hhv. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Yderligere PR vil også gerne til tanken andre finansieringskilder, Institut for Bioteknologi (BT /PR14836 /AAQ /01/455/2010) og Institut for Videnskab og Teknologi (SR /SO /HS-39/2009) for deres økonomiske støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

trods betydelige bestræbelser mod ablation af kræft, prostatakræft (PCA) er den hyppigst diagnosticerede kræft og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt mænd i USA, med en anslået 217,730 nye tilfælde og 32.050 dødsfald i 2010 [1]. Selvom ætiologien af ​​PCa forbliver ukendt, forhøjede niveauer af steroidhormoner, såsom androgener og østrogener samt vækstfaktorer, såsom insulin-lignende vækstfaktor 1, anses for at være vigtige risikofaktorer [2] – [4]. Androgen ablation terapi har en første reaktion, men de fleste patienter med fremskreden PCa tiden udvikle resistens over for denne terapi og udvikler sig til hormon-refraktær prostatacancer (HRPC), for hvilke der ikke er nogen helbredende terapi [5]. Mangel på effektive behandlingsmuligheder for forvaltningen af ​​HRPC forstærke behovet for at udvikle nye forbindelser, der virker enkeltvis eller i kombination.

Androgen og AR-funktioner spiller en afgørende rolle i carcinogenese og progression af PCa, såvel som i normal prostata udvikling [6], [7]. Virkningerne af androgener, såsom testosteron og dihydrotestosteron (DHT) medieres af AR, som er medlem af den nukleare receptor superfamilien af ​​ligand-afhængige transkriptionsfaktorer [8]. Foruden androgen, kan AR-aktivitet også modificeres ved molekyler i andre celletyper signalveje. Opregulering af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) og efterfølgende stigninger i ekstracellulær-kinase (ERK) og Akt signalering, er impliceret i PCa progression [9]. Akt regulerer AR signalvejen ved phosphorylering og /eller transkriptionel regulering af AR. Akt phosphorylerer AR på serinerne 210/213 og 790/791 og endelig transaktiverer dets aktivitet. En tidligere undersøgelse viste, at inhibering af Akt pathway ophæver HER-2 /neu-induceret AR signaleringsaktivitet [10]. Disse resultater antyder, at Akt er en aktivator af AR kræves til androgen-uafhængig overlevelse og vækst af PCA-celler. Forskning har vist, at inhibering af en eller begge af disse veje har en mere dybtgående virkning på tumorceller udvikling og død, hvilket gør dem attraktive multikombinerbare mål i PCa terapi. Derfor AR, Akt, og ERK kunne være potentielle mål for behandling af PSA.

Bioaktive fødevarer komponenter, især i stigende grad vurderet som potentielle PCA kemoforebyggende midler på grund af deres formodede sikkerhed [11]. En sådan forbindelse er pterostilbene (PTER), et naturligt forekommende dimethylether analog af resveratrol (RESV), som har højere oral biotilgængelighed og forøget styrke i sammenligning med RESV [12]. Flere undersøgelser har vist, at PTER kan inhibere væksten af ​​forskellige hormon-responsive cancere, såsom brystcancer [13] – [15] og PCa [14], [16] – [18] både

in vitro

in vivo

. Selvom de anti-metastatisk, anti-tumor og anti-leukæmiske egenskaber PTER er blevet godt etableret i brystcancer, der er begrænsede rapporter om virkningen af ​​PTER i proliferationen af ​​PCA celler induceret af steroidhormoner [16]. Tilsvarende er isothiocyanater (ITC) naturligt forekommende, lavmolekylære organiske forbindelser med den almene formel R-NCS [19]. Disse kemobeskyttende midler findes i en lang række forskellige korsblomstrede grøntsager som broccoli, blomkål, kål, rosenkål, grønkål og [20]. Epidemiologiske undersøgelser har antydet, at øget indtagelse af korsblomstrede grøntsager kan være beskyttende mod PCa risiko [21] – [24]. Men på trods af overbevisende epidemiologisk sammenhæng, aktiviteten af ​​ITC mod PCA celler er endnu ikke systematisk vurderet. Da de individuelle roller PTER og ITC allerede har været impliceret i PCa, bestemt vi at udvikle et konjugat af PTER-ITC i søgning af potente anti-cancer-molekyler. Konjugatet blev fremstillet ved at tilføje ITC indeholdende thiosemicarbazid farmakofor med PTER rygrad som tidligere beskrevet [25]. Overraskende konjugatmolekylet når den afprøves in vitro, udviste effektiv cytotoksicitet i bred vifte af cancercellelinier med forholdsvis lavere dosis sammenlignet med dets oprindelige forbindelse dvs. PTER [25]. Endvidere vores undersøgelse indikerede, at anti-proliferative aktivitet af konjugat mod humane brystcancercellelinier skyldtes dets evne til at standse celler i G2 /M-fase og aktivering af caspase, og også korreleret med blokaden af ​​Akt og ERK signalveje [ ,,,0],25].

i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi detaljeret effekt og molekylære virkningsmekanismer af PTER-ITC-konjugat ved hjælp androgen-afhængige (LNCaP) og androgen-uafhængig (PC-3) PCA celler. Endvidere sammenlignede vi også effekten af ​​PTER-ITC konjugat med stamforbindelsen med PTER dvs. RESV. Vores undersøgelse har således påvist den nyudviklede konjugat at være en potent AR-inhibitor, som stærkt dæmper væksten af ​​PCA-celler in vitro ved at modulere AR ekspression samt reguleringen af ​​cellecyklusprogression og apoptose.

Materialer og metoder

reagenser

Alle cellekulturreagenser blev opnået fra GIBCO (Invitrogen, CA, USA), med mindre andet er anført. Penicillin, streptomycin, MTT (3- (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) 2,5diphenyl-2H-tetrazoliumbromide), cellekulturkvalitet dimethylsulfoxid (DMSO), agarose og alle kemikalier af analysekvalitet var fra HiMedia (Mumbai, Indien ). Reverse transcription- polymerasekædereaktion (RT-PCR) kits var fra Genei (Bangalore, Indien). RESV, PTER, DHT, Akt1 /2 kinaseinhibitor, PD98059 (ERK-inhibitor), Z-VAD-FMK (pan caspaseinhibitor), Z-LEHD-FMK (caspase-9 specifik inhibitor), Z-IETD-FMK (caspase- 8 specifik inhibitor) og BCA protein estimering kits var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Polyfect transfektionsreagens blev indkøbt fra QIAGEN (Valencia, CA, USA). Pifithrin-α (p53-inhibitor), antistoffer for caspase-3, Bax, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, SRC-1, GRIP-1, N-RU, β-actin og små interfererende RNA’er (siRNA’er) mod Akt (sc-43609), ERK (sc-35.335) og kontrol (sc-37007; negativ kontrol for forsøg med målrettet siRNA transfektion, hver består af en kodet sekvens, der ikke vil føre til den specifikke nedbrydning af enhver kendt cellulært mRNA) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). PTER-ITC-konjugat blev syntetiseret i asymmetrisk syntese laboratorium Kemisk Institut, Indian Institute of Technology Roorkee, Indien, i henhold til den tidligere beskrevne [25] og herefter udpeget som konjugat i manuskriptet (fig. 1A) procedure.

(A) struktur af Resveratrol, Pterostilbene og Pterostilbene-isothiocyanat konjugat. (B) Effekten af ​​konjugat på apoptose af PC-3 og LNCaP celler som påvist ved en repræsentativ FACS-analyse ved hjælp af Annexin V som markør. (C) Histogrammet viser data for FACS-analyse, hvor resultaterne er gennemsnittet ± SEM af tre uafhængige forsøg. # Og * repræsenterer statistisk signifikant forskel med hensyn til deres specifikke kontroller (vehikelbehandlede) for celler i tidlig og sen apoptose henholdsvis

p

. 0,05

cellelinjer og kultur

prostata karcinom cellelinjer (AR-positive LNCaP og AR-negative PC-3) og noncancer cellelinjer (CHO og COS-1) blev opnået fra National Center for Cell Science (NCC’erne), Pune, Indien. PC-3, blev CHO og COS-1-celler opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), mens LNCaP-celler blev holdt i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (varmeinaktiveret) under 5% CO

2 ved 37 ° C. Alle forsøgene blev udført under anvendelse LNCaP, PC-3, CHO og COS-1-celler fra passage under 29, 34, 20 og 30 hhv. Cellerne blev vasket ordentligt inden der skiftes mediet til steroid-free komplette medier forud for hver behandling med forbindelserne, medmindre andet er angivet.

cytotoksicitetsassays

MTT-assay blev udført som beskrevet tidligere [ ,,,0],25]. Kort fortalt blev 5 x 103 celler i 200 pi medium podet i 96-brønds plader (Griener, Tyskland

).

Efter 24 timer blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer (0,1, 1, 10, 100 og 1000 uM) af RESV, PTER og konjugat. Kontrolsekvenserne celler blev behandlet med 0,1% DMSO (vehikelkontrol). De dyrkede celler blev analyseret efter 24 timer ved tilsætning af 20 pi af 5 mg /ml MTT efterfulgt af inkubering ved 37 ° C i 4 timer. MTT holdige medier blev derefter aspireret, og 200 pi DMSO (Himedia, Mumbai, Indien) blev tilsat for at opløse de formazone krystaller. Den optiske densitet (OD) blev målt ved 570 nm ved anvendelse af ELISA-pladelæser (Fluostar Optima, BMG Labtech, Tyskland). Den procentvise inhibering blev beregnet som:

Dosisresponskurven og IC

50 værdier blev opnået ved ikke-lineær regressionsanalyse [ikke-lineær regression (sigmoidal dosisrespons med variabel hældning)] under anvendelse af Graph Pad Prism, version, 5,02 software (Graph Pad software Inc., CA, USA).

cellecyklusfordeling og Apoptose Assay ved flowcytometri

cellecyklusfordeling og Annexin V /propidiumiodid (PI) positive celler var analyseret under anvendelse af flowcytometri. Kort fortalt først cellerne blev podet og behandlet med 0, 10, 20 og 40 uM konjugat i komplet medium i 24 timer. Dette blev efterfulgt af trypsinbehandling og fiksering i 70% ethanol, og endelig vask med PBS. Efterfølgende blev cellerne behandlet med RNase A (50 ug /ml), farvet med PI (50 pg /ml) og inkuberet i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur og analyseret ved flowcytometri for cellecyklusfordeling. For apoptose blev konjugat-behandlede celler farvet med Alexa-Fluor 488-konjugeret Annexin-V ved hjælp af Vybrant-Apoptose Assay Kit fra Invitrogen (USA) i henhold til fabrikantens protokol. De farvede celler blev derefter analyseret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), og dataene blev standardiseret under anvendelse af Cell Quest 3.3 software.

Caspase Assay

caspase-aktivitet blev bestemt under anvendelse ApoTarget caspase kolorimetrisk proteaseanalyse sampler kit (KHZ1001; Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev både PSA-celler behandlet med stigende doser af konjugat og RESV i 24 timer. Cellerne blev derefter opsamlet, vasket i PBS, og lyseret i 50 pi lysepuffer på is i 10 min. Efter centrifugering blev supernatanten indeholdende 150 ug proteiner inkuberet med 200 pM af caspase-3 (Ac-DEVD-pNA), caspase-8 (Ac-IETD-pNA) og caspase-9 (Ac-LEHD-pNA) substrater henholdsvis reaktionspuffer ved 37 ° C i 1 time i 96-brønds fladbundet plade. Niveauer af frigivet pNA blev derefter målt ved 405 nm bølgelængde med ELISA-pladelæser (Fluostar optima, BMG Labtech, Tyskland). Fold-stigning i caspase-3, -8 og -9 aktiviteter blev bestemt ved direkte sammenligning til niveauet af un-induceret kontrol. For caspaseinhibitoren assayet blev celler forbehandlet med en syntetisk pan-caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK), caspase-8 inhibitor (Z-IETD-FMK) og caspase-9-inhibitor (Z-LEHD-FMK) i 1 time før tilsætningen af ​​konjugat og celledød blev analyseret ved MTT-assay som beskrevet tidligere.

RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra de behandlede celler ved anvendelse RNA-isolering kit opnået fra Genei ( Bangalore, Indien). De ekstraherede RNA-prøver blev derefter kvantificeret og samme mængde af de enkelte behandlinger blev transskriberet ved hjælp af en RT – PCR kit fra Genei (Bangalore, Indien) i overensstemmelse med producentens anvisninger. PCR blev udført ved denaturering ved 94 ° C i 60 s, annealing ved forskellige temperaturer (afhængig af primerpar anvendes) i 45 s og ekstension ved 72 ° C i 2 minutter efterfulgt af antallet af cykler til amplifikation. Primere til Bcl-2, Bcl-XL, Bax, AR og β-Actin blev udformet ved hjælp af Primer 3 software og standardiseret i laboratoriet. PCR-produkterne blev derefter separeret på 2% agarosegel og visualiseret i en gel dokumentationssystem (Bio Rad, USA). Intensiteten af ​​båndene på agarosegeler blev analyseret under anvendelse ImageJ 1,43 software (NIH, USA) og normaliseres med hensyn til p-actin PCR-produkter. Hver af RT-PCR blev udført tre gange. Tabel S1 viser primersekvensen, produktstørrelse, annealingstemperatur, og antallet af cykler, der anvendes til alle primere.

immunfluorescensfarvning

I immunfluorescensfarvning, LNCaP-celler blev vasket med PBS, fikseret i 3 % paraformaldehyd, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 og til slut blokeret med 1% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter inkuberet med AR kanin polyklonalt antistof fortyndet 1:200 i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev cellerne vasket med PBS og inkuberet med FITC-mærket anti-kanin sekundært antistof fortyndet 1:1000 i blokeringsbuffer i 30 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter observeret under et fluorescensmikroskop (Zeiss, Axiovert 25, Tyskland).

Co-immunfældning og Western blot-analyse

LNCaP-celler blev udpladet i 100 mm dyrkningsskåle og behandlet med konjugat eller DHT i 24 timer. De helcellelysater blev fremstillet som beskrevet tidligere [26] i immunpræcipitering (IP) indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA og 1% Triton X-100. Protein-portioner af 500 ug blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C under anvendelse af 2 ug antistof rettet mod AR. Protein A-CI agaroseperler blev derefter tilsat og yderligere inkuberet i 6 timer ved 4 ° C. Immunopræcipitaterne blev vasket fire gange med IP puffer og immunkomplekserne blev udvundet ved kogning i SDS-prøvebuffer. Endelig western blot blev udført ved anvendelse af anti-AR, anti-SRC-1 og anti-GRIP-1-antistoffer (Santa Cruz, CA, USA). Til Western blot-analyse blev cellelysaterne fremstillet efter høst dem i lysepuffer. Ca. 40 ug totalt protein blev elektroforesebehandlet med 12% SDS-PAGE, og western blotting blev udført under anvendelse af en standardprotokol. I korte træk blev de analyserede proteiner overført til nylonmembraner. Blottene blev derefter blokeret med TBST-buffer (20 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM natriumchlorid, 0,05% Tween-20) indeholdende 5% skummetmælkspulver. De blev derefter vasket med TBST-buffer og inkuberet natten over ved 4 ° C med den samme buffer indeholdende passende mængder af primære antistoffer: caspase-3, Bax, Bcl-2, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK, AR, SRC -1, GRIP-1 (1:500) og β-actin (1:1000). Blottene blev derefter vasket og inkuberet med anti-kanin sekundært antistof (1:20,000) konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP). Farveudvikling blev udført i mørke ved anvendelse af et ECL-kit (Amersham, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). De udviklede blots blev udsat for densitometrisk analyse af ImageJ 1,43 software (NIH, USA) ved hjælp af β-actin som intern kontrol.

transfektion

De LNCaP celler blev dyrket og forbigående transficeret med pMMTV-neomycin -luciferase plasmid (300 ng /105 celler) i RPMI-medium suppleret med 10% FBS ved hjælp polyfect transfektionsreagens (Qiagen, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Derefter 24 timer efter transfektion, cellekulturmediet blev ændret med medier indeholdende 5% trækul-strippet FBS at reducere de kontaminerende steroider fra serummet og inkuberet i yderligere dag før initiering behandlingerne. I tilfælde af PC-3-celler, blev de tilsvarende transficeret, men udover pMMTV-neomycin-luciferase-konstruktion, blev de også transficeret med pSG5-Har-puro plasmid (fuld længde Här i pSG5-ekspressionsvektoren) i forholdet 5: 1 som anført ovenfor. For forsøg med co-regulatorer, 50 ng co-aktivator plasmider (25 ng hver af GRIP-1 og SRC-1) sammen med pMMTV-neo-luc (250 ng) blev transficeret til LNCaP celler. For at evaluere transfektionseffektiviteten, 500 ng /105 celler af SV40-promotoren-Renilla luciferase (pRL-SV40) vektoren (Promega Madison, USA) blev co-transficeret som intern kontrol. Cellerne blev derefter behandlet med enten vehikel eller forskellige koncentrationer (1-40 uM) konjugat og /eller 10 nM DHT i 24 timer, og luciferaseaktiviteten blev målt ifølge instruktionerne i kittet (Promega, Madison, USA ). Hvert eksperimentelt punkt blev udført tre gange og varierede med mindre end 10%. Værdierne af luciferase for hver lysater blev normaliseret til den Renilla luciferaseaktivitet.

I localization undersøgelser blev pEGFP-AR plasmid transficeres til LNCaP og PC-3-celler (300 ng /105 celler). Cellerne blev derefter inkuberet med 10 nM DHT med /uden 10 og 20 uM konjugat og monitoreres regelmæssigt indtil 12 timer under fluorescensmikroskop (Zeiss, Axiovert 25, Tyskland).

siRNA transfektion

siRNA’er mod human Akt og ERK og kontrol siRNA blev indkøbt kommercielt fra Santa Cruz Biotechnology (USA). LNCaP og PC-3 PCA-celler blev transficeret med siRNA’er (ved en slutkoncentration på 100 nM) ved anvendelse polyfect transfektionsreagens (Qiagen, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Efter 24 timers transfektion blev cellerne vasket ordentligt og erstattet med frisk medium. Cellerne blev derefter behandlet med 20 pM konjugat i 24 timer, og endelig proteinlysater blev fremstillet ved afslutningen af ​​behandlingen. Niveauerne af p-Akt, p-ERK og spaltede caspase-3 udtryk blev påvist ved Western blot analyse.

Statistical Analysis

Data er udtrykt som middelværdi ± SEM og statistisk vurderet ved anvendelse en- vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni

post hoc

test med Graph Pad Prism 5,04 software (Graph Pad software, San Diego, CA, USA). En

s

-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

Hæmning af Cell Proliferation af konjugat

LNCaP (AR positiv ) og PC-3 (AR negative) celler blev dyrket med forskellige koncentrationer af RESV, PTER og konjugat i 24 timer i komplet RPMI og DMEM-medium hhv. Vores data viser, at behandling af LNCaP og PC-3-PCA-celler med RESV, PTER og konjugat resulterede i en dosisafhængig inhibering af celleproliferation. Som vist i tabel 1, i tilfælde af LNCaP-celler, konjugatet resulterede i næsten 50% reduktion i antallet af levende celler ved 40 ± 1,12 uM, mens det var omkring 66,4 ± 1,39 og 82,2 ± 2,19 uM i tilfælde af PTER og RESV-behandlede celler henholdsvis efter 24 timers behandling. Tilsvarende i tilfælde af PC-3-celler IC

50 værdi konjugat, PTER og RESV viste sig at være 45 ± 1,50, 75 ± 2,55 og 95,0 ± 1,13 uM henholdsvis efter 24 timers behandling (tabel 1). Endvidere når det afprøves i noncancer cellelinier, såsom CHO og COS-1 blev alle forbindelserne sig at have IC

50 værdier over 100 uM koncentration. både cancercellelinier blev således fundet at være mere følsomme over for konjugat behandling sammenlignet med PTER og RESV som vist ved den nedre IC

50 værdier i dem alle. Yderligere, vores Resultatet viste, at PTER-ITC konjugat er et potent cytotoksisk middel i både AR positive og Ar negative cellelinier end i marginalt højere niveau i det tidligere sammenlignet med sidstnævnte.

Differential følsomhed PC-3 og LNCaP celler til konjugat induceret apoptose

i milieu af MTT analyseresultater, udvidet vi vores undersøgelse for at undersøge, om PCA celler undergår apoptose efter konjugat behandling ved hjælp af Annexin-V /PI dobbelt farvning assay og flow cytometrianalyse. Efter PCA-celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af konjugat blev cellerne farvet med Alexa Fluor 488-konjugeret Annexin-V og PI, der kan vurdere de tidlige og sene apoptotiske cellepopulationer. Som vist i fig. 1B, konjugatet frembragte en dosisafhængig stigning i den apoptotiske cellepopulation i både PSA-celler undersøgt. Behandling af PC-3-celler med stigende doser af konjugat i 24 timer resulterede i en stigning i tidlige apoptotiske celler fra ca. 44% til 68% og sene apoptotiske celler fra 12% til 16% ved 20 og 40 pM koncentrationer, sammenlignet med vehikel behandlede grupper (fig. 1B øvre panel). Da PC-3 celler mangler et funktionelt p53-protein, var det af interesse at bestemme, om tilstedeværelsen af ​​vildtype p53 påvirker cellulær følsomhed for celledøden forårsaget af konjugat, fordi p53 er kendt for at regulere apoptose i forskellige stimuli. Vi behandlet dette spørgsmål ved at bestemme følsomheden af ​​LNCaP-celler (vildtype p53) mod konjugat-induceret apoptose ved FACS-analyse. Behandling af LNCaP-celler i 24 timer med stigende doser af konjugat resulterede i en gradvis forøgelse af tidlige apoptotiske celler (Annexin V eneste positive) fra 52% til 72% ved 20 og 40 uM (fig. 1B, nedre panel). De sene apoptotiske celler (Annexin V og PI positive) også steg betydeligt fra 8% til 18,5% (fig. 1B, nedre panel) sammenlignet med kun 0,23% af tidlige apoptotiske celler og næsten ubetydelig antal sene apoptotiske celler i den negative kontrol gruppe behandlet med 0,1% DMSO. Histogrammet i højre panel (fig. 1C) angiver statistisk analyse af tre lignende uafhængige eksperimenter for begge cellelinier. Interessant, det samlede antal apoptotiske celler var statistisk ikke-signifikant (

s

0,05) mellem LNCaP og PC-3 celler, når testet med forskellige koncentrationer af konjugat, tyder på, at p53 protein blev ikke involveret i reguleringen konjugat-induceret apoptose af PCA celler.

konjugat induceret Stage specifik Anholdelse af prostatacancerceller

på baggrund af vækst og DNA syntese hæmmende reaktioner af konjugat i PCA celler, vi næste undersøgt dens virkning på cellecyklusprogression. Som vist i fig. 2A og 2B, behandling af PC-3 og LNCaP-celler med stigende doser af konjugat i 24 timer resulterede i en dosisafhængig forøgelse i akkumulering af celler i G2 /M-fase med ledsagende fald i G1-fase celler. I tilfælde af PC-3-celler, den observeret ved 40 uM konjugat virkning var den største med ca. 50% af cellerne bliver standset i G2 /M-fase, sammenlignet med kun 22% i kontrolgruppen (Fig. 2A). En lignende tendens i G2 /M-fase standsning blev også vist i LNCaP-celler (35% i behandlede celler mod 11% i kontrolcellerne), selv om det samlede population af celler ikke kunne nå et højt niveau på 50% som observeret i PC-3 celler. Som vist i fig. 2B, konjugatet behandling resulterede i en ophobning af 16-35% af celler i G2 /M-fase med stigende doser af konjugat. Således konjugat-medieret vækstinhibering af både PC-3 og LNCaP-celler korrelerede med G2 /M-fase-cellecyklusstandsnings.

cellecyklusfordeling af (A) PC-3 og (B) LNCaP-celler efter behandling med varierende doser af konjugat. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. * Repræsenterer statistisk signifikant forskel i forhold til køretøjets behandlet PC-3 og LNCaP celler henholdsvis svarer til hver fase af cellecyklus på

s

0,05. (C) Virkningerne af varierende doser af konjugat (venstre panel) og resveratrol (højre panel) på caspase-8, -9 og -3 aktiviteter i PC-3 og (D) LNCaP-celler. Resultaterne er middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg. * Repræsenterer statistisk signifikant forskel med hensyn til at kontrollere celler for testet på respektive caspaser

s

0,05. (E) Virkningen af ​​caspaseinhibitorer på konjugat-induceret celledød i PC-3 og (F) LNCaP-celler. Cellerne blev forbehandlet med 20 uM respektive caspaseinhibitorer: Z-LEHDFMK (caspase-9-inhibitor); Z-IETDFMK (caspase-8 inhibitor); og Z-VAD-FMK (generel caspaseinhibitor) i 1 time før tilsætning af 20 uM konjugat. Celledød blev målt 24 timer efter konjugat behandling med MTT-assayet. Dataene er gennemsnittet ± SEM af tre uafhængige forsøg. * Og # repræsenterer statistisk signifikant forskel i forhold til kontrol (vehikel) og konjugat behandlede celler henholdsvis for hver cellelinjer på

s

0,05. ns, ikke-signifikant.

Konjugat Aktiverer Caspase-3 via Caspase-9

Aktivering af både ydre og indre caspase pathways allerede er kendt for at være de vigtigste mekanismer apoptotisk celle dødsfald i de fleste cellulære systemer. For bedre at forstå de underliggende cellulære veje for konjugat-induceret død PCA-celler, blev en mulig rolle af caspase i denne proces undersøgt ved at måle aktiviteterne i caspase-8, -9, og -3 i disse tumorceller. Mens caspase-8 og caspase-9 er væsentlige proteaser ydre og indre apoptotiske veje henholdsvis caspase-3 virker som nedstrømseffektorer af begge disse veje. Behandling af PC-3-celler med stigende doser (10, 20 og 40 uM) af konjugat og RESV i 24 timer forårsagede en dosisafhængig forøgelse i caspase-9 og caspase-3 enzymaktiviteter. Denne stigning var forholdsvis højere i tilfælde af konjugat behandlede celler sammenlignet med celler behandlet med samme dosis af RESV (fig. 2C). For caspase-8, selv om der var marginal forøgelse af dets aktivitet ved høj dosis af RESV behandling blev ingen sådan induktion iagttages i tilfælde af konjugat behandling (fig. 2C). Tværtimod opnået i tilfælde af LNCaP-celler Resultaterne viste en signifikant stigning i alle de tre caspase dvs. caspase-8, -9 og -3 på konjugat behandling indikerer involvering af både intrinsic (gennem caspase-9) og ydre (gennem caspase-8) veje i apoptotisk proces ved konjugat i denne cellelinie (fig. 2D, venstre panel). Desuden er vores resultater viste, at aktivering af caspase-9 sker før den for caspase-8 (ved lavere dosis), hvilket tyder på, at mitokondrielle pathway kan være afgørende for konjugat-induceret apoptose. På den anden side viste RESV behandling også signifikant stigning i caspase -9 og -3 aktiviteter, men i mindre grad i forhold til konjugatet (Fig 2D, højre panel). (

s Restaurant 0,05). ovennævnte data klart antyder således, at konjugat induceret apoptose i PC-3-celler medieres via indre vej, mens både de indre og eksterne forløb bidrager til apoptose i LNCaP-celler. Også konjugatet viste sig at være mere effektiv end RESV i inducere apoptose i både PSA testede cellelinjer.

Desuden at belyse pathway, som var fremherskende for konjugat-induceret apoptose, farmakologiske inhibitorer af specifikke caspaser blev anvendt at sonden hvis de kunne beskytte celler mod at undergå apoptose. Som vist i fig. 2E og 2F, Z-VAD-FMK, en generel caspaseinhibitor, viste signifikant hæmning af celledød i både PC-3 og LNCaP-celler antyder, at apoptose er den dominerende form for celledød induceret af konjugatet. I tilfælde af PC-3-celler, Z-LEHD-FMK, en specifik inhibitor af caspase-9 også inhiberede konjugat induceret celledød ved 73%, medens Z-IETD-FMK, en specifik inhibitor af caspase-8, var fuldstændig ineffektiv til blokering konjugat celledød (

s

0,05) (. figur 2E). Endvidere i tilfælde af LNCaP-celler, inhibitoren af ​​caspase-9 næsten fuldstændigt blokeret konjugatet apoptose mens inhibitor af caspase-8 kun delvist inhiberede den (fig. 2F). Konjugatet induceret celledød blev mest fremtrædende inhiberes, når cellerne blev forbehandlet med både caspase-8 og caspase-9 inhibitorer. Tilsammen udgør disse data styrker yderligere vores fund, at konjugat induceret apoptose involverer caspase -9 /-8 /-3 og caspase-9 /-3 veje i LNCaP og PC-3 celler henholdsvis.

Bcl-2 og Bax er involveret i apoptose af konjugat

Bcl-2 danner en heterodimer kompleks med apoptotisk Bax protein, og dermed neutralisere dens apoptotiske effekt. Derfor er forholdet Bax /Bcl2 ofte betragtes som en afgørende faktor celledød eller overlevelse. I den foreliggende undersøgelse, behandling af celler med konjugatet resulterede i et fald i ekspressionen af ​​

Bcl-2

og

Bd-XL

med en samtidig stigning i

Bax

gen i både LNCaP og PC-3-celler (fig. 3). Dette resulterede i en betydelig stigning i Bax /Bcl2 ratio, som generelt favoriserer apoptose. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig. [16].