PLoS ONE: ALK-omarrangeret lungekræft i kinesisk: en omfattende vurdering af Clinicopathology, IHC, FISH og RT-PCR

Abstrakt

Omkring 3-7% af ikke-småcellet lungekræft havnen en anaplastisk lymfom kinase (

ALK

) gen-fusion, der udgør en ny molekylær undertype af lungekræft, der reagerer på crizotinib, en

ALK

inhibitor. Selvom tidligere undersøgelser har evalueret

ALK

-rearranged lungekræft, den omfattende analyse af lungekræft i kinesisk har ikke godt vurderet. Heri identificerede vi 44 tilfælde af

ALK

-rearranged prøver ved fluorescerende in situ hybridisering (FISH), immunhistokemi (IHC) og revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR) i et stort antal kirurgisk resektion lungecancere. Alle 44

ALK

-rearranged lungekræft var adenokarcinomer, med 2 tilfælde at have yderligere fokale skællede komponenter. Målet var at analysere de klinisk-patologiske træk af

ALK

-rearranged lunge adenokarcinomer. Vores data viser, at en cribriform struktur, fremtrædende ekstracellulære slim og enhver form for slim celle mønster kan være enten følsomme eller specifikke til at forudsige en

ALK

omlejring. Vi brugte FISH som standard påvisningsmetode. Vi sammenlignede

ALK

omlægning nøjagtighed FISH, RT-PCR og IHC. RT-PCR kunne definere både

ALK

fusion partner og fusion variant, men syntes ikke registrere alle translokationer involverer

ALK

gen. Det er bemærkelsesværdigt, at IHC under anvendelse af D5F3 antistof (Cell Signaling Technology) viste højere følsomhed og specificitet end ALK1 antistof (Dako). , Konkluderer derfor vi, at IHC forbliver en omkostningseffektiv og effektiv teknik til diagnosticering

ALK

omrokeringer og at D5F3 kan være den optimale screening antistof i klinisk praksis

Henvisning:. Li Y, Pan Y Wang R, Sun Y, Hu H, Shen X, et al. (2013)

ALK

-Rearranged lungekræft i kinesisk: en omfattende vurdering af Clinicopathology, IHC, FISH og RT-PCR. PLoS ONE 8 (7): e69016. doi: 10,1371 /journal.pone.0069016

Redaktør: Giuseppe Viglietto, UNIVERSITY Magna Graecia, Italien

Modtaget: Februar 15, 2013; Accepteret: 11 Juni 2013; Udgivet: 26 Jul 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Natural Science Foundation of China (81101761, 81172218); Key Construction Program for National “985” Projekt (985-YFX0102) URL: https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft stadig den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i verden. Den kliniske betydning af den molekylære fænotype af lungekræft ligger hovedsageligt i dets terapeutiske implikationer, da forskellige undertyper kan reagere på forskellige målgrupper behandlinger. Et fusionsgen, der forbinder pighuder mikrotubulus-associeret protein-like 4 (

EML4

) genet med den anaplastisk lymfom kinase (

ALK

) genet blev fundet i en delmængde af ikke-småcellet lungecarcinomer (NSCLCs) i 2007 [1]. Denne fusion opstod på grund af kromosomal inversion eller translokation på kromosom 2p, hvilket resulterer i dannelsen af ​​

EML4-ALK

fusion gen. På trods af den relativt lave frekvens af

EML4-ALK

fusion,

ALK

-rearranged lungekræft er en unik molekylær undergruppe med en høj følsomhed til ALK-hæmmere, og er gensidigt udelukkende fra andre vel- kendte onkogene mutationer involverer EGFR eller KRAS [2] – [5]. For bedre at forstå

ALK

-rearranged lungekræft, er det vigtigt at karakterisere deres clinicopathologic funktioner. Resultaterne af detaljerede clinicopathologic analyser har varieret. I vores undersøgelse blev 572 lunge adenokarcinomer opdelt i

ALK

-rearranged, fælles driver mutation, og pan-negative grupper efter mutationsstatus. Vi sammenlignede klinisk-patologiske funktioner i

ALK

-positiv gruppe med fælles driver mutation, og med pan-negative gruppe, der søger at vurdere, om der var karakteristiske klinisk-patologiske træk forbundet med

ALK

omordning kohorte.

ALK

-rearranged lungekræft kan identificeres ved IHC, FISH, eller RT-PCR med hver metode har fordele og ulemper til screening. Aktuelle kliniske forsøg med crizotinib brug fisk som den diagnostiske test [6]. Men FISH kræver specialiserede tekniske ressourcer og ekspertise, og signalerne falme hurtigt over tid. Endvidere omkostningerne ved FISH-assayet begrænser anvendelsen heraf til screening i klinisk praksis. RT-PCR-kobling direkte sekventering er blevet anvendt til at identificere kendte fusion varianter, men kan gå glip ukendte varianter. IHC er relativt billig, hurtigere og udføres rutinemæssigt på formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) væv. Resultaterne af ALK IHC test i lungekræft er imidlertid stadig utilfreds på grund af relativt lav følsomhed eller specificitet, og fravær af en ideel antistof. Nu, den yderst følsomme ALK monoklonalt antistof, kan D5F3 genkender epitoper inden for ALK-protein af alle kendte fusionerne. IHC er let tilgængelige i rutinemæssig patologi praksis og testen koster kun en tyvendedel af FISH-test i Kina. Derfor er denne IHC analyse giver løfte om at være omkostningseffektive og en hurtig screeningsmetode [7]. Men den nøjagtighed og følsomhed af D5F3 antistof er ikke blevet grundigt undersøgt. Vi sammenlignede konkordans blandt IHC, FISH og RT-PCR til at bestemme den optimale screeningsmetode. FISH er den mest nøjagtige metode og RT-PCR kan definere fleste ALK fusion varianter, men kan ikke registrere alle ALK translokationer. Vi fandt, at IHC med D5F3 monoklonalt antistof viste både høj sensitivitet og specificitet (91% og 98%, henholdsvis), og dermed kan være rutinemæssigt anvendes i klinisk praksis.

Materialer og metoder

Case Selection

Der blev opnået i alt 572 frosne lunge adenocarcinom vævsprøver og deres tilsvarende paraffinindstøbte tumorvæv ved Fudan University Shanghai Cancer Center fra oktober 2007 til jun 2011, med skriftlige informerede samtykke fra alle patienter. Al forskning med mennesket som deltagere i denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Shanghai Cancer Hospital (shanghai kræft center), Fudan University, Kina. Vi har tidligere vist, at 90% af lunge adenokarcinomer fra aldrig-rygere nærede gensidigt udelukkende onkogene mutationer i kun fire gener (

EGFR

,

KRAS

,

HER2

og ALK) [ ,,,0],8]. I aktuelle undersøgelse, havde vi medtaget 527 lunge adenokarcinomer uanset rygning status foruden de 45 tumorer (41

EGFR

, 3

EML4-ALK

fusioner og en

KRAS

) tidligere offentliggjort [8]. Der var 411 af 572 prøver, som nærede kendte mutationer, herunder 361

EGFR

, 40

KRAS

og 10

BRAF

tumorer, mens 161 af 572 prøver ikke harbor nogen af de ovennævnte mutationer. Til påvisning af

EML4-ALK

fusioner blev primere designet til at amplificere alle kendte fusion varianter, anvendelse af cDNA, som tidligere beskrevet [9]. Ifølge mutationsstatus blev 572 lunge-adenokarcinomer inddelt i tre grupper. Der var 44 sager identificeret som ALK omlægning af FISH og grupperet som

ALK

-positiv. Der var 411 sager, som nærede velkendte onkogene mutationer (361

EGFR

, 40

KRAS

og 10

BRAF

) identificeret ved RT-PCR og grupperet som fælles drev mutationer . Der var 117 sager, som ikke huser nogen af ​​ovennævnte mutation og blev derfor grupperet som pan-negative. Klinisk-patologisk data indsamlet til analyser omfattede alder, køn, tumorstørrelse, rygevaner, pleural invasion, lymfeknude status og patologisk stadium. For hvert tilfælde blev flere dias, der svarer til hele vævssnit gennemgået af to patologer og klassificeret i henhold til den aktuelle IASLC /ATS /ERS klassifikationen [10]. Alle tumorer blev gradueret af mønster-baseret klassificeringssystem af Sica foreslået i klasse I, klasse II, eller klasse III. Grade I, en lepidic fremherskende mønster; Grade II, en acinære, papillær eller mucinøs fremherskende mønster; og grad III, en solid, mikropapillær eller cribriform mønster [11]. Sager med forskelle mellem korrekturlæsere revurderes og en konsensus fortolkning blev afsagt.

RT-PCR og mutationsmønstre Analyser

Der var 572 tilfælde udsat for RT-PCR. Frosne væv blev groft dissekeret i TRIZOL (Invitrogen Inc.) til RNA ekstraktion standard protokoller. Total RNA-prøver blev revers transkriberet til enkeltstrenget cDNA ved anvendelse RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, EU). Mutationsstatus af

EGFR

(exon 18-22),

KRAS

(exon 2 til 3) og

BRAF

(exon 11 til 15) blev adgang til med standard RT PCR og koblet direkte sekventering. Til påvisning af

EML4-ALK

fusioner blev primere designet til at amplificere alle kendte fusion varianter anvendelse af cDNA, som tidligere beskrevet [8], [9]. Forward primere inkluderet

EML4

E2F (5′-TGATGTTTTGAGGCGTCTTG-3 ‘),

EML4

E13F (5′-AGATCGCCTGTCAGCTCTTG-3′),

EML4

E18F (5 ‘ -TTAGCATTCTTGGGGAATGG-3 ‘), og revers primer

ALK

E20R (5′-TGCCAGCAAAGCAGTAGT TG-3′). Multiplex-PCR-analyse blev udført med KOD plus DNA-polymerase (Toyobo, Osaka, Japan), med følgende program: 94 ° C 5 minutter; 94 ° C 30 sekunder, 60 ° C 30 sekunder, 68 ° C 1 minut, 35 cykler; 68 ° C 10 minutter. PCR-produkter blev direkte sekventeret i fremad og bagud. Alle mutationer blev verificeret ved analyse af en uafhængig PCR isolat. PCR-produkter blev direkte sekventeret i fremad og bagud. Alle mutationer blev verificeret ved analyse af en uafhængig PCR-isolat.

Fluorescens in situ hybridisering

ALK

-rearranged lungekræft er en molekylær undergruppe og gensidigt udelukkende fra andre mutationer sådanne som

EGFR

,

KRAS

BRAF

. De 161 sager, som ikke huser nogen af ​​de ovennævnte mutationer blev udsat for FISH. FISH blev udført på formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) prøver ved hjælp af en kommercielt tilgængelig break-hinanden sonde specifik for

ALK

gen (Vysis LSI ALK Dual Color, break-apart omlejring sonde; Abbott Molecular, Abbott Park, IL) ifølge producentens instruktioner. Sonden hybridiserede at slutte 2p23, på hver side af ALK-genet breakpoint. 5 ‘ALK signal blev mærket med Spectrum Green (grøn), og 3’

ALK

signal blev mærket med Spectrum Orange (orange). 4, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) II blev ansøgt om kerner kontrastfarvning. Signaler for hver probe blev evalueret under mikroskop udstyret med triple-pass filter (DAPI /Grøn /Orange, Abbott Molekylær) og immersionsolie objektiv. FISH-positive sager blev defineret som to positive

ALK

omlejring mønstre. En var break-apart mønster med en fusion signal og to adskilte orange og grønne signaler. Afstanden mellem to adskilte signaler blev estimeret under anvendelse af to gange størrelsen af ​​den største signal størrelse. En anden definition var en isoleret rødt signal mønster med en fusion signal og en rød signal uden en tilsvarende grønt signal. Positive sager blev defineret som mere end 15% break-hinanden signaler eller isolerede rødt signal signaler i 50 tumorceller. FISH-negative sager blev defineret som dem præsentere overlapning af røde og grønne signaler (gullige) i tumorceller, hvilket indikerer, at

ALK

blev ikke omarrangeret.

Immunhistokemi

Der var 161 tilfælde, som ikke huser nogen af ​​ovennævnte mutationer. Disse blev underkastet D5F3, ALK1, P63 og TTF-1 IHC. IHC blev udført på 4 um tykke FFPE sektioner. Objektglas blev afparaffiniseret og forbehandlet med 1 mmol /l EDTA og varme-medieret antigen-genvinding opløsning i en mikrobølgeovn. Yderligere skridt blev udført ved stuetemperatur i en hydratiseret kammer. Objektglas blev præinkuberet i 20% normalt gedeserum. ALK (D5F3) XP Kanin monoklonalt antistof (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Mus monoklonalt antihuman ALK1 (Dako) ved 1:10 fortynding i Dako fortynder, P63 (1:400, 4A4, DAKO), og TTF-1 ( 1:100 blev 8G7G3 /1, DAKO) anvendt. Objektglassene blev derefter vasket i Tris-HCI og påvist med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin EnVision + kit (Dako). Alle objektglas blev modfarvet med hæmatoxylin.

Cytoplasmisk farvning blev betragtet som positivt for D5F3 og ALK1. Dette anerkender epitoper i ALK-protein, der er bevaret i alle kendte ALK fusioner. IHC-farvning blev scoret som følger: 0 (ingen farvning); 1 (svag, cytoplasmatisk farvning); 2 (moderat, glat cytoplasmatisk farvning); 3 (intens, granulær cytoplasmatisk farvning) i mere end 10% af tumorcellerne. Scoring blev udført ved to patologer. Nuklear farvning af tumorceller blev betragtet som positive for TTF-1 og P63.

Statistisk analyse

De sammenslutninger af lunge adenokarcinomer med

ALK

-positiv og fælles driver mutation eller pande ekskluderet gruppe med kliniske karakteristika blev vurderet ved hjælp af Chi-square (for kategoriske data) og Wilcoxon rank-sum (for kontinuerlige data) tests.

s

værdier var baseret på en tosidet hypotese.

s

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Kliniske funktioner i

ALK

-rearranged lungekræft

572 kirurgisk resektion fase i-IV lunge adenocarcinomer patienter var alle fra Kina, deres aldre spænder fra 22 til 84 år, med et gennemsnit på 59 år. Patienterne blev sammensat af 215 mænd og 357 kvinder. Tumordiametre varierede fra 0,5 til 11 cm. Patologiske stadier var jeg i 285 og II-IV i 287 patienter. Ifølge mutationsstatus blev de 572 patienter inddelt i tre grupper, opkaldt

ALK

-positiv gruppe (44 tilfælde), almindelig driver mutation gruppe (411 tilfælde) og pan-negative gruppe (117 tilfælde). I alle

ALK

-positive tilfælde, ingen samtidige aktiverende mutationer i

EGFR

,

KRAS

BRAF

blev opdaget. Vi sammenlignede klinisk-patologiske funktioner i

ALK

-positiv gruppe med fælles driver mutation og pan-negative grupper. Af de sager med kliniske data,

ALK

-positiv lungekræft var forbundet med yngre alder i forhold til den fælles driver mutationen gruppe (

s

= 0,023, tabel 1), men alder i

ALK

-positiv gruppe var ikke signifikant forskel fra den pan-negative gruppe (

s

= 0,83, tabel 1).

ALK

-positiv gruppe var forbundet med ikke-ryger historie sammenlignet med pan-negativ patient (

s

0,001, tabel 1), mens

ALK

– positive gruppe viste ingen betydning forskel i forhold til den fælles driver mutationen gruppe (

s

= 0,828, tabel 1). Selvom

ALK

-rearranged patienter viste en tendens til, sammen med positive lymfeknuder status og højere trin i tidligere rapporter [12], [13], vores

ALK

-positiv gruppe havde ingen betydning forskel fra de andre 2 grupper. Kliniske karakteristika af

ALK

-positiv gruppe, fælles driver mutation gruppe, og pan-negative gruppe er opsummeret i tabel 1.

Patologiske fund af

ALK

-rearranged lungekræft

tabel 1 opsummerer de patologiske funktioner i alle 44 tilfælde. Alle 44 var adenokarcinomer og 2 havde yderligere fokale skællede komponenter (udgør 10% af tumor volumen). Ifølge mønster-baseret klassificeringssystem, var der ingen forskel i tumor klasse mellem

ALK

-positiv, fælles driver mutation eller pan-negative grupper (

s

= 0,59 og

p

= 0,344, henholdsvis). Ifølge overvægten undertyper baseret på IASLC /ATS /ERS klassificering, vores

ALK

-positiv gruppe havde forskellige fremherskende undertyper: acinære 15 sager (34,09%), faste 19 tilfælde (43,18%), lepidic 1 tilfælde (2,27%), papillære 6 tilfælde (13,64%), mikropapillær en case (2,27%, figur 1A), mucinøse 2 tilfælde (4,55%).

ALK

-positiv tumorer blev signifikant associeret med fast-og acinar- fremherskende mønstre i forhold til fælles driver mutant adenokarcinomer (

s

0,0001 og

s

= 0,013, ), medens ikke signifikant associeret med andre fremherskende histologiske mønstre. Desuden

ALK

-positiv tumorer blev ikke signifikant associeret med nogen fremherskende histologiske mønstre sammenlignet med pan-negative adenokarcinomer

(A) papillær og mikropapillær mønstre.; (B) mucinøs cribriform mønster bestående af rigelige ekstracellulære slim og cribriform strukturer; (C) fast mønster med signetring celler; (D) mucinøs cribriform mønster ofte flyder inden slim-fyldte alveolære rum; (E) mukøse celler i form af slimceller; (F) god mønster med hepatoid tumorceller med rigelige eosinofil cytoplasma, runde kerner, og fremtrædende nucleoli; de tumor cellekerner er relativt monomorf.

ALK

-positive tumorer blev også forbundet med forskellige morfologiske træk. Af de 44 tumorer, 52,27% (23/44) viste en cribriform mønster (figur 1B), enten fokal eller diffus. I modsætning hertil kun 20 af 411 fælles driver mutant (

s

0,001) og 34 af 117 pan-negative tumorer havde en cribriform mønster (

s

= 0,006). Der var 29,55% (13/44) af

ALK

-positiv men kun 2% (8/411) af fælles driver mutant tumorer (

s

0,001), som havde mindst nogle grad af signetring celler (Figur 1C). Signet-ring celler var forbundet med en solid fremherskende mønster i 11

ALK

-positive tumorer, en acinar mønster i en, og begge acinar og solide mønstre i ét. Forholdet mellem signet-ring celler til total tumorceller varieret, med en afstand af 5 til 80 procent. Interessant,

ALK

-positiv tumorer blev ikke signifikant associeret med signet-ring celler mønster sammenlignet med pan-negative tumorer, hvilket viser, at signet-ring mønster kunne observeres i andre sjældne onkogen mutant lungekræft. Også fundet var fremtrædende ekstracellulære slim og enhver form for mukøse celler var alle signifikant mere almindelig i

ALK

-positive tumorer (P 0,0001) sammenlignet med de andre 2-gruppen (

s

0,001 ). I 22 tilfælde (50%) var der prominente ekstracellulære slim, med slim ekspanderende i alveolære mellemrum i tumor periferien (Figur 1D). Enhver form for mukøse celler blev fundet i 26 tilfælde (59,09%) og havde forskellige mønster, men de blev fundet oftest i en fast eller acinære mønster. Mukøse celler blev oftest signet-ring og søjleformede goblet typer (Figur 1E). I 2 mucinøse tilfælde bæger celler spredt sig acinar og lepidic mønstre. I 11 (25%) tilfælde var der mindst et knudepunkt population af hepatoid tumorceller med rigelige eosinofil cytoplasma, runde kerner, og fremtrædende nucleoli i en overvejende fast mønster (figur 1F). Desuden er ingen enkelt histologisk mønster var fuldstændig sensitiv eller specifik til at forudsige

ALK

omlejring, og endog tilfælde med signet-ring celle eller cribriform mønstre kan være til stede i de andre 2 grupper. I alle

ALK

-positive tilfælde tumor cellekerner var relativt monomorf (figur 1F), bortset fra to tilfælde, der viser fokusområder pleomorphism. Af de 44, 40 var TTF-1 positive, mens i 6, er foci af adenocarcinom co-udtrykkes TTF-1 og P63.

EML4-ALK fusion variant påvisning ved multiplex RT-PCR og sekventering i frosne materiale

Vi undersøgte forekomsten af ​​

EML4-ALK

fusion variant i 161 sager, som ikke huser

EGFR

,

KRAS

BRAF

ved RT-PCR. Vi identificerede 38 tilfælde af

EML4-ALK

fusion variant med RT-PCR.

EML4-ALK

variant 1 blev påvist i 19 prøver. Fem sager variant 2, 7 tilfælde var variant 3a /3b og en var V3b, E17; A20, E17 ins 65; A20, E17b ins 39; A20 E10a /b, E13; A20, E6a /b ins 18; A20 og E6a; A19 hver (tabel 2). Fusions blev bekræftet ved direkte sekventering.

ALK

omlejringer påvisning af FISH

Der var 161 sager blev udsat for ALK FISH. ALK omlejring er normalt defineret ved split grøn og orange signaler placeret mindst to gange de tider af største signal størrelse. Der var 44 sager positive som identificeret af FISH. Typisk blev to forskellige splittelser i røde og grønne signaler noteret 38 tilfælde (tabel 2, figur 2A). Seks af de FISH-positive sager blev karakteriseret ved tab af en grønt signal (figur 2B). Tre af disse 6 tilfælde var to variant 1 tilfælde, en variant 3b tilfælde og tre negative sager. Seks RT-PCR- negative sager var positive ved FISH. To tilfælde af sameksistensen af ​​både adenokarcinom og fokal pladecellekræft demonstrerede FISH-positivt signal til stede kun i adenocarcinom komponent.

(A) To forskellige røde og grønne signaler. (B) isoleret rødt signal.

ALK omlejringer påvisning af IHC hjælp ALK1 og D5F3 antistof

ALK IHC test i lungekræft er stadig en udfordring på grund af den relativt lave udtryk for ALK protein, med mange resultater, der viser dette at være tilfældet ved anvendelse ALK1 antistof. For at bestemme om IHC bruge D5F3 antistof kan være bedre, evaluerede vi begge i 161 tilfælde. ALK1 antistof ekspression blev påvist i 32, hvilket resulterer i IHC score på 1 (n = 14), 2 (n = 14), og 3 (n = 4), mens 28 patienter var FISH-positive (tabel 2). Vi observerede, at alle IHC 0 sager FISH-negative, alle IHC 3+ og 2+ tilfælde var FISH-positive, 4 IHC 1+ tilfælde var FISH-negative, og 10 IHC 1+ tilfælde var FISH-positive. Blandt de 32 ALK1 IHC-positive tilfælde, kun 4 IHC 3+ udviste en stærk cytoplasmatisk farvning intensitet, observeret i 20% til 100% af positive celler (gennemsnitlig score på 60%). IHC1 + og 2 + tilfælde blev kun observeret i 10% til 50% af positive celler (middelværdi score på 30%) (figurerne 3B, 3D, 3F)

Case 1:. (A) score 3+ viser intens granulær cytoplasmatisk farvning med D5F3 antistof; (B) score 1+ viser svag cytoplasmatisk farvning med ALK1; Case 2: (C) score 3+ viser intens kornet cytoplasmatisk farvning med D5F3; (D) score 2+ viser moderat, kornet cytoplasmatisk farvning med ALK1; Case 3: (E) score 3+ viser intens kornet cytoplasmatisk farvning med D5F3; (F) score 1+ viser svag, knap mærkbar cytoplasmatisk farvning med ALK1.

I vores undersøgelse viste D5F3 IHC test meget høj følsomhed og specificitet til påvisning af ALK-ekspression. D5F3 immunopositivitet blev identificeret i 41 tilfælde (figur 3A, 3C, 3E). Positiv immunfarvning blev kun fundet i adenocarcinom komponent i de 2 adenosquamøst carcinomer. Blandt 41 D5F3-positive tilfælde, 34 var 3+ udstille stærk cytoplasmatisk farvning intensitet, observeret i 60% til 100% af positive celler (gennemsnitlig score på 80%). Af de resterende 7 tilfælde, 2 tilfælde udviste cytoplasmatisk og nuklear positiv farvning. Der var 4 IHC-positivt, var 2+, viser moderat cytoplasmatisk farvning, og 3 IHC-positive tilfælde var 1+, der viser svag cytoplasmatisk farvning. Ingen baggrund blev observeret i stromale celler eller inden normal lunge. Sammenlignede immunaktivitet af ALK1 antistof, viste D5F3 mere intens farvning af tumorceller. Den relative mængde af farvning med D5F3 var også meget højere. Derfor intensitet snesevis af D5F3 antistoffarvning var højere end ALK1 antistof (tabel 2). Interessant D5F3 IHC resulterer i 1 tilfælde illustrerer, at heterogen farvning kan forekomme. En vævsblok viste ingen farvning trods gentagne IHC testning, mens en anden blok viste positiv farvning. FISH-analyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​den genetisk abnormitet. Vi overvejede muligheden for, at de forskellige resultater skyldes heterogenitet.

Sammenligning mellem IHC og RT-PCR

Der var 26 af 38 sager, der var RT-PCR-positive var ALK1 IHC-positiv , med de øvrige 12 tilfælde bliver IHC negativ. Følsomhed ALK1 IHC til påvisning af ALK-omlejring var således 68,4% (26 af 38) i sammenligning med RT-PCR. Men 36 af 38 RT-PCR-positive tilfælde var D5F3-positive (tabel 3). Således følsomhed D5F3 var 94,7% (36 af 38) i sammenligning med RT-PCR (tabel 3). D5F3-positive tilfælde omfattede variant 1, 2, 3a /3b, 3b, E17; A20, E17 ins 65; A20, E17b ins 39; A20, E10a /b, E13; A20, E6a /b ins 18; A20 og E6a; A19. To D5F3-negative tilfælde af de 38 RT-PCR-positive tilfælde var en variant 3a /b og en E17b ins 39; A20 tilfælde (tabel 2). Fem af 123 RT-PCR negative sager D5F3-positive.

Sammenligning mellem IHC og FISH

Der var 28 af 44 FISH-positive sager, der var ALK1 IHC-positiv, og 4 Alk1 IHC-positive tilfælde, der var FISH-negative. Den samlede sensitivitet og specificitet ALK1 IHC sammenlignet med fisk var 64% og 91%, hhv. I modsætning hertil 40 af 44 FISH-positive tilfælde var D5F3-positive. Fire af 44 FISH-positive tilfælde var D5F3-negative. Én FISH negativ sag var D5F3-positive. Samlet sensitivitet og specificitet D5F3 i sammenligning med FISH var 91% og 98% (tabel 4).

Diskussion

Selvom

ALK

-rearranged lungekræft gøre kun udgør 5% til 7% af alle NSCLC tilfælde har de demonstreret en imponerende lydhørhed over for ALK tyrosinkinasehæmmer, crizotinib, og udgør en terapeutisk vigtig underkategori. Tidligere undersøgelser har evalueret ALK omlejring lungekræft, men den omfattende analyse af

ALK

-rearranged lungekræft i kinesisk har ikke godt vurderet. Vi identificerede 44 tilfælde af

ALK

-rearranged sager i 572 lungekræft. I vores serie, disse tumorer manglede mutation af

EGFR, KRAS eller BRAF

efter aftale med de forudgående observationer [14]. I tidligere rapporter, resultater af detaljeret clinicopathologic analyser af

ALK

-rearranged lungekræft har varieret. En grundig undersøgelse af clinicopathologic funktioner i disse patienter sammenlignet med de fælles mutationer

EGFR

KRAS

eller sjældne ukendte mutationer er et nyt problem med klinisk interesse. Vi søgte at sammenligne clincopathologic funktioner i

ALK

-rearranged lungekræft med de fælles driver mutationer og pan-negative tumorer

Vores vigtigste klinik resultaterne af vores undersøgelse var som følger:. (1)

ALK

-rearranged lungekræft var hyppigere hos yngre patienter sammenlignet med det fælles drev mutationen gruppe (

s

= 0,023) efter aftale med tidligere undersøgelser [4], [15], mens var der ingen signifikans forskel sammenlignet med patienter i pan-negative gruppe (

s

= 0,83). (2)

ALK

-rearranged patienter er forbundet med rygning forbudt historie sammenlignet med den pan-negative gruppe (

s

0,001), mens rygning historie

ALK

– omarrangerede patienter var ikke forskellig fra den fælles drev mutationen gruppe (

s

= 0,828). (3) Der var ingen forskelle i køn, tumorstørrelse, lymfeknude status, tumor lønklasse eller stadie mellem

ALK

-positiv, fælles driver mutation eller pan-negative grupper. Denne uoverensstemmelse kan skyldes det lille antal undersøgte i anden undersøgelse, eller forskellige eksperiment gruppering design, eller forskelle i etnicitet sager. Derfor er de kliniske karakteristika alene ikke er tilstrækkelige til at udvælge individuelle tilfælde til yderligere testning for

ALK

omordning.

I vores undersøgelse, alle 44

ALK

-rearranged lungekræft var adenokarcinomer, med 2 tilfælde at have yderligere fokale skællede komponenter. Interessant nok i begge tilfælde var den

ALK

omlægning til stede i planocellulært komponent, bekræftes af både fisk og IHC. Dette er i modsætning til en rapport, hvor

ALK

omordning sameksisteret i begge komponenter [15]. Selv om de fleste

ALK

-rearranged lungekræft er adenocarcinomer, andre histologiske typer bør ikke udelukke sin tilstedeværelse. I vores undersøgelse,

ALK

-rearranged tumorer blev præget af en fast eller acinære vækstmønster og manglende lepidic vækst. Sammenlignet med almindelige driver mutation tumorer, fast eller acinære-dominerende mønster, cribriform struktur, signet-ring celler, hepatoid udseende, fremtrædende ekstracellulær slim, og enhver form for mukøse celler blev alle signifikant associeret med

ALK

– positive tumorer. Dette er i overensstemmelse med en tidligere rapport [13]. Sammenlignet med pan-negative tumorer, kun cribriform struktur, fremtrædende ekstracellulære slim og enhver form for mukøse celler var signifikant associeret med

ALK

-positive lunge adenokarcinomer. Derfor viste vores data cribriform struktur, fremtrædende ekstracellulære slim og enhver form for slim celler mønster er følsomme og /eller specifik til at forudsige

ALK

omlejring. I de fleste

ALK

omarrangerede tumorer, tumor kerner var relativt monomorfisk, bortset fra 2 tilfælde, der viser fokusområder for pleomorphism. Disse særskilte morfologiske træk af

ALK

omlejring tumorer er i overensstemmelse med tidligere rapporter fra både vestlige og asiatiske kohorter [15], [16] og kan være nyttige i at vælge sager for yderligere præcise molekylære test.

Selvom P63 positivitet ofte bruges som en markør for pladecellekræft i diagnostisk patologi, fandt vi, at et par

ALK

-rearranged tumorer co-udtrykt P63 og TTF1 i adenocarcinom komponent. Vore data er meget forskellig fra en tidligere rapport, som viste, at mere end halvdelen af ​​deres tumorer co-udtrykte TTF-1 og P63, der viser diffus farvning af både [16]. Hvis P63 blev brugt som et planocellulært markør for at gøre en patologisk diagnose,

ALK

-rearranged tumorer kan fejldiagnosticeret som adenosquamøst celle karcinomer

Præcis identifikation af

ALK

. – omarrangerede tumorer kræver en følsom og specifik testmetode. I øjeblikket eksisterer flere sådanne metoder, såsom IHC, FISH, og RT-PCR. RT-PCR er velegnet til at detektere

EML4-ALK

eller alternative fusion udskrifter [14], men er ikke tilgængelig i mange rutinemæssige patologiske afdelinger. Desuden er de fleste af enheder lagret som FFPE, i hvilket tilfælde RNA kan væsentligt forringet. Endvidere kan RT-PCR ikke registrere alle de translokationer som involverer genet. FISH, ved hjælp af ALK break-hinanden sonde, var den standard test for indskrivning i et klinisk forsøg med crizotinib [6]. Imidlertid er FISH betragtes som lav-throughput, så er ikke egnet til påvisning af

ALK

rearrangementer i stor skala screening. IHC, er imidlertid en billig, relativt let teknik til screening og diagnosticering

ALK

-rearranged tumorer i rutinemæssig kirurgisk patologi praksis, selv om, er blevet rapporteret nogle ALKs antistoffer til at mangle specificitet og følsomhed [4].

Vi evaluerede

EML4-ALK

fusion varianter ved hjælp af RT-PCR og identificeret, at E13; A20 (variant 1), E6a /b; A20 (variant 3a /b), E20; A20 (variant 2) er de mest almindelige varianter. Denne frekvens fordeling er meget lig dem rapporteret [17]. I vores undersøgelse 6 RT-PCR-negative tilfælde var FISH-positive, hvilket tyder nærværelse af andre ukendte varianter.