PLoS ONE: Etablering af en non-invasiv semikvantitativ selvlysende Imaging Metode til overvågning af en ortotopisk Esophageal Cancer Mouse Model

Abstrakt

ortotopisk modeller af forskellige typer af tumorer er meget udbredt i anti-tumor terapeutiske eksperimenter i prækliniske studier. Men der er få måder til passende overvåge terapeutiske virkning i ortotopisk tumormodeller, især for tumorer usynlige udefra. I denne undersøgelse sigtede vi mod at etablere en ikke-invasiv semikvantitativ bioluminescerende billeddannelse fremgangsmåde til overvågning af en orthotopisk esophageal cancer musemodel. Vi bekræftede, at TE8 esophageal cancer cellelinie implanteres orthotopisk i det abdominale spiserøret af

nu /nu

mus (n = 5) udviklede ikke kun en vigtigste tumor på den implanterede sted, men også lokale lymfeknudemetastaser og peritoneal dataudsendelser inden for 6 uger efter podning. Vi har etableret en TE8 cellelinje, der stabilt udtrykte ildflue luciferasegenet (TE8-Luc). Vi viste, at TE8-Luc celler implanteret subkutant i

nu /nu

mus (n = 5) voksede over tid, indtil 5 uger efter inokulering. Tumorvolumen var stærkt korreleret med luminescerende intensitet udsendes fra tumoren, som blev kvantificeret under anvendelse IVIS imaging system. Vi derefter viste, at TE8-Luc celler implanteres orthotopisk i musen abdominale spiserøret (n = 8) også udformet en tumor, og at det luminescerende intensitet sådan tumor, som påvist ved IVIS, steg over tid, indtil 7 uger efter inokulering og blev derfor sandsynligvis afspejler tumorudvikling. Vi foreslår derfor, at dette ortotopisk kræft i spiserøret model, overvåges ved hjælp af ikke-invasiv semikvantitativ IVIS imaging system, vil være nyttig for in vivo terapeutiske eksperimenter mod kræft i spiserøret. forventes Denne eksperimentelle indstilling til at bidrage til udvikling af nye terapeutiske teknologier til kræft i spiserøret i prækliniske studier

Henvisning:. Kuroda S, Kubota T, Aoyama K, Kikuchi S, Tazawa H, Nishizaki M, et al. (2014) Etablering af en non-invasiv semikvantitativ selvlysende Imaging Metode til overvågning af en ortotopisk Esophageal Cancer Mouse Model. PLoS ONE 9 (12): e114562. doi: 10,1371 /journal.pone.0114562

Redaktør: Sunil Singhal, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: 14. august 2014 Accepteret: 11. november 2014 Udgivet: December 10, 2014

Copyright: © 2014 Kuroda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Grant-in-Aid fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport og Teknologi, Japan (TF) og tilskud fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd, Japan (TF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i spiserøret er en af ​​de mest almindelige typer af kræft i verden. Histologisk planocellulært karcinom tegner sig for mere end 90% af kræfttilfælde i Japan, mens adenocarcinom tegner sig for mere end halvdelen af ​​kræft i USA Prognosen for kræft i spiserøret er ganske fattige blandt kræft i mave-tarmkanalen, såsom mavekræft og tarmkræft som esophageal kræftformer er tilbøjelige til lymfeknudemetastaser og direkte invasion til de omkringliggende organer. Trods fremskridt i tidlig diagnose og i udviklingen af ​​kirurgiske teknikker og udstyr, samt i kemoterapi, strålebehandling og deres kombination, har kræft i spiserøret endnu ikke været tilfredsstillende overvundet, og dette er et område, hvor der forventes nye effektive lægemidler, der skal udvikles i den nærmeste fremtid [1] – [3].

på lægemiddelforskning, ortotopisk tumormodeller er uden tvivl bedre modeller end subkutane modeller til evaluering af den terapeutiske virkning af nye lægemidler, fordi de bedre afspejler sygdommens progression af de oprindelige tumorer [4], [5]. En række ortotopisk tumormodeller er blevet anvendt i dyreforsøg, herunder modeller af colon, pancreas, lever, lunge, prostata, nyre celle, blære, bryst, melanomer og hjernetumorer [6]. Men der er kun få rapporter om ortotopisk kræft i spiserøret modeller trods det presserende behov for en sådan en model. Manglen på en orthotopisk esophageal cancer model synes at skyldes problemerne med anatomiske placering og størrelse af spiserøret udover de tekniske problemer med oprettelse af en orthotopisk model.

Tilgængeligheden af ​​en fremgangsmåde til evaluering terapeutisk effektivitet er et andet spørgsmål, når du bruger en ortotopisk model. Selv overlevelsesraten eller kropsvægt har været almindeligt anvendt til evaluering, behøver disse parametre ikke direkte afspejler terapeutisk effekt på grund af påvirkning af en række andre faktorer på en sådan effekt. Enkelte diagnostiske modaliteter har været anvendt som ikke-invasive metoder til overvågning af en orthotopisk model, såsom magnetisk resonans billeddannelse (MRI) [7], [8] og positronemissionstomografi (PET) /computertomografi (CT) [9 ], [10]. Desuden er anvendelsen af ​​grønt fluorescerende protein (GFP) – [4], [11] og luciferase- [12], [13] udtrykkende cellelinjer er tilvejebragt en interessant tilgang til udviklingen af ​​en ikke-invasiv billeddannelse teknik

Her rapporterer vi etableringen af ​​en original ortotopisk kræft i spiserøret model i mus, som udviklede lokale lymfeknudemetastaser og peritoneale dataudsendelser i tillæg til de vigtigste tumor. Under anvendelse af denne model, vi bekræftet, at IVIS imaging system (Xenogen, Alameda, CA) var passende og nyttig som en ikke-invasiv overvågning fremgangsmåde til tumorprogression i denne model.

Materialer og metoder Salg

den eksperimentelle protokol dyr blev godkendt af den etiske Review Committee for Animal Eksperimenteren af ​​Okayama University, og alle mus anvendt i denne undersøgelse blev bedøvet med ketamin /xylazin eller isofluran /ilt til eksperimenter og aflives med cervikal dislokation under anæstesi.

Cellelinier og cellekulturer Salg

Den humane esophageal pladecellecarcinom linje, TE8 (Riken BRC Cell Bank, Japan) blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. TE8 transficeret med ildflue luciferase plasmidvektoren (PGL-Control-RSVneo) (venligst stillet til rådighed af Dr. Hiroyuki Mizuguchi, Osaka University, Osaka, Japan) og klonet ved begrænsende fortynding (TE8-Luc) blev dyrket som beskrevet for TE8 ovenfor, men med tilsætning af 0,2 mg /ml Geneticin (G418) (Life Technologies, 10.131-027) til mediet. Det gennemsnitlige niveau af luciferaseaktivitet pr 5,0 × 10

4 TE8-Luc celler var 1462 relative lysenheder (RLU).

Subkutan tumor model

TE8-Luc celler (2 x 10

6 celler /mus) blev injiceret subkutant i flanken af ​​fem 5-6 uger gamle BALB /c

nu /nu

mus. Den vinkelrette diameter af hver tumor blev målt en gang om ugen, indtil 5 uger efter podning med tumoren. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af følgende formel: tumor volumen (mm

3) =

en

×

b

2 × 0,5, hvor

en

er den længste diameter,

b

er den korteste diameter, og 0,5 er en konstant til at beregne mængden af ​​en ellipsoide.

ortotopisk kræft i spiserøret model

BALB /c

nu /nu

mus (5-6 uger gamle) blev fastsat i en liggende stilling. En hudindskæring 7 til 10 mm lang blev foretaget i midten af ​​den øvre del af maven fra formet som et sværd proces. Leveren blev oprejst og maven blev trukket ned med en pincet, så den abdominale spiserøret kunne ses. En 1 ml sprøjte med en 31-gauge nål, hvori TE8 eller TE8-Luc celler blev suspenderet i Matrigel i en koncentration på 2 × 10

6 celler /20 pi, blev indsat i den forreste væg af maven og derefter bevæges subserosally mod abdominale spiserøret tværs af esophagastric junction. Cellerne blev derefter langsomt indsprøjtet. Endelig blev maven lukket med suturer (Film S1).

Brug denne metode, TE8 celler orthotopisk implanteret i fem BALB /c

nu /nu

mus. Ved 4 uger efter tumorinokulation blev alle fem mus opereret igen for at kontrollere tumorudvikling, og derefter en af ​​de fem mus blev aflivet og dens vigtigste tumor og en lokal lymfeknude blev høstet til histologisk undersøgelse. Efter 6 uger efter podning blev de andre fire mus alle aflivet efter fornyet laparotomi og observation.

TE8-Luc celler blev implanteret i den abdominale spiserøret af otte BALB /c

nu /nu

mus under anvendelse af den samme fremgangsmåde. Ved 3 uger efter tumorinokulation blev alle musene opereret for at kontrollere tumorudvikling, og derefter fem af de otte mus, hvor der blev observeret tumordannelse på spiserøret, overvågedes gang om ugen med IVIS billeddannelsessystem beskrevet nedenfor indtil 7 uger efter tumorpodning.

IVIS billeddannelse

Luciferin, substratet af luciferase, blev injiceret intraperitonealt i mus med en dosis på 150 mg /kg legemsvægt. Musene blev derefter bedøvet og anbragt på den billeddannende fase af IVIS apparat i maven (subkutan model) eller liggende (ortotopisk model) position. Billeder blev opsamlet hvert par minutter fra 10 og 30 minutter efter luciferin injektion under anvendelse IVIS Imaging System (Xenogen, Alameda, CA), og fotoner, der udsendes fra tumoren og dens omgivelser blev kvantificeret under anvendelse Living Billede software (Xenogen).

Statistisk analyse

Enkel lineær regressionsanalyse blev udført ved hjælp af Microsoft Excel til at undersøge sammenhængen mellem tumor volumen og selvlysende intensitet, og determinationskoefficienten, R

2, blev beregnet til at vurdere styrken af forening.

Resultater

TE8 celler injiceret i subserosal rum af den abdominale spiserøret af BALB /c

nu /nu

mus dannede en tumor (fig. 1A) i fire af de fem mus og udviklede lokale lymfeknudemetastaser (fig. 1C) i to af de fem mus ved 4 uger efter inokulation af tumor. Ved 6 uger efter inokulering, anden mus havde fund af peritoneale dataudsendelser (fig. 1E). Dannelse af en primær tumor (fig. 1B) og metastaser til lokale lymfeknuder (fig. 1D) blev også bekræftet ved histologiske fund. Den vigtigste tumor voksede i submukøse plads trods bliver sprøjtet ind i subserosal plads, mens det ikke invadere slimhinden lag.

A) TE8 celler implanteres i den abdominale spiserøret dannede en tumor på den implanterede stedet (hvid pil ) ved 4 uger efter inokulation af tumor. B) H.E. farvning af paraffin-indlejrede væv af de vigtigste tumor (A) viste, at tumoren havde spredt ind i submukøse plads af den abdominale spiserøret. (T: Tumor, L: Lumen, E: epitellaget, M: Muscle lag) C) TE8 celler implanteret i den abdominale spiserøret udviklede lokale lymfeknudemetastaser (hvid pilespids) ved 4 uger efter podning med tumoren. D) H.E. farvning af paraffin-indlejrede væv i lokale lymfeknuder (C) histologisk angivet lymfeknudemetastase. E) TE8 celler implanteres orthotopisk også udviklet peritoneale dataudsendelser (sorte pile) på 6 uger efter podning med tumoren. Scale barer; 2 mm (A, C, E), 500 um (B, D)

Vi næste genererede TE8-Luc celler, som stabilt udtrykker den ildflue-luciferase-genet, og subkutant implanterede disse celler til BALB /c

nu /nu

mus. Luminescensen af ​​disse celler blev overvåget med IVIS billeddannende system for at bestemme om tumorvolumen korreleret med luminescerende intensitet. TE8-Luc celler dannet en tumor i alle fem mus. Som tumorerne voksede, steg luminescerende intensitet over tid som bedømt både visuelt (fig. 2A) og kvantitativt (fig. 2B) (fig. 2C). Tumor volumen og selvlysende intensitet var stærkt korreleret med hinanden (R

2 = 0,9199) (fig. 2D), hvilket indikerer, at måling af selvlysende intensitet er passende for evaluering af tumorprogression.

A) IVIS billeder blev opnået en gang om ugen, indtil 5 uger efter subkutan inokulation af TE8-Luc celler. B) Luminescent intensitet fotoner udsendt fra hver tumor i billederne i (A) blev kvantificeret. Mus nummerering svarer til nummereringen i (A). C) Tumorvolumen blev også beregnet en gang om ugen. D) Sammenhæng mellem selvlysende intensitet udsendes fra hver tumor og tumor volumen blev statistisk vurderet ved hjælp af data fra (B) og (C).

Endelig har vi opgjort, hvis TE8-Luc celler kan danne en ortotopisk tumor, der voksede med tiden. Fem af otte BALB /c

nu /nu

mus, hvor TE8-Luc-celler blev implanteret orthotopisk i det abdominale spiserøret udviklet en tumor på den implanterede site ved 3 uger efter podning med tumoren, hvilket blev bekræftet af re-laparotomi . Disse fem mus blev overvåget ved IVIS gang om ugen, og fotoner, der udsendes fra tumoren og dens omgivelser steget over tid som bedømt både visuelt (fig. 3A) og kvantitativt (fig. 3B). Salg

A) IVIS billeder blev opnået en gang om ugen fra 3 til 7 uger efter TE8-Luc ortotopisk tumor inokulering i den abdominale spiserøret. B) Luminescent intensitet af fotoner udsendt fra hver tumor og dens omgivelser i billederne i (A) blev kvantificeret. Mus nummerering svarer til nummereringen i (A).

Diskussion

Furihata et al. [14] var den første til at rapportere etablering af en ortotopisk esophageal podning model i mus i 2001, hvor de åbnede den forreste væg i maven og injiceres tumorceller i submukøse rum af den abdominale spiserøret direkte efter laparotomi. I modsætning hertil vi injicerede celler i subserosal plads af den abdominale spiserøret uden at åbne maven. Selv om deres metode er teoretisk en mere ideel metode end vores, vores metode er enklere og er stadig en acceptabel metode, fordi tumorer dannet ved hjælp af vores metode voksede og spredning i det submukøse plads trods bliver indsprøjtet i subserosal rummet som de histologiske fund i fig. 1C show. To af fem af vores model mus udviklede lokale lymfeknudemetastaser og en mus udstillet peritoneale dataudsendelser. Indlysende metastaser til lever, lunge eller mediastinale lymfeknuder blev ikke fundet. For at generere en mere invasiv ortotopisk esophageal cancer model, kan det være nødvendigt at anvende mere invasive celler [15] eller at anvende kliniske tumorprøver, der har høj invasive potentiale [4].

Ohara et al. [16] fastlagde en interessant ortotopisk musemodel af cervikal og torakal esophageal cancer ved injektion af tumorceller i esophageal lumen gennem munden. Selv om denne fremgangsmåde synes simpelt ved, at ingen kirurgisk teknik er påkrævet, kan det være vanskeligt at bedømme, om tumorceller nøjagtigt injiceres i spiserøret, fordi proceduren er uundgåeligt udføres blindt. Imidlertid kan denne metode har en fordel frem vores metode i, at det forårsager dårlig oral indtagelse, der bedre afspejler progressionen af ​​den oprindelige tumor. I vores undersøgelse, havde kropsvægt ikke falde på alle indtil lige før døden, trods omfattende tumorvækst og spredning (data ikke vist).

Quatromoni et al. [17] for nylig rapporteret effektiv adenoviral-baseret immunterapi mod kræft i spiserøret, hvori en orthotopisk esophageal cancer musemodel etableret ved gastroøsofageal krydset med den samme teknik som vi viste i filmen blev anvendt. I denne model tumorer voksede med tiden begrænset til det tumor-injektionsstedet uden direkte invasion af esophageal mucosa. Men tumorer ikke forårsage obstruktion af esophageal lumen og ingen mus viste tegn på dysfagi og signifikant vægttab. Disse karakteristika er alle ens med dem, vi viste i vores undersøgelse.

I modsætning hertil Gros et al. [18], [19] fastlagde en orthotopisk esophageal cancer musemodel under anvendelse af en særdeles aggressiv esophageal cancer cellelinje på samme måde som vores, hvori de detekterede metastatisk spredning til leveren og lungerne samt til lymfeknuderne ved hjælp af højtopløsende billeddannelse med GFP og ved MRI, mens vi ikke var i stand til at påvise metastaser til leveren eller andre organer ved luciferase imaging i vores undersøgelse. Disse rapporter fra Quatromoni et al. og Gros et al., herunder vores undersøgelse, tyder på, at orthotopisk esophageal cancer model etableret ved gastroøsofageal krydset og dets etablering metode er universel og reproduktiv, og at denne model kan forårsage tumor progression, hvilket er tæt på faktiske kliniske praksis, såsom metastaser til lymfeknuderne, peritoneum og leveren eller andre organer i tillæg til lokal tumorvækst.

modsætning subkutane modeller, er det vanskeligt nøjagtigt at analysere tumorprogression i ortotopisk tumormodeller. Selvom overlevelsesrate og kropsvægt er almindeligt anvendt som evalueringsmetoder i ortotopisk studier, disse parametre ikke direkte afspejler terapeutisk effekt, fordi mange andre faktorer også påvirke resultatet. Anvendelsen af ​​tumorceller markeret med luciferasereportergenet og bioluminescerende billeddannelse, som i øjeblikket er en bliver fremgangsmåde i forskningsområdet, giver os mulighed for at overvåge tumorvækst ikke-invasivt in vivo, især i dybe væv [13]. Derfor vi oprindeligt etableret TE8-Luc celler, der var stabilt transficeret med ildflue-luciferase-genet og anvendes til ikke-invasiv overvågning.

I vores undersøgelse under anvendelse IVIS imaging system, det luminescerende intensiteten af ​​fotoner udsendt fra TE8-Luc subkutane tumorer stærkt korreleret med tumorvækst. Baseret på denne kendsgerning, er det derfor sandsynligt, at en stigning i luminescerende intensitet i en ortotopisk model over tid nøjagtigt afspejler tumorprogression. Faktisk, i en tidligere undersøgelse, hvor vi kvantitativt overvåges terapeutisk virkning ved denne ortotopisk model ved hjælp IVIS imaging system, har ændringen i luminescerende intensitet tilsyneladende nøjagtigt afspejle terapeutisk effektivitet [20]. Derfor er den metode, som vi beskriver i nærværende undersøgelse for etablering af en orthotopisk esophageal cancer model i mus og ikke-invasiv overvågning med IVIS billeddannende system er en meget nyttig og praktisk metode, og forventes at bidrage til udviklingen af ​​hidtil ukendte terapeutiske teknologier til kræft i spiserøret.

Støtte Information

Movie S1. .

Hvordan man laver en ortotopisk kræft i spiserøret musemodel

doi: 10,1371 /journal.pone.0114562.s001

(MPG)

anerkendelser

Forfatterne takker Tomoko Sueishi og Tae Yamanishi for deres fremragende tekniske support.