PLoS ONE: Energi Metabolisme i H460 Lung Cancer Cells: Effekter af histon-deacetylasehæmmerne

Abstrakt

Baggrund

Tumorceller er kendetegnet ved accelereret vækst som regel ledsaget af opreguleret veje, der i sidste ende øge hastigheden af ​​ATP-produktion. Disse celler kan lide metabolisk omprogrammering, hvilket resulterer i distinkte bioenergetic fænotyper, generelt øge glykolyse kanaliseret til lactat produktionen. I det foreliggende arbejde viste vi metabolisk omprogrammering ved hjælp af inhibitorer af histon deacetylase (HDAC-hæmmere), natriumbutyrat og trichostatin. Denne behandling var i stand til at flytte energi stofskifte ved at aktivere mitokondrie systemer som det respiratoriske kæde og oxidativ fosforylering, der var stort set fortrængt i de ubehandlede kontroller.

Metode /vigtigste resultater

Forskellige cellulære og biokemiske parametre blev evalueret i lungekræft H460-celler behandlet med histondeacetylaseinhibitorer (HDACi), natriumbutyrat (NaB) og Trichostatin A (TSA). NAB og TSA reduceret glycolytiske flux, analyseres ved lactat frigivelse ved H460-celler på en koncentrationsafhængig måde. NaB inhiberede ekspressionen af ​​glucosetransporter type 1 (GLUT 1), men væsentligt forøget mitokondrier bundet hexokinase (HK) aktivitet. Nab inducerede stigning i HK aktivitet var forbundet til isoform HK I og var ledsaget af 1,5 gange stigning i HK I mRNA-ekspression og beslægtede protein biosyntese. Laktat dehydrogenase (LDH) og pyruvat kinase (PYK) aktiviteter var uændret ved HDAC-hæmmere tyder på, at stigningen i HK aktiviteten ikke blev koblet til glycolytisk flux. Høj opløsning respirometri af H460 celler afslørede NAB-afhængige større procentdel af iltforbrug koblet til ATP-syntese. Metabolomiske analyse viste, at NaB ændret den glycolytiske metabolitprofilen af ​​intakte H460 celler. Samtidig vi har registreret en aktivering af pentosephosphatvejen (PPP). Den høje O

2 forbrug i NaB-behandlede celler viste sig at være relateret til mitokondrie biogenese da citratsyntase (CS) aktivitet og mængden af ​​mitokondrie-DNA forblev uændret.

Konklusion

NAB og TSA inducerede en stigning i mitokondrie-funktion og oxidativ metabolisme i H460 lunge tumorceller samtidig med en mindre proliferativ cellulær fænotype

Henvisning:. Amoedo ND, Rodrigues MF, Pezzuto P, Galina a, da Costa RM, de Almeida FCL, et al. (2011) Energy Metabolism i H460 Lung Cancer Cells: Effekter af histon-deacetylasehæmmerne. PLoS ONE 6 (7): e22264. doi: 10,1371 /journal.pone.0022264

Redaktør: Alicia J. Kowaltowski, Instituto de Química – Universidade de São Paulo, Brasilien

modtaget: 1 februar, 2011; Accepteret: 20 juni 2011; Udgivet: 18 Juli 2011

Copyright: © 2011 Amoedo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Fundação do kræft, brasilianske Institut for Neurovidenskab – IBNnet FINEP, INCT – excitotoksicitet og Neuroprotektion # 01.06 0,0842 og INCT – kræft. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ukontrolleret spredning og invasion typisk for kræftceller er processer, som kun kan vedvarende, når der er tilstrækkelig energiforsyning, en funktion, der angiver forekomsten i transformerede celler af forskellige fænotyper, der nødvendigvis involverer elementer af det formidlende stofskifte. I solide tumorer er det blevet vist af Otto Warburg, at cellerne har tilpasset til at stole på anaerob glykolyse som en strategi til at opretholde deres fremherskende anabolske status [1]. Men den opregulering af glykolysen udvises af kræftceller ikke nødvendigvis en streng anaerob fænotype eller en dysfunktionel oxidativ fosforylering systemet (OXPHOS). Antages det snarere, at den normale samspil mellem glycolyse i cytosolen og OXPHOS i mitokondrierne bliver forstyrret eller omprogrammeret i tumorceller. Crabtree effekt observeret i cancerceller eller i hurtigt prolifererende celler eksemplificerer den intime forbindelse mellem glycolyse og den oxidative metabolisme [2].

Interessant den anaerobe fænotype udvist af cancerceller kan nemlig årsagen snarere end konsekvensen af ​​den adaptive tryk. Ved at overveje at den glycolytiske switch typisk for kræftceller erhverves ved meget debut af carcinogenese, ideen opstod, at ændringer i glycolytiske vej kan prædisponere celler til malign transformation [3], [4]. Selektive fordele for de transformerede celler kunne være resultatet af forskellige træk. For eksempel er det kendt, at hypoxi-inducerbare faktor-1 (HIF-1α) spænder stimulerer ekspressionen af ​​glucose og monocarboxylat transportører, glycolytiske enzymer og inducerer en nedregulering i pyruvatdehydrogenase-kompleks [5]. Endvidere tumorceller præsentere isoformen af ​​HK, der binder til mitokondrielle poredannende protein spændingsafhængig anion kanal (VDAC). Ved at forebygge interaktionen af ​​pro-apoptotiske proteiner med mitokondrier det bundne enzym virker i det væsentlige som et anti-apoptotisk middel. Faktisk er det blevet vist, at frigivelsen af ​​apoptotiske proteiner såsom cytochrom

c

afhænger af integriteten af ​​den N-terminale del af VDAC [6]. Da det blev påvist, at HK og Bcl-2 var i stand til at bibringe beskyttelse mod apoptose gennem interaktion med VDAC 1 N-terminale region, blev deltagelse HK II som en promotor af celledifferentiering styrket.

Enzymer af de glycolytiske og oxidative veje er, som proteiner generelt, som kan underkastes regulering af genekspression på niveau med kromatin. Kromatin strukturer veksler mellem komprimerede og afslappet konformationer, som igen afhænger af acetylering og deacetylering af histon-protein kerne. De enzymatiske systemer involveret i disse processer er histoner acetyl transferaser (HATS), der tilføjer acetylgrupper til lysinrester og histondeacetylaser (HDAC), der fjerner dem. Komprimerede og afslappet kromatin har været forbundet med genekspression repression og aktivering, henholdsvis. Selvom histoner udgør det primære substrater til hatte og HDCAs, andre ikke-histon proteiner såsom transkriptionelle faktorer-p53, pRb retinoblastoma protein og HIF-1α; chaperoner (HSP90), metaboliske enzymer (pyruvatkinase; acetyl-CoA syntase) og steroid receptorer er også acetyleret /deacetyleret af disse enzymer. Derfor kan hatte og HDAC påvirker et bredt spektrum af biologiske processer, der omfatter vækststandsning, DNA-reparation, cellulære bioenergetik, celledødsveje (apoptose, og autophagy), mitose, generering af reaktive oxygenarter (ROS), ældning og angiogenese [7 ], [8]. På grund af dens undertrykkelse, er HDAC blevet interessante mål for udvikling af lægemidler, der kan hente evne transformerede celler til at undergå apoptose. I øjeblikket har flere HDAC-hæmmere (HDACi) opnået fra naturlige eller syntetiske kilder blevet karakteriseret. De er grupperet i fem kemiske klasser bl.a. hydroxamsyre og afledte forbindelser, benzamider, cykliske peptider, kortkædede fedtsyrer og ketoner.

Som nævnt ovenfor er de HDAC-hæmmere ændre flere funktioner i normale og transformerede celler, som gør det vanskeligt at give en virkningsmekanisme til disse lægemidler. Adskillige rapporter eksisterer der viser virkningen af ​​HDACi på cellecyklussen og apoptose. Den nuværende arbejde har dissekeret disse overordnede handlinger ved at fokusere på energi metabolisme og viser, at HDAC-hæmmere kan påvirke spredning ved at påvirke de enkelte enzymer i de glykolytiske og oxidation. Den information tilgængelig hidtil studerer mitokondrier fra rottelever behandlet med den kortkædede fedtsyre-derivat valproat (VPA) har vist, at det hæmmer fedtsyre-β-oxidation og generelt nedtrykker celle oxidativ metabolisme fører til et fald i både, hastigheden af ​​O

2 forbrug koblet til ATP syntese og cytochrom oxidase aktivitet [9], [10], [11]. Colorektale adenocarcinomer celler (HT29) behandlet med butyrat, en anden kortkædet fedtsyre klasse HDACi, inhiberede glucoseoptagelse og oxidation samt ribose syntese og forøget

de novo

fedtsyresyntese sammen med aktivering af PPP. Men MIA celler, butyrat-resistente pancreas adenocarcinom, ikke udviser nogen ændringer i deres metaboliske profil efter behandling. Disse metaboliske ændringer blev korreleret til induktion af differentieringsprocesser medieret af butyrat og dermed med sine hæmmende effekt på væksten. Lignende resultater blev opnået med celler udsat for TSA [12], [13]. I myelomceller, det HDAC-hæmmere VPA og suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA) inducerede en nedgang i glucoseoptagelse, GLUT 1 ekspression og HK-aktivitet, hvilket fører til apoptose i tumorceller. Desuden er disse inhibitorer øgede aminosyren katabolisme [14].

Den foreliggende undersøgelse undersøgte roller NaB og TSA på flere parametre, biokemiske og morfologiske på den H460 cellelinien af ​​lungekræft celler for at præcisere, hvordan disse HDAC-hæmmere forstyrrer tumorcelle homeostase. Dataene viste endegyldigt, at behandling med NaB i 24 timer fører til en generelt forbedret oxidativ metabolisme klart tyder på, at HDAC-hæmmere kan transcendere deres kanoniske rolle på kromatin niveau.

Metoder

Cell Culture

H460, en human lungecancer-celle (ATCC, deponeret af aF Gazdar, 1982), blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), pH 7,4 ved 37 ° C i en fugtig inkubering kammer med 5% CO

2. Celler blev subdyrket hver 2 dage og anvendes på eksperimenter, når de nåede 85% konfluens. H460 celler blev genotypebestemt i vores laboratorium under anvendelse af 8 loci plus amelogenin. Alle loci matchede ATCC DNA STR-profil.

Cell Levedygtighed og Citotoxicity Assay

For de analyser cellerne blev dyrket på 24 og 96 brønde. 24 timer efter udpladning blev cellerne inkuberet med tre forskellige koncentrationer af NaB (1, 3 og 10 mM) og TSA (0,02, 0,2 og 1 uM) i op til 48 timer. Efter hver behandling blev cellelevedygtighed adgang til ved hjælp MTT-assay som tidligere [15] beskrevet, og eksklusion med trypanblåt farvestof-assay. Citotoxicity blev analyseret ved lactatdehydrogenase (LDH) -frigivelse efter NaB behandling under anvendelse CytoTox96 Ikke-radioaktivt cytotoksicitet (Promega).

Cell Cycle Analysis

I DNA farvende H460 celler blev dyrket i 6 brønd plader og behandlet med 3 eller 10 mM NaB og 0,2 uM TSA i 24 timer. Cellerne blev pelleteret (1000

xg

i 5 min. Ved 4 ° C) og ressuspended i 500 pi PI farveopløsning bestående af 50 ug /ml propidiumiodid (PI), 1 mg /ml RNAse og 0,2% Triton X-100. Prøver blev inkuberet på is i 15 min. i mørke og derefter analyseret i FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson) ved hjælp CellQuest software (Becton Dickinson), henholdsvis til dataopsamling og cellecyklusfordeling analyse.

Kinetik af Laktat Frigivelse i Kultur media

efter behandling med forskellige koncentrationer af NaB og TSA i 24 timer blev dyrkningsmediet erstattet med frisk RPMI 1640-medium uden phenolrødt og FBS. På de angivne tidspunkter (0, 15, 30, 40, 50 og 60 min.), Aliquots fra dyrkningsmedium blev indsamlet for at vurdere lactat udslip gennem denne enzymatiske assay: lactat måling blev udført i en hydrazin /glycinbuffer (pH 9,2), indeholdende 5 mg /ml β-NAD

+ og 15 enheder /ml lactatdehydrogenase. Absorbansen på grund af dannelse af NADH blev monitoreret i en mikropladelæser (SpectraMax M5, Molecular Devices) ved 340 nm og var korreleret med tilstedeværelsen af ​​lactat på prøver fra en standardkurve [16].

Fremstilling af mitokondrie og Cytosoliske proteinfraktioner

H460 cellepellet blev blandet til en lyseringsbuffer indeholdende 10 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,25 M saccharose, 20 mM NaF, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF og proteasehæmmere cocktail (chymostatin leupeptin, antipain, pepstatin A – Sigma-Aldrich). Cellesuspensionen blev overført til homogenisatorer (Wheaton Potter-Elvehjem) til cellelyse. Suspensionen blev centrifugeret ved 100

x g

i 5 min. ved 4 ° C blev pelletten med efterladenskaberne kasseret, og den resulterende supernatant blev centrifugeret ved 10000

x g

i 15 min. ved 4 ° C. Derefter supernatanten (cytosol fraktion) blev anvendt til måling af de udvundne aktiviteter af HK, PYK, LDH og glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PDH), og pelleten (mitochondriefraktionen) blev anvendt til måling af de udvundne aktiviteter af mt-HK og CS. Disse ekstrakter blev anvendt til Western blotting og enzymatiske aktivitetsassays. Proteinkoncentration blev udført under anvendelse af Bradford-metoden

enzymatisk aktivitet Assays Salg

Enzymatiske aktiviteter blev målt under anvendelse af følgende reaktionsmedier:. (A) til HK, 20 mM Tris-HCI pH 7,4, 10 mM MgCl

2, 1 mM β-NAD

+, 1 enhed /ml G6PDH (

Leuconostoc mesenteroides

), 0,1% Triton X-100, 2 mM ATP og 5 mM glucose. (B) For PYK, 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 5 mM MgCl

2, 50 mM KCI, 0,2 mM β-NADH, 2,5 mM ADP, 0,1% Triton X-100, 5 mM phosphoenolpyruvat, 0,5 enheder /ml lactatdehydrogenase. (C) For LDH, 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,2 mM β-NADH, 0,1% Triton X-100, 1 mM pyruvat. (D) For G6PDH, 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 5 mM MgCl

2, 0,1% Triton X-100, 2 mM glucose-6-phosphat og 0,2 mM β-NADH. Reaktionerne blev startet ved tilsætning af 20-140 ug protein for HK og 10 ug protein for PYK, LDH og G6PDH og blev udført ved 37 ° C i 5 min. Efter inkubation blev prøverne straks kogt og anbragt i is. Absorbans blev målt ved 340 nm og den værdi, der anvendes til at beregne den specifikke aktivitet af enzymerne, der er defineret som mængden af ​​substrat dannet pr milligram protein per minut. (E) For CS, 50 mM Tris-HCI pH 8,1, 0,3 mM acetyl-CoA, 0,1% Triton X-100, 0,1 mM DTNB, 0,5 mM oxaloacetat. Reaktionen blev startet ved tilsætning af 10 ug protein og udført ved 30 ° C i 5 min. Absorbans blev målt ved 412 nm. (F) For succinat-dehydrogenase (SDH), 50 mM fosfatbuffer (pH 7,4), 0,1% Triton X-100, 0,8 mM KCN, 0,06 mM 2,6-dichlorphenolindophenol (DCIPIP), 1,1 mM phenazin (PMS) og 100 ug protein reaktionen blev udført ved 25 ° C i 7 min og blev standset med 10 mM malonat. Reduktionen af ​​DCPIP blev overvåget ved 600 nm.

Western Blotting

25 ug proteinekstrakter blev separeret ved standard SDS-PAGE og overført til nitrocelulose membraner ved elektroblotting i puffer sammensat af 39 mM glycin , 48 mM Tris-base, 0,037% SDS og 20% ​​methanol. Western blotting blev udført under anvendelse primære antistoffer fortyndet i TBS, 0,1% Tween 20 og 5% BSA. Primære antistoffer mod HK I, HKII og VDAC 2 (Abcam) blev anvendt.

Oxygen Forbrug af intakt og Digitonin-permeabiliseres H460 celler

O

2 forbrug blev målt polarographically hjælp af høj -Opløsning respirometri (Oroboros Oxygraph-O2K). Efter behandlingsperioden blev mediet fjernet, og cellerne blev enten suspenderet i RPMI (11,1 mM glucose og 2 mM glutamin) eller glucose DMEM for målinger af O

2 forbrug af intakte celler, eller i respiration medium pH 7,0 (0,25 M mannitol, 10 mM MgCl

2, 10 mM KH

2PO

4, 10 mM HEPES, 0,08 mM EDTA, 1 mM EGTA og 0,1% fedtsyrefrit BSA) i evaluering af respiratoriske komplekser af permeabiliserede celler . Rutinemæssig forbrug, oligomycin-uafhængig respiration (proton lækage) og FCCP-stimuleret respiration (maksimal respiration) blev målt i intakte H460 celler som tidligere [17] beskrevet. Nab virkninger på respiratoriske komplekser af 0,003% digitonin-permeabilized H460 celler blev udført efter tilsætning af forskellige substrater /modulatorer såsom 10 mM pyruvat + 10 mM malat (kompleks I-linked substrater), 10 mM succinat (kompleks II-bundet substrat) , 0,5 uM rotenon, 100 pM ADP. Når analyse tilstand 3 fremkaldt af 2-deoxyglucose (2-DOG), blev 10 mM 2-DOG tilsat. DatLab software (Oroboros Instruments, Innsbruck, Østrig) blev anvendt til indsamling og analyse af data.

RNA Extraction og cDNA Synthesis

Total RNA blev isoleret fra H460 celler ved anvendelse TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til producentens anvisninger. Total RNA blev kvantificeret spektrofotometrisk og 1 ug blev behandlet med 1 U DNAse RNAse-fri i 30 min. ved 37 ° C. Reaktioner blev stoppet ved tilsætning af 1 pi af 20 mM EDTA og opvarmning i 10 minutter. ved 65 ° C. cDNA-syntese blev udført ved hjælp af DNAse behandlet RNA ifølge High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit fra Applied Biosystems.

Real Time PCR

Genekspression analyse blev udført ved hjælp af 7500 Real Time PCR (Applied Biosystems) og magt SYBR-GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems). Til denne test primerpar blev syntetiseret baseret på GenBank-sekvenser af mRNA. Sekvenserne af primerne er vist i tabel S1. Den sammenlignende Ct metode blev anvendt til at sammenligne ændringer i genekspression niveauer [18]. Actin blev anvendt som en endogen kontrol.

elektronmikroskopi

Celler blev vasket en gang i varm PBS og fikseret i en opløsning pH 7,2 indeholdende 2,5% glutaraldehyd, 0,1 M natriumcacodylat-buffer, post-fikseret med 1% OSO

4 (osmiumtetroxid) i 0,1 M natriumcacodylat-buffer. Bagefter blev cellerne vasket med PBS, dehydratiseret med acetone og indlejret i Epon. Ultra-tynde sektioner (70 nm) blev farvet med uranylacetat og bly citrat og observeret i et Zeiss 900 elektronmikroskop. For mitokondrier morfometri blev tyve elektronmikrofotografier taget fra hver prøve og analyseret for morfologi. Målinger af hvert mitokondrie profiler område i ultratynde snit blev fremstillet under anvendelse Billede J (NIH) software.

Kernemagnetisk ressonans (NMR) for metabolomiske Analyse

metabolomiske screening af H460 celler blev udført som beskrevet i [19] med få modifikationer. Kort fortalt blev dyrkningsmedier af ikke-behandlede og NaB-behandlede H460 celler erstattes af glucose-DMEM suppleret med D- [U-

13C] 5 mM glucose, og celler blev inkuberet i 1 time. Efter inkubering blev mediet fjernet, og ca. 3 × 10

7 celler blev suspenderet i glucose-DMEM indeholdende 10% deuteriumoxid. Endimensional

13C-spektre af intakte H460 celler metabolitter blev opnået ved 25 ° C. Spectra af H460 celler metabolitter blev erhvervet med Brucker DRX 400 MHz ved hjælp af en tredobbelt resonans sonde (TXI). Spectra behandling og analyse blev udført ved anvendelse Topspin 2.0 og metabolit opgave blev udført ved kemisk skift sammenligning af kendte metabolitter deponeret i Human metabolomet Database v 1.0.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af Graph pad Prism 5. resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SEM for

n

uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved studerendes

t

test,

envejs

ANOVA og

tovejs

ANOVA.

Resultater

natriumbutyrat og trichostatin a hæmmede proliferationen af ​​H460-celler og induceret morfologiske ændringer er forenelige med et differentiering proces

Oprindeligt vi udførte assays til evaluering NAB og TSA effekter på cellelevedygtighed at bestemme de bedste eksperimentelle betingelser til at studere HDACi virkninger på energistofskiftet uden interferenser forårsaget af cytotoksicitet. Som observeret ved fasekontrastmikroskopi, H460 celler behandlet med NaB udviste diskrete forskelle i sammenligning med kontrolceller. Morfologien observerede var forenelig med differentierede celler, hvilket tyder på, at NaB kan have modvirket regulatoriske veje, celler i tumor ville føre til dedifferentiering. Resultaterne i figur 1 viser yderligere, at behandling med 10 mM NaB producerede celler, der var mindre konfluente og er lidt mere langstrakt end de ubehandlede dem (figur 1C og D). Interessant morfologi H460 NAB behandlede celler lignede A549 celler, en mere differentieret lungecancer celle, der ikke viser morfologiske ændringer efter NaB behandling (figur 1A og B). Disse ændringer i celleform var muligvis relateret til cytoskelet reorganisering, da behandling af celler med NaB resulteret i en markant omfordeling af F-actin som afsløret ved farvning med rhodamin- mærket phaloidin (fig S1; Metode S2). Baseret på denne observation, om 10 mM NaB kunne have haft cytotoksiske virkninger på kulturerne blev rejst. Forsøg med enkle celletælling udført ved 24 og 48 timer, viste en afhængig dosis virkning på proliferation (figur S2A). Efter 24 timer, behandling med 10 mM NaB inducerede en reduktion på 50% i forhold til celler, der ikke er udsat for HDACi. Ved 48 h inkubation var antallet af levende celler ved 10 mM NaB ca. 10%. H460 celler inkuberet med NaB i koncentrationer på 1, 3 og 10 mM blev derefter testet for levedygtighed under anvendelse af MTT-assayet. Resultaterne (figur S2B) viste en moderat effekt på 24 timer hvilket gav næsten 80% levedygtighed ved 10 mM NaB og ca. 30% levedygtighed efter 48 timers inkubation med den samme koncentration. Væsentlige, opnåedes de samme resultater, når disse forsøg blev gentaget med TSA, anvendelse af koncentrationer, der spænder over 0,02-1 uM, bortset fra, at ved den højeste koncentration, TSA syntes at være mere toksiske end NaB (Figur S2D-E). Disse resultater viste, at NaB og TSA, selvom tilhører forskellige kemiske grupper, delte lignende virkninger. Selv om antallet af celler tydeligt reduceret som følge af NAB og TSA handling, kunne de vigtigste virkninger af de to inhibitorer bedst fortolkes som inhibering af proliferation, snarere end en direkte toksisk virkning. For at teste om de behandlede celler blev beskadiget af HDAC-hæmmere, blev laktat dehydrogenase release analyseret efter behandling i 24 og 48 timer med NaB og TSA (fig S2F) i flere koncentrationer. Laktatdehydrogenase frigivelse blev ikke signifikant påvirket af NaB på 24 timer (Figur S2C). Ved 48 timer og kun i en koncentration på 10 mM gjorde NaB behandling signifikant induceret lactatdehydrogenase frigivelse. Desuden inspektion af behandlede celler ved fluorescens mikroskopi efter farvning med DAPI (figur S1) afslørede intakte kerner og kromatin, et resultat, der vil argumentere mod celleskader. På grund af det brede spektrum af aktiviteter NaB, blev udført eksperimenter for at kontrollere, om behandling af H460-celler med denne inhibitor kan påvirke celle fordeling langs de vigtigste faser af cellecyklus. Disse eksperimenter blev udført ved at kvantificere behandlede og ubehandlede celler ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering. Resultaterne i figur S3A viser, at efter en 24 h behandling, de fleste celler, ca. 80%, blev fundet ved G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen med en ledsagende reduktion af S-fasen. Inkubation af celler med 0,2 pM TSA i 24 timer frembragte en tilsvarende profil (fig S3B). På baggrund af resultaterne, behandling af 10 mM NaB i 24 timer inducerede differentiering og inhibering af cellevækst, men var ikke toksisk for H460-celler. Således blev forsøg med langvarig inkubation af cellerne med HDAC-hæmmere ikke forlænges ud over 24 timer.

Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C befugtet inkubator indeholdende 5% CO

2 og fotograferet under lyse felt ved hjælp af dokumentationssystem for omvendt mikroskop Nikon TS100. (A) A549-celler ubehandlet. (B) A549-celler behandlet med 10 mM NaB i 24 timer. (C) H460 celler. (D) H460-celler behandlet med 10 mM NaB i 24 timer.

Natriumbutyrat faldt lactat frigivelse af H460-celler, reducerede ekspressionen af ​​GLUT 1 og forøget GLUT 3-ekspression

Vedrørende energistofskiftet, en af ​​de vigtigste elementer i meget proliferative celler, herunder tumorceller, er deres skift til anaerob glykolyse [3], [20], [21]. Den selektive pres, hvis det er relevant, der producerer sådan en ændret fænotype skal opnås ved reguleringsmekanismer, der en eller anden måde er i stand til at sanse energi status af cellerne. Derfor, som et første skridt til at afsløre metaboliske veje ramt af NaB og TSA, vi spurgte, om disse HDAC-hæmmere direkte kunne påvirke den glycolytiske flux af H460 celler. Denne serie af eksperimenter begyndte ved at måle mængden af ​​lactat i et dyrkningsmedium efter celle inkubering med 3 og 10 mM NaB i 24 timer. Mængden af ​​laktat frigivet blev derefter overvåget med regelmæssige mellemrum over et tidsrum på 60 min. Resultaterne er vist i figur 2A. De observerede i laktat frigivelse værdier svarede til dem observeret af Pereira da Silva [19]. Det kan ses, at NaB reduceret laktat frigivelse på en dosisafhængig måde. Et lignende mønster af inhibering af lactat frigivelse blev opnået efter inkubering af cellerne med 0,2 pM TSA i 24 timer (fig S4A). Efter 60 min. inkubation TSA-behandlede celler frigivet ca. 60% af den mængde lactat frigivet af kontroller. Laktat udsving kan forekomme som følge af forstyrrelser i enhver fase af glycolytiske vej. Under hensyntagen til, at i det nuværende arbejde forsøgene blev udført med celler i kultur, blev laktat genbrug gennem glukoneogenese udelukket. En mulig skæbne for lactat kunne være cellernes oxidativ metabolisme, naturligvis forudsat, at mitokondrier af tumorcellerne var funktionelle. Derfor, lactat frigivelse blev analyseret efter inkubering af H460-celler med NaB i 24 timer efterfulgt af tilsætning af antimycin A. Resultaterne udtrykkes som forholdet mellem lactat frigivelse i nærvær og fravær af antimycin A, er vist i figur 2B. Efter 60 min. med NaB og antimycin, laktat udgivelse nåede et plateau ud udviser en fordobling i løbet af de ubehandlede celler. 0,2 uM TSA produceret en lignende reaktion på antimycin A, efter 60 min. inkubation (figur s4b). Udover at vise, at den oxidative metabolisme er i drift i H460 celler, og angiveligt steget i HDACi behandlede celler, disse resultater støttede også den fortolkning, at NaB og TSA rent faktisk påvirker den glycolytiske flux. Imidlertid glucoseoptagelse af tumorcellerne selv kunne udgøre pacemakeren for hele glycolytiske vej. Derfor blev eksperimenter designet til at teste, om NaB haft nogen effekt på ekspressionen af ​​GLUT 1 og GLUT 3 hjælp QRT-PCR. Resultaterne i figur 2C viser, at NaB inkuberet ved 3 og 10 mM i løbet af 24 timer reducerede ekspressionen af ​​GLUT 1 (1,6 og 4, henholdsvis) og øget GLUT 3-ekspression (2,9x) i H460-celler.

Efter 24 timers behandling med 3 mM eller 10 mM NaB blev H460-celler inkuberet med glucose-suppleret medium. Portioner af supernatanter blev opsamlet hvert 10. minut og inkuberet i hidrazine buffer pH 9,2, med et overskud af NAD

+ og lactat dehydrogenase (LDH) til måling af lactat frigivet. (A) Kinetik af laktat frigivelse og repræsentation af laktat frigivelse efter 60 minutter (indsat). (B) Efter 30 minutters inkubation med glucose blev 2 pg /ml antimycin A tilsættes til kulturen. Portioner af supernatanten blev udtaget med 10 minutters mellemrum og laktat frigivet blev målt. Den lactatproduktion forhold på H460-celler i nærvær og fravær af antimycin A dokumenterer stimulering på lactat produktionen, når oxidativ phosphorylering blev inhiberet ved tilsætning af dette lægemiddel (angivet ved den sorte pil). Værdier repræsenterer middel ± SEM; N = 4, * P 0,05. (C) Celler blev behandlet med 3 mM eller 10 mM NaB i 24 timer og GLUT 1 og (D) GLUT 3-ekspression blev bestemt ved real time PCR. Actin blev anvendt til at normalisere cDNA beløb. Værdier repræsenterer middel ± SEM; N = 3, * P 0,05; ** P. 0,01

natriumbutyrat øget mitokondrier bundet hexokinase aktivitet

Den observerede reduktion i GLUT 1 og forøget ekspression af GLUT 3 (fig 2C) foreslog, at en kompenserende mekanisme til glucoseoptagelse var operativ i cellerne. Vi spurgte derfor, om HK-aktivitet, et vigtigt element i kinetikken for glukoseoptagelse og glykolytisk flux, kunne spille en rolle. For at undersøge dette, blev HK aktiviteten udføres, og udtryk for HK isoformer blev evalueret ved QRT-PCR. Figur 3A viser, at som et resultat af inkubation af H460-celler med 10 mM NaB i 24 timer, aktiviteten af ​​mitokondrier bundet HK steget dobbelt så meget som i de ubehandlede kontroller. I modsætning hertil NaB ikke påvirke aktiviteten af ​​cytosolisk HK. Den intracellulære placering af HK Jeg blev også bekræftet ved immunofluorescens. Resultaterne er vist i (Fig S5; Metode S2). I disse eksperimenter påvisning af mitofusin (MFN) I og II, proteiner, der er forankret til mitochondrier og deltage i opretholdelsen af ​​deres morfologi og fusion blev udført i det samme præparat for at tilvejebringe markører for de organeller. Sammenligning af MFN-plader (farvet i rødt) til HK (farvet i grønt), viste, at begge proteiner co-lokaliseret i mitokondrierne. Den højere enzymatisk aktivitet observeret i figur 3A kunne have afspejlet en forøget ekspression af HK induceres efter en langsigtet inkubation af celler med NaB. Denne mulighed blev undersøgt ved at analysere HK I og HK II-ekspression ved anvendelse QRT-PCR i H460 celler udsat for 3 og 10 mM NaB i 24 timer. Resultaterne er vist i figur 3B. Begge koncentrationer af NaB signifikant øget ekspression af HK I. Omvendt NaB inducerede et fald i ekspressionen af ​​HK II. I forsøgene, der måler HK II-ekspression (figur 3B), værdierne opnået efter inkubation af cellerne med 3 og 10 mM NaB var ikke signifikant forskellige. Bekræftelse af, at NaB inducerede en øget ekspression af HK Jeg blev opnået fra forsøg, der bestemmer den faktiske mængde oversat HK ved hjælp af Western blotting. Resultaterne er vist i figur 3C. Det kan ses, at behandling af H460-celler med 10 mM NaB i 24 timer tydeligt øget intensiteten og området af båndet svarende til HK I forbundet til mitokondrierne. Imidlertid blev ingen ændring observeret i mængden af ​​HKII. I modsætning hertil cytosolisk HK I og II var knap påviselige i kontrol og behandlede celler. Den større mængde HK vist i figur 3C kunne ikke forklares ved en øget tilgængelighed af mitokondrie hexokinase acceptor den VDAC, da mængden af ​​dette protein ikke ændre sig væsentligt ved behandling med NaB. Mens virkningen af ​​NaB på ekspressionen af ​​HK isoformer blev klart demonstreret, havde inhibitoren ikke påvirker aktiviteten af ​​enten PYK eller LDH. Resultaterne er vist i tabel 1. Det forhold, at 10 mM NaB ikke påvirkede disse glycolytiske enzymer styrker den ide, at HDACi er delvis selektiv i sin virkning at modulere HK aktivitet isoformer.