PLoS ONE: udgår i leverkræft en (DLC1) Bruger en roman bindingssted for Tensin2 PTB Domæne Interaktion og er nødvendig til Tumor-Smittespredningshæmmende Funktion

Abstrakt

Baggrund

Slettet i leverkræft en (DLC1) er en Rho GTPase-aktiverende protein (RhoGAP) ofte slettet og underexpressed i hepatocellulært carcinom (HCC) samt i andre cancere. Nylige uafhængige undersøgelser har vist interaktion DLC1 med medlemmer af tensin fokal adhæsion proteinfamilien i en Src homologi 2 (SH2) domæne-afhængig mekanisme. DLC1 og tensins interagere og co-lokalisere til punktformet strukturer på fokale sammenvoksninger. Men mekanismerne bag samspillet mellem DLC1 og forskellige tensins forbliver kontroversiel.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi brugte en co-immunopræcipitationsassay at identificere en tidligere udokumenteret bindingssted på 375-385 af DLC1 der overvejende interageret med phosphotyrosin bindende (PTB) domæne af tensin2. DLC1-tensin2 interaktion er helt afskaffet i en DLC1 mutant der mangler denne roman PTB bindingssted (DLC1ΔPTB). Men som det fremgår ved immunofluorescens og co-immunopræcipitering, hverken fokal adhæsion lokalisering eller interaktionen med tensin1 og C-terminale tensin-lignende (cten) blev berørt. Interessant nok blev den funktionelle betydning af denne hidtil ukendt sted udvises af den delvise reduktion af RhoGAP aktivitet, hvilket igen, svækket væksten-suppressive aktivitet af DLC1 ved dens fjernelse fra DLC1.

Konklusioner /Betydning

Denne undersøgelse har givet nye beviser, at DLC1 også interagerer med tensin2 i en PTB domæne-afhængig måde. Ud over korrekt lokalisere fokale sammenvoksninger og bevare RhoGAP aktivitet, DLC1 interaktion med tensin2 gennem denne roman omdrejningspunkt vedhæftning bindingssted bidrager til vækst-undertrykkende aktivitet DLC1

Henvisning:. Chan LK, Ko FCF, Ng IO- L, Yam JWP (2009) Udeladt i leverkræft en (DLC1) Bruger en roman bindingssted for Tensin2 PTB domæne Interaktion og er nødvendig til Tumor-Smittespredningshæmmende funktion. PLoS ONE 4 (5): e5572. doi: 10,1371 /journal.pone.0005572

Redaktør: Neil Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: Januar 21, 2009; Accepteret: April 15, 2009; Udgivet: May 15, 2009

Copyright: © 2009 Chan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret delvist af Hongkong Research Grants Rådet (HKU 7674 /06m og HKU 1 /06C) og Michael Kadoorie Cancer Genetic Research Programme for Kadoorie Charitable Foundation. I.O.L. Ng er Loke Yew professor i patologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lille, monomere G-protein Rho er klassisk defineret som en central biologisk regulator af actincytoskelettet [1] – [3]. Til gengæld dynamisk cytoskeleton omsætning styrer en lang række beslægtede biologiske reaktioner, der spænder fra definitionen af ​​celleform til fremme af cellemigration, celleadhæsion og cellespredning [4], [5]. en stigende mængde af beviser tyder på, at Rho også er involveret i at kontrollere vigtige biologiske funktioner såsom celledeling, celle invasion og gentranskription [6] – [11]. Rho er impliceret i carcinogenese, som har vist sig at være aktiveret i forskellige menneskelige kræftformer [12], [13].

Slettet i leverkræft en (DLC1)

er et tumorsuppressorgen lokaliseret på kromosom 8p21.3-22 og har vist sig at være hyppigt uudtrykt i en lang række humane cancere, herunder hepatocellulær carcinom (HCC) [14] – [23].

DLC1

koder en multiple-domæne RhoGAP protein med selektiv aktivitet mod RhoA, B og C og mindre mod cdc42 men ikke Rac1 [23], [24]. Omfattende undersøgelser har vist, at DLC1 udnytter denne RhoGAP aktivitet til at undertrykke celleproliferation [15], [18], [23], [25] – [29], udløse apoptose [25] og for at reducere cellemigrering [26], [28 ], celleinvasion og den resulterende cancermetastase i cellelinier samt musemodeller med forskellige væv oprindelser [29] – [31]. I en nylig undersøgelse, rolle DLC1 som

bona fide

tumorsuppressor i HCC blev bekræftet af en musemodel med en lever-specifik, kort hårnål RNA-medieret DLC1 knockdown [32]. Selv rolle DLC1 i at beskytte celler fra kræftrelaterede egenskaber er blevet klart, spørgsmål om dets biologiske regulering forbliver ubesvarede.

transkriptionelt,

DLC1

udtryk har vist sig at være epigenetisk tavshed i forskellige humane cancere. Hypermethylering af genet promoter region undertrykt

DLC1

gentranskription og udtryk i forskellige væv [16], [17], [19], [22], [24], [33] – [35]. Posttranslationelt, rotte DLC1 har vist sig at blive phosphoryleret med Akt-kinase [36]; Men dens forekomst i menneskelig DLC1 og dens biologiske signifikans er stadig pågældende. På den anden side, en nylig undersøgelse identificeret DLC1 mutationer i prostata- og brystcancere på bestemte tyrosin og serinrester. Disse mutationer inaktiverer DLC1 RhoGAP aktivitet gennem en ukendt mekanisme [37]. Til dato, den bedst karakteriserede regulering af DLC1 på proteinniveauet er dens interaktion med Tensin proteiner [27], [28], [38]. Tensins er fokale adhæsionsproteiner bærer Src-Homologi 2 (SH2) og phosphotyrosin bindende (PTB) domæner på deres C-termini [39]. Akkumulerende tyder på, at DLC1 interagerer med flere tensins. Generelt DLC1 udnytter en SH2 bindende motiv involverer rest Y442 at interagere med SH2-domænet i tensin1 og C-terminale tensin-lignende (cten). Mutation på Y442 forårsagede DLC1 at miste sin omdrejningspunkt vedhæftning lokalisering og tumor undertrykkende aktivitet. Denne iagttagelse indebærer, at Tensin binding er en vigtig regulerende begivenhed i den subcellulære lokalisering og tumor undertrykkende funktion af DLC1 [27], [28]. Men vi har tidligere dokumenteret interaktioner mellem DLC1 og tensin2 PTB domænet [38]. Således mekanismen for interaktion mellem DLC1 og forskellige tensins og dets biologiske implikationer er stadig kontroversielt.

I den foreliggende undersøgelse, opdagede vi en ny bindende mekanisme mellem DLC1 og tensin2 ved at identificere en udokumenteret bindingssted i DLC1, andre end SH2 bindende motiv beskrevet af andre, for interaktion med tensin2 PTB domæne. Denne nye hjemmeside blev godt bevaret i DLC familier. Vi leverer også de første beviser for tensin2 interaktion som et fælles kendetegn for DLC1 og DLC2. Bortset fra den bindende mekanisme, vi demonstrerede også den funktionelle betydning af denne roman bindingssted i reguleringen af ​​tumor undertrykkende aktivitet DLC1.

Resultater

Den tensin2 PTB Domænet blev nødvendigt for DLC1 interaktion

Vi viste, at C-terminalen tensin2 fragment, herunder SH2 og PTB-domæner (SH2-PTB i fig. 1B), var tilstrækkelig til at binde DLC1 (fig. 1A). For at vurdere betydningen af ​​de enkelte domæner i DLC1 interaktion, vi forberedt flere tensin2 deletionsmutanter herunder tensin2 ΔSH2ΔPTB, ΔSH2, og ΔPTB og testet deres bindende affinitet til DLC1 (fig. 1B). Tensin2 ΔSH2ΔPTB konsekvent viste et fuldstændigt tab af DLC1 binding. I modsætning til andre rapporter, fandt vi, at fjerne de SH2 domæne tensin2 kun delvist reduceret DLC1 binding. Interessant fjerne PTB domæne i tensin2 var tilstrækkelig til fuldstændigt at afskaffe DLC1 interaktion, hvilket indikerer, at PTB domæne er nødvendig for binding (Fig. 1C). Det er blevet rapporteret, at DLC1 Y442 og S440 danner en phospho-uafhængig binding motiv for SH2 domæne tensin1 og cten [27], [28]. Vi næste kontrolleret bevaring af disse rester i binding til tensin2 SH2 domæne. Interessant, fandt vi, at DLC1 Y442F og S440A mutanter viste kun en delvis reduktion i tensin2 binding. For at teste hvorvidt Y442 og S440 mediere interaktion med tensin2 SH2-domænet, vi kontrolleret bindingsaffiniteten mellem DLC1 og tensin2 R1165A, et SH2-domæne-mutant med nedsat genkendelse og binding af tyrosin-phosphorylerede mål. Vi fandt, at mutation i R1165A i tensin2 resulterede i et fald i tensin2-DLC1 binding. Lignende bindingsaffinitet mod R1165A blev observeret blandt DLC1 vildtype, Y442F og S440A. Dette indikerede, at Y442 og S440 kun kunne være effektiv, når SH2 domæne tensin2 var intakt (fig. 1D). Kollektivt, disse resultater støtter den konklusion, at en SH2 domæne-medieret mekanisme bidrager også til DLC1-tensin2 interaktioner.

(A) Ekspression af tensin2 SH2-PTB fragment (som beskrevet i Materialer og metoder og skitseret i fig. 1B) var tilstrækkeligt for interaktion med DLC1. HEK293T celler blev transficeret med myc-mærkede tensin2 fragment og FLAG-mærket DLC1 konstruktioner som angivet. Cleared cellelysater blev inkuberet med anti-Myc-antistof til at immunpræcipitere tensin2. DLC1 i præcipitaterne blev detekteret ved immunoblotting med anti-FLAG-antistof. (B) Skematisk diagram, der viser domæne struktur af Myc-mærkede tensin2 og dets C-terminale trunkerede mutanter. Mutanterne enten havde både SH2 og PTB-domæner (ΔSH2ΔPTB) eller havde enkelte domæne er fjernet (ΔSH2 og ΔPTB). SH2-PTB var tensin2 C-terminus, der anvendes i fig. 1A. (C) Kortlægning af DLC1 bindingssted i tensin2. HEK293T celler blev transficeret med Myc-mærket tensin2 og FLAG-mærket DLC1 konstruktioner som angivet. Cleared cellelysater blev inkuberet med anti-Myc-antistof til at immunpræcipitere tensin2. DLC1 i præcipitaterne blev detekteret ved immunoblotting med anti-FLAG-antistof. Fjernelse af tensin2 SH2-domænet (ΔSH2) resulterede i den delvise reduktion af DLC1 binding. Fuldstændigt tab af DLC1 binding blev observeret efter fjernelse af tensin2 PTB domæne (ΔPTB). Bandet intensitet i hver bane blev målt i IP og Co-IP-paneler, og aflæsninger blev normaliseret til bane 2. De relative Co-IP-til-IP-forhold var også inkluderet. (D) Karakterisering af bindingen mellem tensin2 og fokale vedhæftning lokalisering-defekt DLC1 mutanter. Vildtype tensin2 eller SH2-domænet mutant, R1165A, blev co-transficeret med DLC1 vildtype, Y442F og S440A. Cellelysatet blev underkastet immunpræcipitation med anti-Myc-antistof, efterfulgt af immunoblotting med anti-FLAG-antistof. Y442F og S440A viste en delvis reduktion i tensin2 binding, men SH2 domæne mutant, R1165A, gjorde det ikke.

Identifikation af tensin2 PTB bindende domæne i DLC1

Vi næste spørgsmålstegn som region DLC1 var påkrævet for denne PTB domæne-afhængig tensin2 interaktion. Vi havde tidligere foreslået midterområdet 375-509 af DLC1 at være den region nødvendig for tensin2 interaktion [38]. For præcist undersøge denne foreslåede bindende region, vi klonet og udtrykt forskellige DLC1 mutanter med forskellige trunkeringer oprettet inden denne region (fig. 2A). Vi fandt, at N-terminalerne af DLC1 1-400 og 1-440, begge mangler den rapporterede tensin SH2 bindingssted (Y442 af DLC1), var tilstrækkelige til at interagere med tensin2. På den anden side er gensidigt udelukkende C-terminale fragment 400-stop med et intakt SH2 bindingssted ikke var tilstrækkelig til at interagere med tensin2 (fig. 2B). Et lignende resultat blev observeret, når 450-stop, som ikke indeholdt nogen forudsagte Tensin bindingssteder, blev anvendt (fig. 2B). At give yderligere bevis på, at N-terminalen af ​​DLC1 interageret med tensin2 gennem en PTB domæne-afhængig mekanisme, kontrolleres vi samspillet mellem DLC1 1-400 og de førnævnte tensin2 deletionsmutanter. Vi observerede, at samspillet mellem DLC1 1-400 og tensin2 ikke var påvirket, selv når SH2 domæne tensin2 blev fjernet. I modsætning hertil blev interaktionen mellem de to igen afskaffes ved PTB domæne tensin2 blev fjernet, hvilket viser, at denne binding udelukkende var PTB domæne-afhængig (fig. 2C). For yderligere at lokalisere PTB bindingsstedet i DLC1 undersøgte vi binding af et panel af DLC1 N-terminus-fragmenter til tensin2. Blandt disse fragmenter, fandt vi, at DLC1 1-385 var den korteste fragment, som var i stand til at binde tensin2 (fig. 2D). Kollektivt antyder disse resultater, at region DLC1 375-385 fungerer som en tensin2 PTB-bindingssted og er nødvendig for tensin2 bindende.

(A) N-terminalen af ​​DLC1 var tilstrækkeligt til interaktion med tensin2. HEK293T celler blev transficeret med myc-mærkede tensin2 fragment og FLAG-mærket DLC1 konstruktioner som angivet. Cleared cellelysater blev inkuberet med anti-Myc-antistof til at immunpræcipitere tensin2. DLC1 i præcipitaterne blev detekteret ved immunoblotting med anti-FLAG-antistof. (B) The C-terminalen af ​​DLC1 var ikke i stand til at binde tensin2. Myc-mærket tensin2 blev co-transficeret med to FLAG-mærket DLC1 C-terminale fragmenter som angivet. Disse DLC1 C-terminalen fragmenter kunne ikke være co-immunpræcipiteret med tensin2. (C) N-terminal fragment 1-400 var involveret i tensin2 PTB binding. FLAG-mærket DLC1 1-400 kunne være co-immunpræcipiteret med tensin2. Fjernelse af tensin2 SH2-domænet påvirkede ikke affinitet til at binde til 1-400, men et intakt PTB domæne var nødvendig for binding. (D) Fin kortlægning PTB bindingssted i DLC1. Myc-mærket tensin2 blev cotransficeret med et panel af FLAG-mærket DLC1 N-terminal fragmenter. FLAG-mærket fragmenter i præcipitaterne blev påvist ved immunoblotting-analyse med anti-FLAG-antistof. Fragment 1-385 var den korteste fragment stand til at være co-immunpræcipiteret med tensin2. Bandet intensitet i hver bane blev målt i IP og Co-IP-paneler, og aflæsninger blev normaliseret til bane 2. De relative Co-IP-til-IP-forhold var også inkluderet.

Bevarelse af tensin2 PTB bindende domæne i DLC2

for at kontrollere den biologiske bevarelse af den kortlagte tensin2 bindende regioner i andre DLC familiemedlemmer, vi udførte aminosyre overensstemmelse mellem DLC1 og DLC2 [40], [41]. Vi fandt, at både SH2 og PTB bindingssteder er godt konserveret i DLC2. Tilsvarende serin (S457) og tyrosin (Y459) rester i SH2 bindende domæne blev fundet i DLC2. Den PTB bindingssted i DLC1 375-385 viste sig at matche med DLC2 400-410, hvilket tyder på en potentiel rolle i denne region i formidling PTB domæne-afhængig binding mellem DLC familiemedlemmer og tensin2 (fig. 3A). Baseret på bevarelse af Tensin bindingssteder i DLC2, vi hypotese, at DLC2 kunne interagere med tensin2. Brug co-immunopræcipitation, viste vi, at DLC2α og tensin2 interagerer, som bekræftede vores spekulation. Som med DLC1 blev RhoGAP aktivitet af DLC2 ikke påkrævet for tensin2 interaktion, som fremgår af den positive vekselvirkning mellem DLC2 RhoGAP mutanten, R740E, med tensin2 (fig. 3B). Vi spørgsmålstegn ved, om DLC2 også lokaliseret til fokale sammenvoksninger i SMMC-7721 celler. Vi fandt, at ekspression af DLC2γ inducerede alvorlige celle krympning. For at lette observationen, i stedet anvendt en funktionelt inaktiv mutant, DLC2γ R622E, der husede en mutation i sit RhoGAP domæne [41]. Vi fandt, at DLC2γ R622E kunne co-lokalisere med vinculin (fig. 3C), hvilket indikerer, at andre DLC proteiner også kan lokalisere til fokale sammenvoksninger.

(A) Skematisk viser tensin2 SH2 og PTB bindingssteder i DLC1. Inden for den minimale tensin2 bindende region 375-509, er separate elementer involveret i at mediere tensin2 binding via PTB eller SH2 mekanismer. Disse elementer er godt bevaret i DLC1 paralog, DLC2. Bevarede rester blev understreget. (B) Samspil mellem DLC2 og tensin2 i en RhoGAP-uafhængig måde. HEK293T celler blev transficeret med Myc-mærket tensin2 og GFP-mærkede DLC2 konstruktioner som angivet. Cleared cellelysater blev inkuberet med anti-Myc-antistof til at immunpræcipitere tensin2. DLC2 i præcipitaterne blev detekteret ved immunoblotting med anti-GFP-antistof. (C) GFP-DLC2γ viste omdrejningspunkt vedhæftning lokalisering i en RhoGA-uafhængig måde. Ekspression af GFP-DLC2γ induceret alvorlig celle krympning, når den udtrykkes i SMMC-7721 celler. Focal vedhæftning lokalisering af DLC2γ RhoGAP mutant R622E blev opdaget. Den endogene vinculin blev visualiseret ved anti-vinculin antistof. Scale bar = 10 um.

DLC1ΔPTB mutant viste specifik tab af tensin2 bindende, men bevaret sin omdrejningspunkt vedhæftning lokalisering

For at undersøge rollen af ​​tensin2 PTB bindende domæne af DLC1, vi klonet tre separate DLC1 mutanter, der havde minimale ændringer til følgende strukturelle elementer: Δ375-390 (ΔPTB # 1), Δ375-385 (ΔPTB # 2) og Δ380-390 (ΔPTB # 3), hver bærer en specifik intern deletion i PTB domæne (DLC1ΔPTB) (fig. 4A). For at bekræfte den rolle, som PTB domæne i tensin2 binding, vi først testet bindingen af ​​disse mutanter med tensin2. Med en co-immunopræcipitationsassay, fandt vi, at alle DLC1ΔPTB mutanter viste et underskud på tensin2 bindende (fig. 4B). Tabet af binding blev yderligere bekræftet ved reduceret co-lokalisering mellem DLC1ΔPTB # 1 og tensin2 (fig. 4C). For at løse specificiteten af ​​det tilknyttede PTB bindende motiv mod andre Tensin proteiner, udførte vi en co-immunopræcipitering assay under anvendelse af en C-terminal fragment af tensin1, 648-stop. Tensin1 648-stop dækker C-terminalen SH2 og PTB-domæner, som har vist sig at være vigtige i DLC1 bindende [28]. Vi har bekræftet deres rolle i DLC1 samspil med vores co-immunopræcipitation systemet (fig. S1). Interessant fandt vi, at tensin1 648-stop viste sammenlignelig bindingsaffinitet med DLC1 vildtype- og DLC1ΔPTB (fig. 4D). En positiv interaktion med DLC1 blev også observeret, når cten blev immunopræcipiteret i co-immunopræcipitering assay (fig. 4E). Disse observationer støtter den specifikke inddragelse af denne PTB bindende motiv med tensin2. For at løse, om fjernelsen af ​​PTB domæne vil påvirke omdrejningspunktet vedhæftning lokalisering af DLC1, vi studerede lokalisering af DLC1ΔPTB i SMMC-7721 HCC celler med immunofluorescens. Vi fandt, at DLC1ΔPTB mutanter fastholdt deres kontaktpunkt vedhæftning lokalisering, som angivet af deres co-lokalisering med kontaktpunktet-vedhæftning-associeret protein vinculin. Denne observation tydede på, at fjernelse af PTB bindingssted i DLC1 påvirker dets binding med tensin2 men bevarer sin omdrejningspunkt vedhæftning lokalisering, eventuelt via interaktion med andre tensins gennem en PTB-uafhængig bindende mekanisme (fig. 4F).

( A) Skematisk viser strukturen af ​​tre FLAG-mærket DLC1ΔPTB mutanter: Δ375-390, Δ375-385 og Δ380-390 (ΔPTB # 1-3). (B) DLC1ΔPTB viste reduceret tensin2 bindende. HEK293T celler blev transficeret med Myc-mærket tensin2 og FLAG-mærket DLC1 konstruktioner som angivet. Cleared cellelysater blev inkuberet med anti-Myc-antistof til at immunpræcipitere tensin2. DLC1 i præcipitaterne blev påvist ved immunoblotting-analyse med anti-FLAG-antistof. Fjernelse af PTB bindingsdomænet i DLC1 resulterede i tab af tensin2 binding. (C) DLC1ΔPTB viste reduceret co-lokalisering med tensin2. SMMC-7721 celler blev forbigående cotransficeret med GFP vektor eller GFP-tensin2 og angiven Myc-mærket DLC1. DLC1 blev visualiseret ved anvendelse af anti-Myc-antistof, efterfulgt af Texas Red-konjugeret sekundært antistof. Scale bar = 10 um. (D) DLC1ΔPTB kunne interagere med tensin1. HEK293T celler blev transficeret med Myc-tagget tensin2 SH2-PTB (som skitseret i fig. 1B) eller Myc-mærket tensin1 C-terminus 648-stop (som skitseret i fig. S1) og FLAG-mærket DLC1 konstruktioner som angivet. Cleared cellelysater blev inkuberet med anti-Myc-antistof til at immunpræcipitere tensin2 eller tensin1. DLC1 i præcipitaterne blev påvist ved immunoblotting-analyse med anti-FLAG-antistof. Fjernelse af PTB bindingsdomænet i DLC1 påvirkede ikke tensin1 binding. (E) DLC1ΔPTB kunne interagere med cten. HEK293T celler blev transficeret med myc-mærkede tensin2 eller Myc-tagget cten og FLAG-mærket DLC1 konstruktioner som angivet. Cleared cellelysater blev inkuberet med anti-Myc-antistof til at immunpræcipitere tensin2 eller cten. DLC1 i præcipitaterne blev påvist ved immunoblotting-analyse med anti-FLAG-antistof. Fjernelse af PTB bindingsdomænet i DLC1 påvirkede ikke cten binding. (F) DLC1ΔPTB viste omdrejningspunkt vedhæftning lokalisering i SMMC-7721 celler. SMMC-7721 celler blev forbigående co-transficeret med GFP-tensin2 og FLAG-mærket DLC1 som angivet. DLC1 blev visualiseret ved anvendelse af anti-DLC1 antistof, efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof. Den endogene vinculin blev visualiseret ved anti-vinculin antistof, efterfulgt af Texas Red-konjugeret antistof. Scale bar = 10 um.

DLC1ΔPTB viste delvis reduktion i RhoGAP aktivitet, men var tilstrækkelig til at undertrykke actin stress fiber dannelse

Aktiv RhoA er bedst kendt for sin rolle i at simulere actin stress fiber dannelse. At være en negativ regulator af RhoA, DLC1 undertrykker dannelse actin stress fiber i en RhoGAP-afhængig måde [26]. Brug actin stress fibre som en indirekte biologisk udlæsning, vi spurgte, om RhoGAP aktivitet DLC1ΔPTB mutanter vil blive berørt. Vi fandt, at DLC1ΔPTB mutant-transficerede celler udviste reduceret dannelse actin stress fiber sammenlignet med de tilstødende ikke-transficerede celler. Denne observation var magen til de af de fokale vedhæftning lokalisering-defekte mutanter af DLC1, Y442F og S440A, som hver bærer et punkt mutation i tensin SH2 bindende domæne (fig. 5A). Til direkte kvantificere RhoA inaktivering, udførte vi en Rhotekin pull-down-assay til bestemmelse af Rho-GTP aktivitetsniveauer i celler, der udtrykker forskellige DLC1 mutanter. Selvom vi fundet, at DLC1ΔPTB mutanten kunne undertrykke Rho-GTP aktivitet, var det interessant at denne undertrykkelse var mindre effektivt sammenlignet med den af ​​vildtype DLC1 (fig. 5B). På den anden side skal det bemærkes, at de Y442F og S440A mutanter viste også en reduktion i undertrykkelse Rho-GTP aktivitetsniveauer. Alt i alt, fandt vi, at DLC1ΔPTB mutanten viste en delvis reduktion i iboende RhoGAP aktivitet, men at denne aktivitet var tilstrækkelig til at undertrykke dannelse actin stress fiber.

(A) SMMC-7721 HCC celler blev transficeret med den angivne Myc tagged DLC1 konstruktioner og actin stress fibre blev farvet med TRITC-konjugeret phalloidin 1 time efter det serum induktion. Stjernen (*) markerer DLC1-transficerede celler. DLC1 Y442F, S440A, ΔPTB # 1 og # 2 kunne undertrykke dannelse actin stress fiber så effektivt som DLC1 WT. Scale bar = 10 um. (B) HEK293T celler blev transficeret med den angivne FLAG-mærket DLC1 plasmid til 24 timer. Efter transfektion blev cellerne sultes for serum i 24 timer og stimuleret med 5 uM lysophosphatidsyre i 30 minutter. Cellelysatet blev derefter opsamlet og underkastet GST-RBD pull-down for RhoA-GTP. Pull-down prøver blev udsat for SDS-PAGE analyse og immunodetekteret med anti-RhoA antistoffer. Bandet intensitet af den aktive RhoA i hver bane blev målt, og aflæsninger blev normaliseret til vektoren-transficerede celler. Den DLC1, tubulin og RhoA i total cellelysat blev immunodetekteret med anti-FLAG, anti-tubulin og anti-RhoA antistoffer hhv. (C) HeLa-celler blev transficeret med de anførte DLC1 konstruktioner og selekteres med G418 i 2 uger. De dannede kolonier blev visualiseret ved krystalviolet-farvning. Den gennemsnitlige forskel i kolonidannelse effektivitet mellem grupperne blev fundet at være statistisk signifikant (

s

0,001; envejs ANOVA test).

DLC1ΔPTB viste reduceret vækst-undertrykkende aktivitet

evne DLC1 at undertrykke tumorvækst er veldokumenteret. Vi spørgsmålstegn ved, om de førnævnte DLC1ΔPTB mutanter viste nogen forskel i DLC1-induceret vækst undertrykkelse. I en HeLa celle kolonidannelse assayet vildtype DLC1 undertrykte signifikant kolonidannelse sammenlignet med vektorkontrol. I modsætning hertil ektopisk ekspression af DLC1ΔPTB mutanter resulterede i en signifikant øget antal kolonier sammenlignet med vildtype-DLC1 (fig. 5C). Denne observation viser, at selv når DLC1ΔPTB viser korrekt fokal adhæsion lokalisering, tab af dette tensin2 PTB bindende motiv vil resultere i nedsat vækst suppression sandsynligvis på grund af den delvise reduktion i RhoGAP aktivitet. Det er sandsynligt, at ordentlig tensin2 PTB bindende bidrager til DLC1-induceret væksthæmning.

Discussion

DLC1 er blevet vist at udøve biologiske funktioner ad den pågældende klassiske tumorsuppressorgener. De forskellige tumor-undertrykkende virkninger af DLC1 er stærkt afhængig af tilstedeværelsen af ​​et funktionelt RhoGAP domæne [26], [28]. Imidlertid har flere undersøgelser vist, at RhoGAP aktivitet alene ikke er tilstrækkelig til sin tumor-undertrykkende funktion [26] – [28], [42]. Forrige strukturel analyse fra vores gruppe forudsat de første beviser, at disse funktioner DLC1 kun kunne genoprettes, når området mellem SAM og RhoGAP domænerne blev medtaget [26]. Identifikationen af ​​tensin2 som det første bindende protein, der interagerer med dette funktionelt vigtige region yderligere antydet forholdet mellem tensin2 interaktion og DLC1 funktion [38]. Denne opfattelse blev yderligere understøttet af opdagelsen af ​​cten og tensin1 som bindende partnere DLC1 i efterfølgende undersøgelser, hvilket indebærer, at det er biologisk vigtigt for Tensin familiens proteiner for at kunne samarbejde med DLC1 [27], [28].

Vi har tidligere foreslået, at DLC1 375-509 er den minimale bindende region tensin2. Denne region dækker de vigtigste rester Y442 og S440, som blev foreslået af andre undersøgelser for at udgøre en SH2 bindingssted for cten og tensin1 [27], [28]. Men vi kunne ikke give direkte bevis for, at tensin2 SH2 domæne var tilstrækkeligt for DLC1 binding [38]. I denne undersøgelse, og vores tidligere rapport, vores resultater konsekvent viste, at tensin2 PTB, snarere end SH2, domæne direkte interageret med DLC1.

Der er et par mulige forklaringer på de afvigende resultater. Første, selvom SH2 og PTB-domæner i Tensin proteiner har en høj sekvenshomologi, kan forskelle i deres sekvenser resultere i forskellige bindende mekanismer for DLC1 og andre tensin familiemedlemmer. For det andet blev forskellige bindingsanalyser bruges af forskellige grupper til at studere mekanismen for binding mellem tensin og DLC1. For eksempel gær-baserede bindende og GST pull-down assays blev anvendt af Liao et al. og Qian et al., henholdsvis mens

in vivo

co-immunopræcipitation blev ansat i vores nuværende undersøgelse. Tredje blev C-terminale fragmenter af tensin der indeholdt enten en eller begge af SH2 og PTB-domæner anvendes i kortlægning af DLC1 bindingssted i undersøgelserne af Liao et al. og Qian et al. Denne eksperimentelle design antages, at N-terminus region af tensin protein hverken var involveret i binding eller bidraget til den normale protein foldning af C-terminale region.

I den foreliggende undersøgelse, giver vi den første bevis på, at specifik fjernelse af SH2 og PTB domæner i tensin2 påvirker DLC1 binding i forskelligt omfang (fig. 1C). At dokumentere, at PTB domænet spiller en kritisk rolle i DLC1-tensin2 binding, vi kortlagt PTB-bindende domæne i N-terminalen af ​​DLC1 (fig. 2), og bekræftede sin rolle ved at karakterisere de DLC1ΔPTB interne deletionsmutanter (fig. 4A). Vi identificerede en udokumenteret område 375-385 af DLC1 som PTB-domain-bindingssted og DLC1-tensin2 interaktion blev tabt, når denne region blev fjernet (fig. 4B). Det er velkendt, at PTB domænet genkender et NPXY motiv, som illustreret i dets binding med integrin β [43]. Imidlertid var dette motiv findes ikke i vores kortlagt region i DLC1, hvilket indebærer, at tilstanden af ​​PTB-medieret interaktion er en sandsynligvis atypisk. Selvom DLC1ΔPTB viste tab af tensin2 binding, var det stadig i stand til at lokalisere til fokale adhæsioner (fig. 4C og 4F). Desuden fandt vi, at PTB domæne var nødvendig for fokal adhæsion lokalisering af tensin2 (data ikke vist). Således, ud over at fungere som fysisk bindingssted for DLC1, PTB domæne kan også være vigtigt for at bringe tensin2 i umiddelbar nærhed af DLC1 ved fokale adhæsioner og lette deres interaktion. Kollektivt, disse resultater tyder på, at DLC1 udnytter region 375-385 i formidlingen tensin2 binding, mens den udnytter Y442 og S440-rester for fokal vedhæftning målretning (fig. 6).

DLC1 blev målrettet til de centrale sammenvoksninger og krævede rester Y442 og S440. På fokal adhæsion, foruden SH2 bindende mekanisme, DLC1 udnyttet region 375-385 at interagere med PTB domæne af tensin2, som angivet ved den stiplede linje. Dannelsen af ​​denne binding kompleks var vigtigt for DLC1 at udøve vækst-undertrykkende funktion.

Det er i øjeblikket ukendt, om den foreslåede tensin PTB bindende domæne i DLC1 er involveret i binding med andre tensins. Dette er endnu ikke undersøgt. Der har været rapporter om, at ekspressionen af ​​tensin1 PTB domænet er tilstrækkelig til interaktion med DLC1. Også, slette hele tensin SH2-bindende motiv (440-448), i stedet for at indføre en Y442F punktmutation i DLC1, er tilstrækkelig til interaktion med tensin1 [28]. Dette indikerer, at PTB-afhængig binding kan være til stede mellem DLC1 og tensin1, men spiller en subtil rolle, i modsætning til DLC1 og tensin2 interaktion. Baseret på vores nuværende resultater, konkluderer vi, at PTB bindende mekanisme er tensin2-specifik (fig. 4B, 4D og 4E), mens andre tensins udnytte en SH2 bindende mekanisme [27], [28]. Mulig kompensation fra andre tensins kan forklare, hvorfor DLC1ΔPTB kan lokaliseres til grupper sammenvoksninger i fravær af tensin2 interaktioner. Desuden fandt vi, at DLC1ΔPTB viste en delvis reduktion RhoGAP aktivitet, hvilket resulterede i en delvis reduktion i væksten undertrykkelse (fig. 5B og 5C).

En begrænsning i vores nuværende undersøgelse er brugen af ​​ektopisk udtrykt tensin2. Påvisning af endogen tensin2 ikke var muligt, da tensin2 antistof der ikke var tilgængelige i vores laboratorium. Samspil mellem endogen DLC1 og tensin2 skal undersøges for at afspejle deres bindende i selve biologisk sammenhæng. På den anden side, udførte vi foreløbig kvantitativ realtids-PCR-analyse for at bestemme mRNA ekspressionsniveauer af DLC1 og tensin2 i humane HCC-væv. Vores upublicerede data viste, at underekspression af både DLC1 og tensin2 var korreleret med kortere samlet overlevelse sammenlignet med dem, der havde normal udtryk for enten eller begge gener, støtter muligt funktionelt sammenslutning af DLC1-tensin2 med hepatocarcinogenese.

I alt vi har identificeret en ny tensin2 PTB bindingssted i DLC1 og demonstreret sit engagement i tensin2 interaktioner. Selv om fjernelse af PTB bindingssted ikke påvirkede omdrejningspunktet vedhæftning lokalisering, det delvist reducerede RhoGAP aktivitet DLC1, som svækkede dens vækst undertrykkende funktion.