PLoS ONE: cytosolisk chaperoninet FTT /TRiC og Kræft Cell Proliferation

Abstrakt

Den molekylære chaperone FTT /TRiC spiller en central rolle i at opretholde cellulær proteostasis da det formidler foldning af de store cytoskeletale proteiner tubulins og aktinerne . FTT /TRiC er også involveret i den oncoproteinet cyklin E, Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein, cyklin B og p21

ras folde som kraftigt antyder, at det er involveret i celledeling og tumor tilblivelse. For at vurdere inddragelsen af ​​FTT /TRiC i tumor tilblivelse, vi kvantificeret sine ekspressionsniveauerne og aktivitet i 18 cancer, en non-cancer humane cellelinjer og en ikke-cancer human lever. Vi viser, at ekspressionsniveauerne af CCT /TRiC i cancercellelinier er højere end i normale celler. Men CCT /TRiC aktivitet ikke altid hænger sammen med dens ekspressionsniveauer. Vi dokumenteret derfor ekspressionsniveauerne af FTT /triske modulatorer og partnere PhLP3, Hop /P60, prefoldin og HSC /Hsp70. Vores analyse viser en funktionel samspil mellem molekylære chaperoner, der kan tegne sig for en præcis graduering af FTT /TRiC aktivitet i celledeling gennem ændringer i de cellulære niveauer af prefoldin og /eller HSC /p70 og FTT /TRiC klient protein tilgængelighed. Vores observation og tilgange bringe nye indsigter i rollen som FTT /TRiC-medieret proteinfoldning maskiner i kræftcellen udvikling

Henvisning:. Boudiaf-Benmammar C, Cresteil T, Melki R (2013) cytosolisk chaperoninet CCT /TRiC og cancercelleproliferation. PLoS ONE 8 (4): e60895. doi: 10,1371 /journal.pone.0060895

Redaktør: Anna Alisi, Bambino Gesù Børnehospital, Italien

Modtaget: November 22, 2012; Accepteret: 4 Marts 2013; Udgivet 16. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Boudiaf-Benmammar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den franske undervisningsministerium, forskning og teknologi, det algeriske ministerium for videregående uddannelse og forskning, Centre National de la Recherche Scientifique og University Paris Sud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for at sikre en effektiv foldning af spirende polypeptidkæder i en yderst overfyldt miljø celler har designet en klasse af proteiner kaldet molekylære chaperoner [1], [2]. Disse proteiner binder, under eller efter translation, udfoldet, delvist foldet og forkert foldede polypeptidkæder, ofte gennem eksponerede hydrofobe segmenter [3]. Binding af molekylchaperoner til deres kunder modvirker deres iboende sammenlægning tilbøjelighed og tillader en polypeptid kæde til at søge på folde landskabet og nå sit indfødte, funktionelle tilstand [4]. Molekylære chaperoner styrer også protein homøostase under normale og stress betingelser. De udgør derfor et kvalitetsstyringssystem til opretholdelse af naturligt forekommende protein kropsbygning, translokation af proteiner over membraner og normal protein omsætning [2].

Inddragelsen af ​​molekylære chaperoner i cancer udvikling og progression er underlagt aktiv debat. Flere undersøgelser rapporterer, at chaperoner findes ved forhøjede niveauer i mange solide tumorer og blodkræftsygdomme [5], [6]. Deres ekspression kan delvis konto for evnen af ​​maligne celler til at opretholde protein homeostase i ugunstige hypoxiske og sure mikromiljø af tumoren. Gennem deres samspil med centrale regulatoriske proteiner, molekylære chaperoner regulere cellecyklus og beskytter cellerne fra programmeret død. De fremmer tumorcelleoverlevelse, vækst og metastase, selv i vækstfaktor belastede betingelser, ved at tillade fortsat proteintranslation og cellulær proliferation [7]. Endelig er molekylære chaperoner betragtes kritisk for at tillade tumorceller at tolerere genetiske ændringer, der ellers ville være dødelige [5]. Faktisk molekylære chaperoner såsom Hsp90 fungere som biokemiske buffere for de mange genetiske læsioner, som er karakteristiske for de fleste menneskelige kræftformer og drev onkogenese [8].

Molekylære chaperoner er allestedsnærværende proteiner, der er produkter af forskellige, stærkt konserveret , genfamilier. De klassificeres i forskellige kategorier baseret på deres molekylmasser, cellulære fordeling og funktion [9]. Hsp60 familiemedlemmer er særpræget ved, at de danner høj molekylvægt ringformede proteinkomplekser. Disse partikler er sande folde nanomaskiner næret af ATP og betegnes chaperoniner. To klasser af chaperoniner er blevet defineret [10]. De chaperoniner udgør gruppe I udgøres af en enkelt polypeptidkæde og har en 7 fold symmetri. Denne gruppe omfatter GroEL [11] og dens mitokondrie modstykke cpn60. De chaperoniner udgør gruppe II har en 8 fold symmetri og omfatter archaebacterial thermosomes og det cytosoliske chaperonin contaning t-kompleks polypeptid 1 (FTT) også kendt som TCP1 ring kompleks (TRiC) [12]; CCT /TRiC er en 16-underenheder kompleks sammensat af to back-to-back stablet ringe, der hver indeholder otte forskellige subunits af ca. 60 kDa (α, β, γ, δ, ε, ζ-1, η og θ) [13] ; [14]. FTT /Tric samarbejder med protein cofaktorer at folde mål klient proteiner. Hop /p60, en cofaktor for Hsp70 og Hsp90, øger foldning effektivitet ved at lette nukleotid udveksling [15]. Phosducin lignende protein 3 (PhLP3) er en negativ modulator af foldning og fastholder klient protein adgang til foldningen kammer [16]. Endelig den molekylære chaperone prefoldin (PFD) modulerer også FTT /TRiC aktivitet som det leverer klient proteiner [17], [18]

FTT /TRiC medierer foldning af tubulins og aktinerne [19].; [20] herunder centrosomal γ-tubulin og centractin [21]. Den voksende liste af FTT /triske kunder omfatter proteiner involveret i tumor genesis med cyklin E [22], Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor protein [23], cyklin B og p21

ras [24]. Ved siden af ​​sit krav om aktinerne og tubulins folde, der er bevis for, at FTT /TRiC kraftigt opreguleret under G1 /S faseovergang af cellens cyklus igennem til den tidlige S-fasen, og at denne begivenhed er kontrolleret på mRNA niveau [ ,,,0],25]. Endvidere er nedregulering af CCTα ekspression forbundet med en inhibering af celleproliferation, en formindskelse i cellelevedygtighed, cellecyklusstop og cellulær apoptose [26].

Tilsammen disse observationer antyder kraftigt, at FTT /tric spiller en central rolle i cellecyklusprogression og at det kunne være impliceret i tumor udvikling.

Her er vi tal på i) ekspressionsniveauerne af FTT /TRiC og dets partnere, herunder HSC 70 og Hsp70 (HSC /p70), PhLP3 , Hop /P60, prefoldin og DNAJB1 i kræft humane cellelinjer og ii) dens aktivitet i cellen ekstrakter. Samlet set ekspressionsniveauerne af FTT /TRiC i kræft cellelinjer er højere end i normale celler. Påfaldende dog FTT /TRiC aktivitet ikke altid korrelerer med dens udtryk niveauer. Vi dokumenteret derfor ekspressionsniveauerne af CCT /tric modulatorer. Vores analyse bringer nye indsigter i rollen som protein folding maskiner i kræftcellen udvikling.

Materialer og metoder

humane cellelinjer og celleekstrakter Forberedelse

Femten menneskelige kræftceller , afledt af kræft i forskellige organer og viser karakteristiske egenskaber og en ikke-kræft cellelinie etableret ud fra normal føtal lungevæv blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). Tre andre cellelinjer kom fra andre kilder: SH-5YSY blev købt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA), OVCAR-8, et NCI-cellelinje, blev leveret af Dr. Liscovitch (Rehovot, Israel) og SF268 blev opnået fra national Cancer Institute (NCI Frederick, MD, USA). MIA-Paca-2, MRC5-SV2, HepG2 og KB-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). HCT116, SK-OV3, HT-29, K-562, HL-60, PC3, HeLa, MCF-7, MDA-MB-435s, MDA-MB-431, A549, SF-268, HCT15 og OVCAR-8 celler blev rutinemæssigt dyrket i 10% FBS /RPMI 1640 suppleret med penicillin-streptomycin, fungizon og glutamin. SH-5YSY celler blev dyrket i en blanding af DMEM og Hams F12 medium suppleret med 10% FBS, glutamin og penicillin-streptomycin. Cellelinierne egenskaber og referencer er angivet i tabel 1.

Celler blev talt, vasket og høstet. Celletætheden blev indstillet til 24.10

7 celler /ml i lysispuffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid). Suspenderede celler blev anbragt på is og underkastet 10 cyklusser af lydbehandling bestående af et 1 sekund impuls med en udgangseffekt på 10 watt i afstand af 15 sekunder med en Branson ultralydsapparat 150, mens den humanlever fragment (HNCL), hvis oprindelse og indsamling forud for 1995 efter den etiske komité af Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale er beskrevet i [27], [28], blev homogeniseret på is ved hjælp af en Kontes Teflon-glashomogenisator. Komplet cellelyse blev kontrolleret ved mikroskopi og ionstyrken af ​​ekstrakterne blev justeret til 140 mM Tris /HCl, pH 7,5, 14 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 70 mM KCI, 4 mM ATP og 10% glycerol (vol /vol). Ekstrakterne blev klaret ved centrifugering ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og proteinkoncentrationen i supernatanterne blev bestemt ved Bradford-metoden [29]. Kaninreticulocytlysat (RRL) fremstillet som tidligere beskrevet [30] blev anvendt som kontrol i alle forsøg.

Antistoffer

Mus polyklonale antistoffer mod human PhLP3 (anti TXNDC9), Hop /p60 ( anti STIP1) og PFD5 (anti PFDN5) blev indkøbt fra Abnova (Ontario, Canada). Muse monoklonalt antistof mod Hsc70 /p70 blev indkøbt fra StressGen (Victoria, BC, Canada). Kanin polyklonalt antistof mod DNAJB1 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA). Kanin polyklonale antistof mod CCTα blev genereret i laboratoriet [24].

Western Blotting

En standard sortiment bestående CCTα (100, 50, 25, 12,5 ug /m), PhLP3 (0,5, 0,25, 0,125 ug /ml), PFD5 (25, 12,5, 6,25 ug /ml), Hop /p60 (6, 3, 1,5 ug /ml) og Hsp70 (80, 40, 20, 10 ug /ml) blev løst ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) ved anvendelse af 12% polyacrylamidgeler [31] med to fortyndinger (1/4 eller 1/8 og 1/16) af hver celleekstrakt og blottet på nitrocellulosefilter [32]. Hvert filter blev probet successivt med de fem primære antistoffer efter membran regenerering efter inkubation ved 50 ° C i 62,5 mM Tris /HCI pH 6,8, 100 mM β-mercaptoethanol og 2% SDS (v /v). Reaktive bånd blev visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af Pierce ECL Western blotting substrat (Thermo Scientific, Rockville, USA) ifølge producentens anbefalinger og den kemiluminescerende signal blev registreres digitalt med en LAS-3000 luminescerende billedanalysator (Fujifilm). Alle forsøg blev kørt i mindst to eksemplarer for biologiske gentagelser, svarende til uafhængige cellekulturer og middelværdier og standardafvigelser blev afledt fra de to uafhængige målinger. Mængderne af FTT /TRiC, PhLP3, PFD5 og Hop /p60 i de forskellige ekstrakter blev kvantificeret ved at sammenligne luminescens i celleekstrakterne som i standarderne for kendt koncentration elektroforese på den samme gel.

Folding aktivitet Assay

[

35S] -mærket udfoldet β-actin målprotein blev genereret ved ekspression i

E. coli

og oprenset som beskrevet af Gao et al. [33]. Refoldningen aktiviteter celleekstrakter, RRL og HNCL blev analyseret og analyseret efter fortynding fra denatureringsmiddel af radioaktivt mærkede β actin i celleekstrakter, RRL og HNCL fortyndet i folde buffer (80 mM MES /KOH, pH 6,8, 1 mM MgCl

2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 1 mM ATP). Proteinkoncentrationen inden ekstrakterne var 15 mg /ml eller 2,5 mg /ml. Reaktionsprodukterne blev resolveret på 6% ikke-denaturerende polyacrylamidgeler. De geler blev derefter tørret og udsat for et lager phosphor screen (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) og udviklet på en Storm Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Et eksempel på en FTT-medieret udfoldet β-actin Genfoldningsreaktionen vist i figur S1. Alle forsøg blev kørt in duplo. Middelværdierne og standardafvigelsen var afledt af to uafhængige målinger.

celleekstrakter Immuno-depletion

To vilkårligt valgte celleekstrakter (MIA-PaCa-2 og OVCAR-8) og kontrollen blev immuno-udtømt ved hjælp af enten anti PhLP3, anti-Hop /p60, anti PFD5, anti-HSC /p70 eller anti-CCTα antistoffer. Ekstrakterne blev inkuberet i 2 timer ved 4 ° C under forsigtig bevægelse med passende antistof, og protein-antistof-komplekser blev sedimenteret efter inkubation natten over ved 4 ° C med protein A Sephrose CL-4B-perler (GE Healthcare) ækvilibreret i 50 mM Tris HCI, pH 7,0. Supernatanterne blev udvundet, proteinkoncentrationen blev målt, og evnen hos immuno-depleteret ekstrakt til refoldning [

35S] -mærket udfoldet β-actin blev analyseret

in vitro

.

billedanalyse, statistisk analyse og beregninger

Digitale billeder opnået med Fujifilm LAS-3000 analysator og Storm Phosphorlmager blev analyseret ved hjælp af softwaren NIH billede (US National Institute of Health, Bethesda, MD).

intensiteter afledt af billedanalyse blev analyseret ved hjælp af to-prøve, ensidet uafhængig Students t-test.

antallet af FTT /Tric og PFD partikler per celle stammer fra koncentrationsmålinger hjælp af følgende ligning : hvor n er antallet af FTT /TRiC eller PFD partikler, C, mængden af ​​FTT /TRiC eller PFD estimeret ud fra Western blot målinger ved sammenligning med kendte mængder af CCTα eller PFD5 i mg /ml, C

N, er antallet af celler /ml, Mw, er molekylvægten af ​​FTT /Tric eller PFD partikler (750000 for FTT /TRiC, 100.670 for PFD) og

N

konstant af Avogadro (6,023 × 10

23).

Resultater

FTT /TRiC Expression og Aktivitet

FTT /TRiC er strengt nødvendigt til foldning af de to vigtigste cytoskeletale proteiner aktinerne og tubulins

i vivo

. Men lidt om sit udtryk og aktivitet i kræftceller. Vi sammenlignede ekspressionsniveauerne og aktivitet af FTT /TRiC i 18 cancercellelinier fra forskellige organer og en normal cellelinje (MRC5-SV2), en human ikke-cancer leverhomogenat (HNCL) og kanin-reticulocytlysat (RRL), hvor CCT /TRiC vides at blive udtrykt og særdeles aktiv. Kvantificeringen af ​​CCT /TRiC på Western blots (figur 1) viste, at den gennemsnitlige koncentration af FTT /TRiC i cancer celleekstrakter er omkring 5 ug per mg totale proteiner og ca. 3-4,10

8 FTT /Tric partikler ( se eksperimentelle procedurer sektion for beregning tabel S1 til FTT /TRiC partikler nummer i de forskellige cellelinjer), undtagen for MIA-PaCa2, MRC5-SV2, MDA-MB-231 og HL-60 cellelinjer, hvor FTT /triske beløb 2 til 3 fold gennemsnitsværdien. I HNCL og RRL, mængden af ​​FTT /TRiC er halvdelen af ​​gennemsnittet målt for cancercellelinjer. Det er også værd at bemærke, at dette beløb er det laveste (1.6μg /mg totale proteiner) i den menneskelige neuroblastom SH-SY5Y cellelinje. FTT /TRiC udtryk synes således opreguleret i alle kræftceller, især i MIA-PaCa2, MDA-MB-231 og HL-60 cellelinjer (figur 1). For at bestemme om CCT /TRiC ekspression korrelerer med aktiviteten vi kvantificeret radioaktivt mærket, denatureret, actin foldning i celleekstrakterne suppleret med Mg

2+ og ATP som beskrevet i afsnittet med eksperimentelle procedurer. Resultaterne, der præsenteres i figur 2 viste, at FTT /TRiC aktivitet ikke altid korrelerer med dens udtryk niveau. Faktisk mens foldningen aktivitet af FTT /TRiC i MIA-PaCa2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s cellelinje ekstrakter var stærkt overens med de vigtige niveauer af CCT /TRiC inden ekstrakterne blev det fundet meget lav i HL-60-cellelinje ekstrakt, dvs. celle linje, der indeholder de højeste mængder af FTT /TRiC, sammenligne figur 1 til figur 2.

mængden af ​​FTT /TRiC i 18 cancer og en normal (MRC5-SV2) cellelinier ekstrakter, fremstillet som beskrevet i afsnittet med eksperimentelle procedurer, en ikke-cancer leverhomogenat (HNCL) og kanin-reticulocytlysat (RRL) blev bestemt ved sammenligning CCTα intensitet målt for celleekstrakter fortyndet 4 og 16 gange med den for kendte mængder CCTα (100, 50, 25, 12,5 ug /ml) migrerede på den samme 12% SDS polyacrylamidgel ved western blotting. De gennemsnitlige mængder af FTT /TRiC i de forskellige ekstrakter udtrykkes som en funktion af de totale proteiner indhold af ekstrakterne.

FTT /TRiC folde aktivitet i de 18 cancer cellelinjer, den normale cellelinje MRC5-SV2 og det humane ikke-kræft leveren blev analyseret under anvendelse [

35S] -mærket, denatureret β-actin foldning som beskrevet i afsnittet med eksperimentelle procedurer. Reaktionsprodukterne blev analyseret på 6% ikke-denaturerende polyacrylamidgeler. CCT /TRiC specifik aktivitet, afledt af kvantificering af p-actin bands intensiteter udtrykkes som en funktion af den samlede proteinkoncentration. De billeder, der er optaget med et phosphorimager for [

35S] -mærket actin genfoldning reaktioner i foldningsbufferen, RRL, MIA-PACA-2 og HeLa celleekstrakter løst på en nativ 6% polyacrylamidgel, er vist i det indsatte.

Angivelse af FTT /TRiC aktivitet modulatorer

Som ekspressionsniveauet af FTT /TRiC ikke korrelerer med aktiviteten og for bedre at forstå, hvordan sidstnævnte moduleres i kræftceller, vi kvantificeret FTT /Tric aktivitet modulatorer, prefoldin, Hop /P60 og PhLP3, i cellelysaterne. Dataene i figur 3A viser, at Hop /p60 fusion inden for de cellelinjer, vi brugte ca. 0,4 pg /mg totale proteiner i gennemsnit. Hop /p60 vises under-udtrykt i de fleste af cellelinierne vi bruges når dens ekspressionsniveau er normaliseret til at i den ikke-cancer leverhomogenat (HNCL) anvendt i hele denne undersøgelse (figur S2). Hop /p60 udtryk er den højeste i MRC5-SV2, HCT116, PC3 og HL-60 cellelinjer, som det er i HNCL.

Mængden af ​​(A) Hop /p60, (B) PhLP3 og (C ) PFD i 18 cancer og en normal (MRC5-SV2) cellelinjer ekstrakter, en ikke-cancer leverhomogenat (HNCL) og kanin-reticulocytlysat (RRL) blev bestemt ved sammenligning af kemiluminescens-signal registreres for Hop /p60, PhLP3 og PFD i celleekstrakter fortyndet 4 og 16 gange med den for kendte mængder af proteiner på samme Western blots.

FTT /TRiC udtryk er også høj i MRC5-SV2 og HL-60. Overraskende dog eftersom Hop /p60 er en nukleotid udveksling faktor forventes at favorisere CCT /TRiC-medieret foldning, foldningen aktivitet af MRC5-SV2 og HL-60 celleekstrakter er lav. Tilsvarende mens FTT /TRiC og Hop /P60 koncentrationer er relativt høje i HCT116 celleekstrakter, folde aktivitet ekstrakt er blandt de laveste. Vi konkluderer ud fra disse observationer, at udtrykket niveau Hop /p60 ikke er eneansvarlig for øget eller nedsat FTT /TRiC-medieret folde effektivitet. Vi dokumenteret derfor PhLP3, den funktionelle antagonist af Hop /p60, udtryk i kræftceller vi brugte. PhLP3 udtryk varierer betydeligt fra den ene celle linje til en anden. Proteinet kunne ikke påvises i 11 cancercellelinier vi bruges og på omkring 0,03 ug /mg totale proteiner (figur 3B) i 8 andre cellelinjer. Når påviselig, PhLP3 vises overudtrykt når dens udtryk niveauet er normaliseret til at i HNCL (figur S2). Også her var vi ikke i stand til at korrelere en høj PhLP3 udtryk niveau med en lav FTT /TRiC aktivitet. Faktisk PhLP3 koncentrationen er blandt de højeste i PC3 og MDA-MB-231 celleekstrakter (figur 3B), hvor FTT /TRiC aktivitet er blandt de højeste (figur 2).

Vi endelig kvantificeret prefoldin ekspressionsniveauerne som dette co-chaperone hjælper FTT /TRiC i buffer klient protein koncentrationer i cytosolen og levere dem til FTT /TRiC. Prefoldin varierer koncentrationen lidt fra en celle til en anden og er i gennemsnit 2 ug /mg totale proteiner (figur 3C). Prefoldin udtryk niveau er dobbelt lavere end gennemsnittet i MIA-PaCa2, MRC5-SV2, HCT116, SH-SY5Y og SK-OV-3 celleekstrakter og er betydeligt højere end gennemsnittet i HL-60, K562, HeLa, KB, MDA -MB-231 og MCF7 celleekstrakter. Således eksisterer en sammenhæng mellem CCT /TRiC aktivitet og ekspressionsniveauet af prefoldin. Den højeste prefoldin udtrykkes den laveste aktivitet FTT /TRiC er. Endelig er det værd at bemærke, at PFD udtrykkes til højere niveauer i alle cancercellelinjer sammenlignet med HNCL (figur S2). Da dette protein er en del af et kompleks bestående af 6 subunits, det gennemsnitlige antal aktive partikler per celle varierer fra 5 til 24 10

8 (tabel S1).

Den manglende korrelation mellem forøget eller nedsat ekspressionsniveauer af Hop /p60 og PhLP3 og FTT /TRiC aktivitet tyder på, at denne ikke er effektivt moduleres af disse polypeptider. For at sikre dette er tilfældet, og bedre at forstå hvordan Hop /p60 og PhLP3 påvirke FTT /TRiC folde aktivitet, vi undersøgte konsekvenserne af immuno-nedbrydende Hop /p60 eller PhLP3 fra to vilkårligt valgte celleekstrakter: MIA-PaCa-2 ( Figur 4A) og OVCAR-8 (figur 4C) på CCT /TRiC aktivitet. Immunoaktiviteten udtømning af Hop /p60 havde ingen virkning på CCT /TRiC aktivitet (figur 4B, D). I modsætning hertil PhLP3 immuno-depletion fra en celleekstrakt, hvor det er væsentligt udtrykkes, såsom OVCAR-8, førte til et dramatisk fald i CCT /TRiC aktivitet (figur 4B, D). Dette tyder stærkt på, at PhLP3 er stærkt involveret i modulerende FTT /TRiC aktivitet.

FTT /TRiC folde aktivitet i (A) MIA-Paca-2 og (C) OVCAR-8 celleekstrakter før og efter FTT /Tric , Hop /p60 eller PhLP3 immunodepletion blev analyseret ved hjælp af [

35S] -mærket, denatureret β-actin. Proteinkoncentrationen af ​​MIA-PaCa-2 og OVCAR-8 celleekstrakter var 2,5 og 15 mg /ml. Nativ β-actin band intensitet blev målt under anvendelse af en Phosphorlmager. Mængden af ​​indfødte β-actin målt efter immunodepletion udtrykkes som en brøkdel af det beløb målt for celleekstrakterne før immunodepletion i (B) MIA-Paca-2 og (D) OVCAR-8 celleekstrakter.

HSC /p70 modulerer FTT /TRiC Aktivitet

FTT /TRiC samarbejder med andre molekylære chaperoner [2]. HSC 70 og Hsp70 (HSC /p70) er blevet vist at fremme klient proteiner binder til FTT /TRiC f.eks [34], [35]. For at afgøre, om HSC /p70 ekspressionsniveauerne korrelerer med den af ​​FTT /TRiC aktivitet blev mængden af ​​HSC /p70 i kræftcellen linje ekstrakter vi brugte hele denne undersøgelse kvantificeret ved Western blotting. De dublet bands observeret på blots stammer fra konstitutive (Hsc70, 73 kDa) og stress-induceret formular (Hsp70, 72 kDa) i chaperone. Hsp70 vises overudtrykt i cellelinjer, vi brugte som bevidnet af intensiteten af ​​de letteste bånd på Western blots. Dette tyder stærkt på, at stress-associerede form af chaperonen induceres i cancercellelinier. Mængden af ​​HSC /p70 i de forskellige celleekstrakter vi målte er 5 ug /mg totale proteiner i gennemsnit undtagen MRC5-SV2, A549, K-562, MDA-MB-435s og KB-cellelinier hvor HSC /p70-koncentration er 2 til 3 gange højere og SH-5YSY hvor det er 2 gange lavere (figur 5). Ligeledes i brystadenocarcinom MCF7 og leverkarcinom HepG2, HSC /p70 er 7 til 12 gange den gennemsnitlige værdi. Endelig er det værd at bemærke, at HSC /p70-ekspression er opreguleret i alle cancercellelinier med ekspressionsniveauer nå i HepG2-celler 160 gange den inden i den ikke-cancer leverhomogenat (HNCL) anvendes som en reference i HepG2-celler (figur 5).

mængden af ​​HSC /p70 i 18 cancer og en normal (MRC5-SV2) cellelinjer ekstrakter, en leverhomogenat (HNCL) og kanin-reticulocytlysat (RRL) blev bestemt ved sammenligning af kemiluminescens-signal registreres for HSC /p70 i celleekstrakter fortyndet 4 og 16 gange med den for kendte mængder af proteinet på samme Western blots. De gennemsnitlige mængder af HSC /p70 i de forskellige ekstrakter udtrykkes som en funktion af de totale proteiner indhold af ekstrakterne.

Vores resultater tyder på, at FTT /TRiC aktivitet er blandt de laveste i cellelinjer, der udtrykker de højeste HSC /p70 niveauer (sammenlign FTT /TRiC aktivitet på beløbene for HSC /p70 i MCF7 HepG2 og K-562). Ligeledes FTT /TRiC aktivitet synes den højeste i cellelinje ekstrakter hvor HSC /p70 er lavere end gennemsnittet (sammenlign FTT /TRiC aktivitet på beløbene for HSC /p70 i MIA-PaCa-2, HCT15, PC-3, og MDA -MB-231). Dette kan meget vel være en konsekvens af kundens protein fordeling mellem HSC /p70 og FTT /TRiC med øgede mængder af klient proteiner utilgængelige for binding til FTT /TRiC i tilstedeværelsen af ​​høje HSC /p70-koncentrationer.

For yderligere dokument HSC /p70 og FTT /TRiC samarbejde på protein foldning, vi analyseret FTT /TRiC klient proteinfoldning aktivitet i kræft celleekstrakter efter HSC /p70 immunodepletion. Dataene præsenteret i figur 6 viser tydeligt, at CCT /TRiC-medieret p-actin falder folde med over 65% i MIA-PaCa-2 og OVCAR-8 upon HSC /p70 immunodepletion. Disse resultater viser tydeligt, at HSC /p70 og FTT /TRiC samarbejder.

FTT /TRiC-medieret mærket, denatureret β-actin foldning i (A) MIA-Paca-2 og OVCAR-8 celleekstrakter før og efter HSC /p70 immunodepletion. Proteinkoncentrationen af ​​MIA-PaCa-2 og OVCAR-8 celleekstrakter var 2,5 og 15 mg /ml. Nativ β-actin band intensitet blev recoded anvendelse af en Phosphorlmager. Mængden af ​​indfødte β-actin målt efter immunodepletion udtrykkes som en brøkdel af det beløb målt for celleekstrakterne før immunodepletion i (B) MIA-Paca-2 og (C) OVCAR-8 celleekstrakter.

Vores observationer er kompatible med den opfattelse, at HSC /p70 buffere FTT /Tric klient proteiner [36]. Faktisk immunodepletion af HSC /p70 fører til en reduktion af FTT /TRiC klient polypeptid pulje på grund af et fald i mængden af ​​tilgængelige FTT /Tric klient proteiner.

Diskussion

FTT /TRiC spiller en central rolle i celleproliferation gennem sin evne til at lette foldningen af ​​i) – cytoskeletale proteiner involveret i celledeling, f.eks α, β og y-tubulins [23], [15], [31], [25], a- og p aktinerne og centractin [14], [36], [25], ii) – oncoproteiner såsom cyklin E [ ,,,0],22], Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor protein [23], cyklin B og p21

ras [24]. CCT /TRiC ekspression er endvidere opreguleres under G1 /S faseovergang i cellecyklussen [25], mens dets nedregulering fører til hæmning af celleproliferation, en formindskelse i cellelevedygtighed, cellecyklusstop og cellulær apoptose [26 ].

for at bestemme om FTT /TRiC aktivitet afhænger simpelthen af ​​sit udtryk niveau, vi sammenlignet ekspressionsniveauerne af FTT /TRiC i 18 menneskelige kræftceller, en normal cellelinje og en normal human lever. Vi viste, at FTT /TRiC aktivitet ikke altid korrelerer med dens udtryk niveau. Vi kvantificeres derfor FTT /triske aktivitet modulatorer i kræft cellelinjer anvendt i denne undersøgelse. Vi viste, at Hop /p60 er ikke eneansvarlig for øget eller nedsat FTT /TRiC-medieret folde effektivitet. Ligeledes var vi ikke i stand til at afsløre en sammenhæng mellem PhLP3 ekspressionsniveauet og FTT /TRiC aktivitet i cellelinier, hvor PhLP3 udtryk var påviselig. Vi kvantificerede derfor niveauerne af proteiner, der bistår specifikt FTT /TRiC, såsom prefoldin eller buffere klient proteiner pool i cytoplasmaet, såsom HSC /p70. Vi viste, at jo højere prefoldin udtrykkes, jo lavere aktivitet af FTT /TRiC er. Vi viste også, at FTT /TRiC aktivitet er den højeste i cellelinje ekstrakter hvor HSC /p70 niveauer er den laveste. Disse resultater tyder på, at klient proteiner partition mellem prefoldin og /eller HSC /p70 og FTT /TRiC. Ved tilstedeværelse af høje prefoldin og /eller HSC /p70 koncentrationer, er en væsentlig del af kundens proteiner bufferet af sidstnævnte molekylære chaperones og utilgængelig for binding til FTT /TRiC mens når prefoldin og /eller HSC /p70 koncentrationer er lave den del af klient proteiner bundet til FTT /tric stiger. Således variationer i ekspressionsniveauerne af prefoldin og /eller HSC /p70 modulerer tilgængeligheden af ​​klienten protein for CCT /TRiC. Dette illustreres af det fund, at immuno-udtynding af HSC /p70 cytosoliske pulje fører til en udtømning af sekvestrerede klient proteiner og en signifikant nedsættelse af steady state CCT /TRiC aktivitet. Konstateringen af, at antallet af FTT /TRiC og prefoldin partikler i cytosolen af ​​cancer cellelinjer ikke afvige med mere end en størrelsesorden indikerer enten at folde maskiner har udviklet sig på en sådan måde, at prefoldin og /eller HSC /p70 funktion i sammen med FTT, eller at den maksimale klient polypeptider folde maskiner kan lagre /buffer og cellen kan rumme er af samme størrelsesorden end FTT /Tric partikler. Dette gælder især i tilfælde puljen af ​​polypeptider tilknyttet prefoldin og /eller HSC /p70 indenfor cytoplasmaet repræsenterer den eneste kilde til FTT /Tric klient proteiner.

Samlet set vores undersøgelse viser en funktionel samspil mellem molekylære chaperoner, der kan tegne sig for en præcis graduering af FTT /TRiC aktivitet i celledeling gennem ændringer i de cellulære niveauer af prefoldin og /eller HSC /p70. Vores observationer viser også, at tilgængeligheden af ​​kundens protein til FTT /TRiC er det begrænsende trin, der modulerer FTT /TRiC aktivitet. Faktisk øget prefoldin og /eller HSC /p70 intracellulære koncentrationer fører til nedsat mængder af frie klient proteiner og modvirke FTT /TRiC aktivitet. Ligeledes en forøgelse af mængden af ​​kundens proteinkoncentrationer ved en given prefoldin og /eller HSC /p70 koncentration udbytter gratis klient proteiner og gendanner FTT /TRiC aktivitet. Således en trepartsaftale samspil mellem FTT /TRiC, prefoldin og /eller HSC /p70, på den ene side, klient proteiner, på den anden side, synes afgørende for modulering celleproliferation, især i en sammenhæng, hvor det cytoskeletale og kræftpsykologisk proteiner, er afgørende for celledeling og levedygtighed er blandt de store kunder FTT /TRiC.

HSC /p70 co-chaperoner fra Hsp40 familien modulere interaktionen af ​​HSC /p70 med sine klient proteiner [37]. Vi kvantificerede derfor ekspressionsniveauet af en af ​​de store inducerbare Hsp40 familiemedlemmer [38] i cancercellelinjer der anvendes i hele denne undersøgelse. DNAJB1 ekspressionsniveau er den højeste i MIA-PaCa-2, MDA-MB-231 og HT29-celler (ikke vist). Denne observation er i overensstemmelse med en højere omsætning på HSC /p70-bundne klient proteiner og den efterfølgende over gennemsnittet FTT /TRiC aktivitet målt for disse ekstrakter. Men DNAJB1 ekspressionsniveauerne var relativt beskedne i to andre cellelinier (HCT15 og PC-3) udstiller over gennemsnittet FTT /TRiC aktivitet.