PLoS ONE: Tilbagevendende Genomisk Gevinster i Preinvasive Læsioner som biomarkør for risiko for lungekræft

Abstrakte

Lunge carcinoma udvikling ledsages af marken ændringer, der kan have diagnostisk betydning. Vi har tidligere vist betydningen af ​​kromosomale aneusomy i lungekræft progression. Her testede vi, om genomiske gevinster i seks specifikke loci,

TP63

på 3q28,

EGFR

på 7p12,

MYC

på 8q24, 5p15.2, og centromere regioner kromosomer 3 (

CEP3

) og 6 (

CEP6

), kan give yderligere værdi i forudsigelsen af ​​lungekræft. Bronkiale biopsi prøver blev opnået ved LIFE bronkoskopi fra 70 individer (27 med gængse lungekræft og 43 personer uden lungekræft). Tyve seks biopsier blev læst som moderat dysplasi, 21 som svær dysplasi og 23 som karcinom

in situ

(CIS). Fire-mikron paraffinsnit blev forelagt en 4-target FISH assay (LAVysion, Abbott Molekylær) og testet igen for

TP63

og CEP 3 sekvenser. Spot tællinger blev opnået i 30-50 kerner pr prøve for hver probe. Øget genkopiantallet i 4 af de 6 prober var forbundet med øget risiko for at blive diagnosticeret med lungecancer både i ujusterede analyser (odds ratio = 11, p 0,05) og indstilles til histologi bedømmelse (odds ratio = 17, p 0,05) . De mest informative 4 sonder var

TP63

,

MYC

, CEP3 og CEP6. Kombinationen af ​​disse 4 sonder tilbudt en følsomhed på 82% for lungekræft og en specificitet på 58%. Disse resultater indikerer, at specifikke cytogenetiske forandringer til stede i preinvasive lungelæsioner er tæt forbundet med diagnosen lungekræft og kan derfor have betydning for vurderingen af ​​risikoen for lungekræft

Henvisning:. Massion PP, Zou Y, Uner H, Kiatsimkul P, Wolf HJ, Baron AE, et al. (2009) Periodisk Genomisk Gevinster i Preinvasive Læsioner som biomarkør for risiko for lungekræft. PLoS ONE 4 (6): e5611. doi: 10,1371 /journal.pone.0005611

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 21, 2009; Accepteret: 17. april 2009. I Udgivet: 9 Jun 2009

Copyright: © 2009 Massion et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NCI yder R01 CA102353, U01-CA85070, CA46934, Lung Spores CA90949, CA55769 og CA58187 og Landspitali-University Hospital Science Fund fra Island. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tidlig diagnose af lungekræft menes at føre til forbedret overlevelse. Alligevel er mindre end 25% af patienterne diagnosticeret på klinisk fase 1, hvor forventede overlevelse er omkring 70% på 5 år. Denne overlevelse er meget højere end den samlede overlevelse i fremskreden sygdom, der anslås til 15% på 5 år. Tilgange til tidlig diagnosticering af lungekræft fortsat en stor udfordring. Starten af ​​sygdommen proces er yderst langsom (måneder til år) og ingen mulighed for at evaluere hastigheden for progression af sygdommen proces er tilgængelige.

En række lungekræft screeningsteknikker er blevet undersøgt for at bestemme deres anvendelighed i tidlige stadium af sygdommen. Disse omfatter røntgen af ​​thorax, opspyt cytologi og molekylære biomarkører i forskellige biologiske prøver. Ingen af ​​disse tidlige påvisning strategier har vist sig at forårsage en reduktion i cancer-relateret dødelighed. Low-dosis spiral computertomografi (CT) kan give et præcist billede af anatomiske omfanget af tidlig lungekræft [1]. Men selvom tiltrækkende som en afsløring strategi tidligt, [2], [3], [4], [5], [6], er resultaterne af randomiserede, kontrollerede undersøgelser ikke kendt. Desuden vil de fleste preinvasive læsioner i de centrale luftveje forblive uopdaget af brystet CT.

Molekylær afsløring strategier fra luftvejs prøver er udfordrende på grund af den relativt vanskelig adgang, mangel på væv og mangel på molekylære ændringer prædiktive for kræft. Mens molekylærbiologi lungekræft er blevet grundigt undersøgt, findes der ingen pålidelige molekylære korrelater diagnostik [7]. Lungekræft udvikling er karakteriseret ved sekventiel akkumulering af epigenetiske og genetiske afvigelser i somatiske celler [8]. Disse afvigelser har enkelt nukleotid punktmutationer, ændringer i kromosom kopital [9], [10], og specifikke genomiske amplifikationer eller deletioner, der er impliceret i patogenesen af ​​lungetumor udvikling og progression gennem aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener [11], [12], [13], [14], [15], [16].

Fordi ikke alle preinvasive læsioner udvikle sig til invasive tumorer, er det afgørende at identificere molekylære determinanter kørsel til en invasiv fænotype [16]. Fluorescens in situ hybridisering fremstår som et potentielt nyttigt klinisk redskab til vurdering af diagnose, prognose, og respons på behandling i lungekræft [17], [18], [19], [20], [21], [22] . Kromosomal aneuploidi er fundet tæt forbundet med diagnosticering af lungecancer. For nylig testede vi gevinst i kopi antal to ud af fire udvalgte DNA-mål, taget som en afspejling af genomisk ustabilitet og en markør for risiko for lungekræft udvikling [10], [23]. I den foreliggende undersøgelse har vi den hypotese, at et udvalgt sæt af cytogenetiske ændringer i preinvasive læsioner kan være en bedre indikator for lungecancer. Derfor har vi fastslået, om resultaterne af cytogenetisk analyse var forbundet med sygdomsprogression i de valgte personer. Vi valgte seks DNA-mål almindeligvis forstærkes i lungekræft [12], [14], [15], [24], [25], herunder to centromere prober (CEP3 og CEP6) og fire sonder til områder med hyppig genomisk forstærkning, dvs. 3q28 (

TP63

) [11], [13], 5p15.2 (D523 og D5S721 markører) [26], 8q24 (

MYC

) [27], og 7p12 (

EGFR

) [28]. Med disse validerede FISH-prober, vi udførte en kvantitativ vurdering af den nukleare repræsentation af genomiske locus kopi nummer i preinvasive læsioner og deres forbindelse med en diagnose af invasiv lungekræft.

Materialer og metoder

Patient befolkning egenskaber

populationen inkluderede 70 emner rekrutteret på University of Colorado Cancer center (UCCC), British Columbia Cancer Agency (BCCA) og Islands Universitet Hospitals (UIH). Denne befolkning udgør en undergruppe af patienter, der tidligere undersøgt [23] og omfatter alle emner fra denne undersøgelse med diagnosticeret moderat dysplasi (4 med lungekræft, 22 kontroller), svær dysplasi (6 med lungekræft, 15 kontroller) eller karcinom

i situ Hotel (17 med lungekræft, 6 kontroller), for hvem bronchiale sektioner var til rådighed.

De emner undersøgte var alle anses for at være i høj risiko for lungekræft er baseret på en historie af mindst 30 pack årsreglen af ​​rygning og spirometrisk beviser af luftvejsobstruktion dokumenteret af en FEV1 /FVC ration af mindre end 75% og en FEV1 på mindre end 70% af den forventede. Tidligere rygere blev defineret som at have afslutte mindst et år før tiden for tilmelding. Pack-år blev defineret som det gennemsnitlige antal pakninger røget per dag multipliceret med antallet af år røget. Fleksibel fiberoptisk bronkoskopi blev udført med både autofluorescens og hvidt lys undersøgelse af luftvejene ved hjælp af enten en Xillix LIFE II eller OncoLIFE system på UCCC og BCCA sites; hvidt lys undersøgelse alene blev udført ved UIH. De BCCA tilfælde var blevet diagnosticeret i et prospektivt studie af tidlig lungekræft hjælp autofluorescens og hvidt lys bronkoskopi eller de emner blev indskrevet som en del af to National Cancer Institute sponsoreret kemoforebyggelse forsøg. Disse omfattede 27 patienter med klinisk diagnose af invasiv carcinom (fremherskende tilfælde) og 43 forsøgspersoner, der forblev fri for invasiv tumor i mindst et års opfølgning (kontrol). Detaljeret spørgeskema data fra personlig samtale var tilgængelige på alle forsøgspersoner, herunder demografiske karakteristika og rygevaner. Undersøgelsen blev godkendt af de lokale Institutional Review Boards i Vanderbilt University, University of Colorado Health Sciences Center, BCCA- University of British Columbia Clinical Research Ethics Board, National bioetik Udvalg Island og den islandske Data Processing Kommissionen.

Histologi og udvælgelse af områder interessante

Alle biopsier opnået ved bronkoskopi blev scoret i henhold til den seneste WHO klassifikationen [29]. Biopsier med diagnoser spænder fra moderat dysplasi til carcinoma

in situ

blev udvalgt til FISH-analyse. Diagnostiske områder inden for de enkelte biopsier blev gennemgået og afbildet af en patolog (WAF), som markerede områder af interesse for specifikt undersøgt af FISH.

FISH for CEP3, TP63 (3q28), D523, D5S721 (5p15. 2), CEP6, EGFR (7p12), og MYC (8q24)

Fire-mikron paraffinsnit blev oprindeligt forelagt en 4-target FISH assay (LAVysion, Abbott Molekylære, Des Moines, IL), herunder sekvenser omfatter den DNA-markører D523 og D5S721 på 5p15.2, centromer 6,

EGFR

gen ved 7p12 og

MYC

gen på 8q24, ifølge protokol beskrevet andetsteds [23]. Alle afsnit analyseret ved FISH var sekventiel til det respektive H 0,01), var det ikke for

EGFR

5p15.2 . Når disse relationer blev analyseret i forhold til andelen af ​​celler, der indeholdt mere end to kopier af hver enkelt markør, vi observerede associationer begrænsede til de samme 4 markører. Interessant, forstærkning af sekvenser blev påvist i alt 8 prøver, for fire af de testede mål:

TP63

, 5p15.2,

EGFR

MYC

. Amplifikation blev repræsenteret af små til mellemstore klynger af signaler (EGFR) eller med mere end 50% af celler, der bærer mere end 5 kopier af signalerne (myc 5p15.2 og TP63). Repræsentative billeder er vist i figur 1.

interfase cellekerner farvet i blå med DAPI show øget kopi antal

TP63

i CIS (A). Segmenterede billeder af 4-farve hybridiseringsassays med LAVysion probe i svær dysplasi læsioner, der viser høje kopiantal i 5p15.2 genomiske region (grønne pletter) (B);

EGFR

genamplifikation (klynger røde pletter) (C); og høj kopi antal

MYC

(gule pletter) (D). Alle afsnit analyseret af FISH var sekventiel til H dvs. er store mønstre bliver udvandet af mange varianter [10], [37], [38]. Genomiske ændringer i luftvejsepitel forekommer både stokastisk og senere i en klonal måde. Klonale (identisk ændring i 2 eller flere celler) og ikke-klonale ændringer forbundet med rygning historie deltage i tumoren påbegyndelsesprocessen. Nogle ændringer kan indikere risiko bedre end andre. Hidtil har de fleste af disse ændringer været betragtet konsekvenser i modsætning til årsager i udviklingen af ​​lungecancer. Nogle af disse lave afvigelser niveau er blevet kaldt tilfældig støj, men kan afspejle måling af sand ustabilitet. Ikke-klonede kromosomale ændringer (NCCAs) såsom defekte mitotiske figurer, kromosomal fragmentering, missegregation eller ikke-tilbagevendende genomiske ændringer indikerer en dynamisk proces, der fører til ustabilitet [39]. I denne undersøgelse fandt vi, at den høje frekvens af ikke-kodende centromere forandringer (CEP3 og CEP 6) uafhængigt var forbundet med en diagnose af lungecancer (tabel 2), og derfor selv ikke specifikt knyttet til tumorigenese, er det sandsynligvis en del af den genomiske instabilitet kommer sammen med sygdomsprocessen.

i modsætning hertil specifikke genomiske amplifikationer eller deletioner [12], [15], [40] har været impliceret i patogenesen af ​​tumorudvikling dels gennem aktivering af onkogener [41] og inaktivering af tumorsuppressorgener. Nogle genomiske signaturer synes at vare ved efter tumor udvikling, hele deres progression [42] og deres histologi differentiering. Preinvasive læsioner har vist kopital ændringer i flere kromosomale regioner, herunder 3q28, 5p15 og 8q24 [10], [13], [23], [43], [44], og disse ændringer blev også fundet. Genomisk ubalancer er blevet grundigt undersøgt i invasive NSCLCs hjælp CGH eller SNP-array metode og talrige loci blev fundet almindeligt forstærket eller overrepræsenterede i den ene eller begge skællede og adenocarcinom i lungerne [14], [15], [24], [25 ], [45], [46], [47], [48], [49]. Hvis nogle af dem er vist sig at være tidlige begivenheder, kan det forbedre testen præstation i forbindelse med diagnosticering af lungekræft.

Vi hypotese, at genomiske ændringer i

TP63

, 5p15.2,

EGFR

,

MYC

, CEP 6 og CEP 3 kan give et mål for risikovurdering. Øget kopi nummer (overrepræsentation eller forstærkning) er teknisk mere pålidelig til at påvise med færre falske positiver end genomisk tab, primært ved brug af FISH-analysen i afskårne prøver udviser nukleare trunkering, så vi har fokuseret på loci, der var involveret i genomisk gevinst. Snittet off for “normal” kopiantal forstærkning blev fastsat til ≤2 kopier pr kerne baseret på det faktum, at de normale disomic celler har to kopier af hver genomisk mål og disse celler blev snittet ved 4 um, hvilket genererede trunkerede kerner. Selv om denne værdi ikke kan det optimale afskåret for at bruge, det er konservativ og sikrer, at prøver, der er klassificeret som udstiller genomisk gevinst er faktisk unormalt.

TP63

er en tiltalende mål placeret på spidsen af en af ​​de mest udbredte område af amplifikation i lungekræft.

TP63

er en homolog af p53, som spiller en rolle i udviklingen og onkogenese ved at regulere proliferation og differentiering. Interessen for

TP63

stammer fra denne “to gener i én” koncept med agonist og antagonist-egenskaber, der kan være involveret i tumor udvikling [50].

TP63

er en kompleks gen, der har flere transkriptionelle isoformer, hvoraf nogle er tumorsuppressorer (

TP63

isoformer), mens de andre er onkogener (Δ

TP63

; dN

TP63

) [11] .Den TA

TP63

isoformer kan binde til DNA gennem p53-responsive elementer, og derfor “p53-lignende”. Den AN

TP63

udøver dominerende negative virkninger i løbet af p53 og foreslås som onkogen. Vi fandt, at der er en tidlig og hyppig genomisk amplifikation af

TP63

i udviklingen af ​​skællede lungecarcinom og at patienter med NSCLC, der viser amplifikation og overekspression af

TP63

har forlænget overlevelse [13 ]. Den ΔΝ

TP63

α splejsningsvariant er den mest almindeligt udtrykt isoform i pladeepitel [11], [13]. Den onkogen aktivitet

TP63

isoformer kan forklare, hvorfor ser vi forstærkning og overekspression af dette protein.

MYC

er også en vigtig onkogen i lungekræft. Det udtrykkes i et stort antal NSCLCs [51]. Gene forstærkning på 8q24 og deraf forøget ekspression af

MYC

er en fælles begivenhed i karcinomer [48], [52], [53]. Det fører til øget dannelse af

MYC

: Max heterodimer transkriptionsfaktorer, der ændrer genekspression i stor del ved at rekruttere histon-modificerende enzymer [47]

foreslår, at de ændringer, der observeres Vores data for. 5p15 og

EGF R

var mindre prædiktiv for cancer, men disse ændringer syntes at ske tidligere i dysplastiske proces, i det mindste hos rygere. Blandt 20 bronkiale prøver med normal histologi fra aldrig rygere, har ingen forhøjet

EGFR

eller 5p15 kopi nummer. Gennemsnitligt antal kopier for disse 20 prøver var 1,77 (STD 0,53) for

EGFR

og 1,73 for 5p15 [10]. Disse observationer er også i overensstemmelse med observation af hyppige

EGFR

mutationer (24-43%) fundet i luftvejene epitel i nærheden af ​​tumorer [54], [55], og med de data, der viser hyppige tidlige hændelser på 5p i skællede differentiering af lungekræft [55], [56].

Vores design omfattede kontrol, der ikke gjorde stede med lungekræft i mindst 12 måneder efter endobronchial biopsi. Da genomisk instabilitet sker ikke kun blandt tilfælde, men også blandt kontroller, kan nogle af disse højrisiko-kontroller i sidste ende udvikle lungekræft senere og vores tværsnitsundersøgelse design ikke imødegå denne risiko. Andre begrænsninger i undersøgelsen omfatter arten af ​​væv undersøgt, en relativ lille stikprøve (selvom studiet af 70 fuldt kommenterede høj kvalitet preinvasive læsioner krævede tre centre og er en af ​​de største rapporteret til dato), og den manglende evne til at studere disse prøver ‘progression over tid.

anvendelse af bronchiale biopsier for vurderingen af ​​risikoen lungekræft er usandsynligt, at være af optimal klinisk brug, selv om det kan være nyttigt at forudsige fremtidige kræft hos personer, der tilfældigvis gennemgå en biopsi viser høj kvalitet bronkial preneoplasia. Denne type af molekylær analyse kan have til at flytte til surrogat væv i luftvejene, herunder histologisk normal luftvejsepitel. Den lille størrelse af preinvasive læsioner og den potentielle terapeutiske virkning af biopsier gøre vurderingen af ​​progressionsrate af aberrationer i disse væv temmelig udfordrende. Tværsnitsundersøgelser tillader undersøgelse af sammenhængen mellem ændringer og sygdomstilstand. Men for at bevise klinisk anvendelighed, vil kandidatlandene biomarkører kræver yderligere validering i prospektive kohortestudier.

Nøjagtigheden af ​​vores cytogenetisk signatur kan forbedres på forskellige måder. Genom kopital ændringer af invasive og preinvasive læsioner kan tillade udvælgelsen af ​​regioner mere specifikt forbundet med diagnosticering af lungecancer. Forøgelse af antallet af mål undersøgt i små vævsprøver er udfordrende, men nyere teknologier kan bidrage til at nå dette mål. I sidste ende, raffinering en genomisk signatur observeret i preinvasive læsioner, forudsiger hvem er tilbøjelige til at udvikle lungekræft ville være meget informativ. I denne sammenhæng kan gentagen måling af sådanne ændringer og hastigheden af ​​dens akkumulation være særlig værdifuld til at forudsige sandsynligheden for at udvikle lungekræft.

I denne undersøgelse tog vi fordel af fremskridt inden for lungekræft molekylær genetik og viste, at der er en stærk forbindelse mellem målrettede genomiske ændringer i preinvasive bronchiale læsioner og diagnosticering af lungecancer. Disse ændringer kan pålideligt vurderes ved FISH, og kan repræsentere en metode til at måle risikoen for at udvikle lungekræft. Den prædiktive værdi af disse ændringer fortjener yderligere evaluering i luftvejene epitel af høj risiko individer i longitudinelle studier.

anerkendelser

Forfatterne takker UCCC cytogenetik Core til teknisk bistand.