PLoS ONE: Ephrin-A1 opreguleres af hypoxi i cancerceller og Fremmer Angiogenese af HUVEC’er gennem en koordineret krydstale med eNOS

Abstrakt

Hypoxi, ephrin-A1 og endotel nitrogenoxidsyntase (eNOS ) har vist sig at spille kritiske roller i tumorangiogenese. Men hvordan ephrin-A1 reguleres af hypoxi og hvorvidt ephrin-A1 samarbejder med eNOS i modulering af angiogenese mangler at blive behandlet i detaljer. Her har vi vist, at både ephrin-A1 i pladecellecarcinom celler (SCC-9) og især opløselig ephrin-A1 i supernatanterne var opreguleret under hypoxiske tilstand. En øget nitrogenoxid (NO) produktion i humane navlevene-endotelceller (HUVEC’er) blev observeret i ephrin-A1-induceret angiogenese som blev vendt efter co-kultur med eNOS specifik inhibitor, N-nitro-L-arginin-hydrochlorid (L -NAVN). Western blot-analyse bekræftede, at både phosphorylering af Akt

Ser473 og eNOS

Ser1177 blev opreguleret i ephrin-A1-stimuleret HUVEC’er, med det samlede eNOS-ekspression uændret. Den specifikke inhibitor af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), LY294002, betydeligt nedreguleret ephrin-A1-induceret ekspression af phosphoryleret Akt

Ser473 samt fosforylering af eNOS

Ser1177. Disse resultater viste en mulig ny mekanisme, hvorved ephrin-A1 reguleres i tumor mikromiljø og fremmer angiogenese gennem en koordineret krydstale med PI3K /Akt-afhængige eNOS aktivering som kan vedrøre normal vaskulær udvikling og tumor neovaskularisering.

Henvisning: Sang Y, Zhao XP, Song K, Shang ZJ (2013) Ephrin-A1 opreguleres af hypoxi i cancerceller og Fremmer Angiogenese af HUVEC’er gennem en koordineret Cross-Talk med eNOS. PLoS ONE 8 (9): e74464. doi: 10,1371 /journal.pone.0074464

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: Januar 18, 2013; Accepteret: August 3, 2013; Udgivet: 9. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.172.570 og nr 30.872.893). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En række pro-angiogene og antiangiogene faktorer deltager i kontrollen af ​​angiogenese som spiller væsentlige roller i tumorvækst og metastase [1] – [3]. Ephrin-A1 og dets primære receptor, EphA2, er ikke kun til udtryk i flere maligniteter, men også spille en afgørende rolle i normal angiogenese og tumor neovaskularisering [4]. Over-ekspression af ephrin-A1 i tumorceller kan fremme den angiogene proces, mens banke ned af ephrin-A1 i tumorceller bidrager væsentligt til reduktion af tumorinduceret endotelcellemigration in vitro og mikrovaskulær densitet in vivo [5]. Vores tidligere undersøgelse viste, at over-udtrykte EphA2 kan bidrage til tumorangiogenese og har prognostisk værdi i tungen carcinom [6]. Der er tilstrækkelig eksperimentelt bevis antyder, at aktivering af EphA2 på endotelceller (EC’er) er påkrævet for ephrin-A1 til at udøve sine angiogene virkninger in vitro og in vivo [7]. Imidlertid blev de regulerende faktorer og mekanismer, hvormed ephrin-A1 /EphA2 fremmer tumorangiogenese ikke godt belyst.

Det er blevet rapporteret, at adskillige vækstfaktorer og cytokiner kan inducere ekspressionen af ​​ephrin ligander, såsom tumor nekrose faktor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), et al [8]. Hypoxi er en af ​​de mest almindelige og vigtige funktioner i tumor mikromiljø, og bidrager til induktion af forskellige angiogene faktorer [9]. For nylig er HIF-1α, en hypoxi-inducerbare transskriptionsfaktor, blevet fundet at opregulere ephriner og Eph-receptorer i musehud [10]. I hoved og hals kræft, blev øget ephrin-A1 udtryk forbundet med pO

2 i tumor mikromiljø [11]. Selvom ephrin-A1 spiller en kritisk rolle i tumorangiogenese og synes at være involveret i respons på hypoxi, har de fleste af tidligere studier hovedsagelig fokuseret på ephrin-A1 som et membranbundet protein. Til vores viden, der er relativt lidt direkte bevis, om hypoxi kan fremkalde kræft celler til at producere ephrin-A1, især den opløselige form, eller ikke.

De mekanismer der ligger til grund ephrin-induceret angiogenese er ikke blevet helt forstået endnu. Indtil nu, kun nogle få signalveje, såsom MAP /ERK og PI3K [12], [13], har vist sig at blive påvirket af ephrin-A1. Endvidere blev fremme samt inhiberingen af ​​den samme signalvej ved ephrin-A1 observeret i forskellige celler eller kræftformer. Det er velkendt, at eNOS og NO spille en afgørende rolle i endotel migration og angiogenese [14]. Tilstrækkeligt bevis viste, at eNOS udtrykkes overvejende i tumor vaskulære endotelceller, og produktionen NO virker som direkte effektormolekyle i forskellige angiogene faktorer-induceret tumorangiogenese [15], [16]. Det er derfor ikke overrasket over at antage, at eNOS /NO også kan mediere ephrin-A1-induceret tumor angiogenese. Desværre, ingen direkte information er tilgængelig på tværs af forbindelsen mellem ephrin-A1 og eNOS under modulation af angiogenese i endotelceller hidtil.

Den aktuelle undersøgelse undersøgte mekanismerne bag ephrin-A1 modulation af angiogenese ved at undersøge den effekt af hypoxi på ephrin-A1 ekspression og sekretion i tumorceller og den mulige sammenslutning af ephrin-A1 med eNOS /NO i tumor angiogenese. Vore data bekræftede, at både ephrin-A1 ekspression og opløseligt ephrin-A1-sekretion i tumorceller blev forhøjet under hypoxi stimulation. Ephrin-A1-induceret angiogenese blev ledsaget med eNOS phosphorylering og NO-produktion, der blev blokeret af L-NAME. Yderligere undersøgelse viste, at aktivering af PI3K /Akt signalvej er nødvendig for krydstale mellem ephrin-A1 og eNOS i at fremme angiogenese. Vores resultater foreslog, at opreguleret ephrin-A1 i tumor hypoxisk mikromiljø kan fremme angiogenese via PI3K /Akt /eNOS vej.

Materialer og metoder

Materialer

Rekombinant humant ephrin -A1-Fc-kimær og rekombinant humant IgG1 Fc blev indkøbt fra R Lonza, Walkersville, MD) suppleret med 2% føtalt bovint serum (FBS) og med EGM-2 vækstfaktor blanding (Lonza). HUVEC’er anvendt i denne undersøgelse var begrænset i passagen 4 til passage 6. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære indeholdende 5% CO

2. Vores undersøgelser blev godkendt af udvalgene vedrørende Etik inden skole og Hospital i Stomatologi (Wuhan University, referencenummer 055/2011).

cellemigrationsassay

Cell migration blev undersøgt ved hjælp af scratch såret assay . Konfluente HUVEC’er i 24-brønds plade blev sultet natten over i 0,1% BSA EBM-2, indtil et sår blev fremstillet ved anvendelse af en 200 pi pipettespids. Efter skylning med PBS tre gange for at fjerne de løsnede celler og cellerester, vækstfaktor-frit medium med ephrin-A1-Fc (1 pg /ml) alene eller sammen med L-NAME (100 uM) eller LY294002 (10 uM) blev tilsat til hver brønd. Vækstfaktor-frit medium med eller uden rekombinant lgG1 Fc (1 pg /ml) blev taget som kontrol. Billeder på samme position langs bunden såret blev taget ved 0 timer, 24 timer. Procentdelen af ​​sårlukning på hvert tidspunkt blev beregnet ved følgende formel: [1- (nuværende sårområde /initial sårområde)] x 100

In vitro Tube Formation Assay

Sub. -confluent HUVEC’er blev resuspenderet i vækstfaktorer-free EBM-2 indeholdende ephrin-A1-Fc (1 pg /ml) alene eller sammen med L-NAME (100 uM) eller LY294002 (10 uM), og podet på den præ-størknede BD matrigel (BD Bioscience) i 96-brønds plade (3 × 10

4 celler /brønd). Pladerne blev derefter inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 6 timer. Billeder blev taget fra hver gruppe. Alle forgreningspunkter af rør strukturer i hver brønd blev talt at kvantificere graden af ​​dannelse rør. Vækstfaktor-frit medium med eller uden rekombinant lgG1 Fc (1 pg /ml) blev taget som kontrol. Procentdelen af ​​dannelse rør blev beregnet ved at tage det rekombinante IgG1 Fc kontrolgruppen som 100% kanaldannelse. Forsøgene blev gentaget mindst tre gange under lignende betingelser.

NO Koncentration Detection Assay

I alt NO-koncentration i dyrkningsmedium blev opdaget ved at måle koncentrationen af ​​nitrat og nitrit ved modificeret Griess reaktion metode. Total nitrogenoxid Assay Kit (Beyotime, Kina) blev anvendt. De optiske tætheder ved 540 nm bølgelængde blev registreret ved hjælp af et Micro-plade Reader (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og koncentrationerne af NO blev beregnet efter standardkurven

Bloker analysen.

blok-assay blev udført for at evaluere funktionen af ​​eNOS i ephrin-A1-induceret HUVEC’er angiogenese og ephrin-A1 virkning på P-eNOS gennem

Ser1177 PI3K-Akt pathway. L-NAME (100 uM) eller LY294002 (50 uM) blev tilsat i dyrkningsmediet for at blokere eNOS eller PI3K. HUVEC’er af kontrolgrupperne blev dyrket i vækstfaktoren-frit medium med eller uden rekombinant lgG1 Fc (1 pg /ml).

Immunofluorescens Assay

HUVEC’er vokser på dækglas blev inkuberet i 2% FBS EBM-2 indeholdende 1 ug /ml ephrin-A1-Fc til 0 timer, 8 timer og 24 timer. Dækglas blev vasket med PBS og fikseret i 4% paraformaldehyd koldt i 10 min. Efter behandling med 5% BSA-PBS ved 37 ° C i 30 minutter blev celler inkuberet med primære kanin polyclone antistof mod eNOS (fortynding 1:600) eller EphA2 (fortynding 1:400) ved 4 ° C natten over. Celler blev derefter vasket med PBS tre gange i 15 minutter og udsat for Alexa Fluor 488-konjugeret gede anti-kanin IgG (fortynding 1:300) i 1 time ved 37 ° C. Kernerne blev farvet i 2 minutter i Hoechst (fortynding 1:10000) (Sigma, USA), efterfulgt af yderligere tre vaske i PBS i 15 min. Alle dækglas var dækket med dias og monteret på fluorescens mikroskop (Leica DM4000B, Tyskland) til detektion. Negative kontroller blev behandlet på samme procedure, men med udeladelse det primære antistof.

celleproliferationsassay

HUVEC’er i 96-brønds plade (1 x 10

3 i 100 pl /brønd) udsat for ephrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 0 timer, 24 timer og 48 timer. Celleproliferationen blev målt ved anvendelse af et Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Tokyo, Japan) ved tilsætning af 10 pi WST-8 i hver brønd ved angivne tidspunkter. Absorbansen ved 450 nm bølgelængde er optaget med en Micro-plade Reader (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Polymerase Chain Reaction

Total RNA blev ekstraheret fra forsøg grupper . cDNA blev syntetiseret med RevertAid ™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). Real-time PCR blev udført under anvendelse af Maxima ™ SYBR Green qPCR Master Mix kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) og spektrofluorimetrisk termisk iCycler1 (Bio-Rad, Hercules, CA). For eNOS, primer sekvenser er 5′-GTGGCTGTCTGCATGGACCT-3 ‘(fremad) og 5′-CCACGATGGTGACTTTGGCT-3’ (tilbage), produkt størrelse 121 bp. Human glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev taget som en intern kontrol. MRNA-ekspression niveau i hver gruppe blev beregnet ved den sammenlignende ΔΔCt.

Hypoxi Experiment

SCC-9 celler blev udsat for hypoxiske betingelser (1% O

2) eller normoksiske betingelser ( 21% O

2) til 0 h, 6 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer. Celler blev høstet og lyseret i SDS-prøvebuffer til Western blot-assay. Supernatanter blev opsamlet og centrifugeret ved 3000 x g i 10 minutter for at fjerne debris. Samme mængde supernatant blev påsat for at detektere den opløselige form af ephrin-A1 ved Western blot-analyse [18].

celleafrunding Assay

Supernatanterne (24 h) blev taget som konditioneret medium (CM) og opkoncentreret 6 × før celleafrunding eksperiment ved anvendelse af 10 kDa MWCO Amicon Ultra centrifugalfilter enheder (Millipore). U-251 GBM-celler blev behandlet med CM eller 1 ug /ml rekombinant human ephrin-A1-Fc. Omvendt mikroskop blev anvendt til at observere celle afrunding ved 15 min, 30 min, og 2 timer efter behandling.

Western blot-analyse

HUVEC’er i 90% sammenflydning blev behandlet med ephrin-A1-Fc ( 1 ug /ml) i 2% FBS EBM-2 for angivne tider. Protein blev høstet i lysispuffer indeholdende protease inhibitor cocktail og phosphatase inhibitor cocktail (Roche, Tyskland). Lige så stor mængde protein (30 ug) blev påsat og separeret i 8% SDS-PAGE. Og derefter, proteiner blev overført til polyvinylidendifluoridmembran (Millipore Co., Billerica, MA, USA) ved 200 mA i 2 timer (100 mA, 1 h for ephrin-A1) ved 4 ° C, blokeret i TBS indeholdende 5% BSA (vægt /volumen) og 0,1% Tween-20 i 1 time og inkuberet med passende primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Fortyndingen af ​​antistoffer var som følger: ephrin-A1 (1:500), eNOS (1:600), P-eNOS

Ser1177 (1:1000), Akt (1:1000), P-Akt

Ser473 (1:1000) og β-actin (1:2000). Efter fem 5 minutters vaske, blev blokkene inkuberet med peberrod peroxid-konjugeret sekundært antistof (fortynding 1:10,000) (Jackson Immunoresearch Laboratories) i 1 time ved stuetemperatur. Til sidst blev bånd undersøgt ved hjælp af ECL plus western blotting afsløring reagenser (Beyotime, Kina). Western blot-analyse blev gentaget mindst tre gange under lignende betingelser.

Statistisk analyse

Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at sammenligne forskellen mellem forsøgsgrupper.

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet signifikant forskellig.

Resultater

Ephrin-A1 Enhanced Angiogenese in vitro

EphA2 receptor udtrykker sig positivt i vores dyrkede HUVEC’er (Figur S1A-C). Den ikke-præ-Clustered humant rekombinant ephrin-A1-Fc blev anvendt til at bestemme virkningerne af ephrin-A1 på proliferation, migration og dannelse rør i HUVEC’er. Vores resultater viste, at ephrin-A1-Fc kunne medføre væsentligt højere HUVEC’er migration (figur S2A, B) og rør-dannelse på matrigel (Figur S3A-D), uden at påvirke på celleproliferation (figur S4). Disse resultater var i overensstemmelse med tidligere rapporter [19], hvilket bekræfter ephrin-A1 modulation af angiogenese.

Ephrin-A1 Induktion af angiogenese medieres af eNOS Aktivering og ingen produktion

Selvom eNOS /NO har blevet betragtet som en afgørende effektor i tumor angiogenese, har ingen tidligere studier rettet om eNOS /NO mægle ephrin-A1-induceret angiogenese. NO påvisningsassay viste en dramatisk forøgelse af NO-produktion i supernatanten af ​​dyrkede HUVEC’er efter inkubation med 1 ug /ml ephrin-A1-Fc i 24 timer (figur 1). Der var en signifikant statistisk forskel i NO produktion mellem kontrolgruppen (10,4 ± 3,4 uM) og ephrin-A1-Fc-stimulation gruppe (42,1 ± 4,1 uM). Når NO-produktion blev inhiberet med L-NAME (100 uM) blev sårlukning rate undertrykkes dramatisk (Figur 2A) (figur S2A, B), og mindre intakt rør strukturer og forgreningspunkter blev observeret i ephrin-A1-stimulerede HUVEC’er (figur 2B) (Figur S3A-D), viser et signifikant fald i cellemigrering og rør-dannelse (figur 2C, 2D). Disse resultater antydede, at eNOS /NO kan spille en nøglerolle i ephrin-A1-induceret angiogene proces.

Data viste en signifikant øget NO-produktion i EA1-Fe gruppen. (*,

P

0,05, n = 3)

A:. Cellemigrationsassay viste, at L-NAME og LY294002 hæmmede ephrin-A1-stimuleret migrering af HUVEC’er ( 200 ×). B: Tube formation assay viste, at L-NAME og LY294002 inhiberede ephrin-A1-stimuleret rør dannelsen af ​​HUVEC’er (200 ×). Pilehoveder præsenterede HUVEC’er, der strakte sig utilstrækkeligt. C: Kvantificering af A. D: Kvantificering af B. (*,

P

0,05, n = 3)

For yderligere undersøgelse, eNOS udtryk og fosforylering status var. undersøgt i ephrin-A1-stimulerede HUVEC’er. Som vist i figur 3A, 3B, 3C, blev ingen signifikante eNOS ekspressionssystemer ændringer detekteret ved immunfluorescens, real-time PCR og western blot-analyse. Imidlertid ephrin-A1-Fc stimulering forårsagede en hurtig tidsafhængig stigning i eNOS phosphorylering på sted Ser1177 (figur 3D) (figur S5). P-eNOS

Ser1177 begyndte at ophøje betydeligt i ca 10 min og nåede til den maksimale effekt i 30 min og faldt derefter (figur 3E). Disse data antydede, at P-eNOS

Ser1177 aktivering, men ikke stige af eNOS udtryk er hovedsagelig ansvarlige for den forhøjede NO produktionen i ephrin-A1-induceret angiogenese.

Immunofluorescens (A), Real-time PCR ( B) og Western blot-analyse (C) viste, at ephrin-A1-Fc havde ingen effekt på eNOS ekspression af HUVEC’er (#,

P

0,05, n = 3). D: Western blot der viser, at P-eNOS

Ser1177 og P-Akt

Ser473 blev opreguleret under ephrin-A1-Fc stimulering i en tidsafhængig måde. E: Antal analyse af P-eNOS

Ser1177. F: Antal analyse af P-Akt

Ser473. (*,

P

0,05, n = 4).

PI3K /Akt er påkrævet for ephrin-A1-induceret P-eNOS

Ser1177 i HUVEC’er

som vist i figur 3D, 3F, ephrin-A1-afhængig P-eNOS

Ser1177 blev også ledsaget af en tilsvarende hurtig phosphorylering og aktivering af Akt

Ser473, hvilket tyder Akt kan virke som en vigtig opstrøms modulator der bidrager til P-eNOS

Ser1177 i denne proces. Mens PI3K er taget som en direkte controller af Akt [20] – [22], LY294002 (50 uM) blev påført i vores undersøgelse for at bekræfte dens virkning på phosphorylering af Akt og eNOS. Vores resultater viste, at ikke kun P-Akt

Ser473 men også P-eNOS

Ser1177 blev svækket ved behandling med LY294002 (figur 4A-C) (figur S6), afdække, at PI3K er grundlæggende for Akt fosforylering af ephrin- A1 og igen phosphorylerer eNOS på sted Ser1177. Endvidere for at afgøre, om PI3K /Akt aktivering blev involveret i ephrin-A1-inducerede cellulære funktioner, blev LY294002 tilsat i dyrkningsmediet og dens virkninger på EC’er blev vurderet ved bunden sår assay og dannelse rør assay. Som vist i figur 2A, 2B, efter udsættelse for LY294002 blev sårlukningen faldt betydeligt i sammenligning med EA1-Fc-gruppen (figur 2C); HUVEC’er om matrigel strakt tilstrækkeligt, var mindre filial punkter registreres og færre intakte rør strukturer blev observeret i EA1-Fc + LY294002 gruppe (fig. 2D). Disse resultater antydede, at Akt fosforylering spiller en kritisk rolle i ephrin-A1 inducerede HUVEC’er angiogene funktioner. Tilsammen kunne vi drage en konklusion, at ephrin-A1 inducerer aktivering af eNOS via PI3K /Akt-afhængig signalvej i sine pro-angiogene funktioner

A:. Repræsentative Western blots for P-eNOS

Ser1177 og P-Akt

Ser473 fra HUVEC’er, der blev sultet i 0,1% BSA EBM-2 natten over og stimuleret med ephrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 30 minutter alene eller sammen forbehandlede med LY294002. B: Antal analyse af P-Akt

Ser473. C: Antal analyse af P-eNOS

Ser1177. (*,

P

0,05, n = 4) (#,

P

0,05, n = 4)

Hypoxi opreguleret. ephrin-A1 Expression og Opløselig ephrin-A1 Sekretion i kræftceller

kræftceller blev dyrket under hypoxi og normoxi betingelser. Celler og supernatanter blev høstet for ephrin-A1 analyse ved Western blot. Sammenlignet med celler dyrket i normoxi påvistes SCC-9 celler udsat for hypoxi en markant stigning i ephrin-A1 ekspression i en tidsafhængig måde med maksimal effekt forekommer ved 24 timer (figur 5A) (Figur S7A, B). Mere vigtigt blev ephrin-A1-protein også påvises positivt og steg betydeligt i supernatanterne fra hypoksi grupper, hvis niveau var meget højere i sammenligning med normoxi grupper (figur 5b) (figur S7C, D), hvilket antyder at cancerceller kan også secernerer opløselige form af ephrin-A1 i tumor hypoxisk mikromiljø. Interessant nok som vist i figur 5A, både normoxi og hypoxi gruppe havde lignende ephrin-A1 ekspression tendens i SCC-9-celler. Ephrin-A1 begyndte at stige i cirka 6 timer, ankom til sin maksimale punkt i 12 timer til 24 timer og faldt derefter senere. En mulig negativ feedback mekanisme kan have været involveret i denne særlige proces. Ephrin-induceret receptor endocytose er blevet undersøgt i et antal biologiske systemer. Ved interaktion af ephrin-A1 ligand og EphA2 receptor, ligand-receptor komplekser kan internaliseres i to retninger i tumorceller [23], [24]. Denne ligand-receptor komplekser internalisering kan desuden fungere som en negativ feedback motivation til kontrol ephrin-A1 ekspression. Så det er muligt, at den stigende EphA2 aktivering af både membranbundne og opløselige ephrin-A1 i SCC-9 celler havde resulteret i nedregulering af ephrin-A1. Som for grunden ephrin-A1 er steget dramatisk mellem tidspunkter 6 timer og 12 timer, selv i normoxi gruppe, er det stadig brug for yderligere undersøgelser

A:. Western blot der viser, at hypoxi forhøjet membranbundet ephrin-A1 udtryk i SCC-9-celler. B: Western blot viser, at hypoxi opreguleret opløselig ephrin-A1 i supernatanter af SCC-9 celler. SCC-9 celledensitet ved 70-80% konfluens, blev taget som 0 timer, når frisk dyrkningsmedium blev tilsat. C: celleafrunding assay demonstrerer, at opløseligt ephrin-A1 i CM kunne aktivere EphA2 i U-251 GBM-celler. Ephrin-A1 (S), opløselig ephrin-A1; N, normoxi konditioneret medium gruppe; H, hypoxi medium gruppe.

Cell afrunding er en karakteristisk reaktion på funktionel ephrin-A1 [18], [25]. U-251 GBM celler naturligt overudtrykker EphA2 og har meget lavt niveau af ephrin-A1 [26]. Evnen hos opløseligt ephrin-A1 i CM at inducere celle afrunding af U-251 GBM-celler blev undersøgt. Som vist i figur 5C (fig S8), behandling af U-251 GBM celler med enten CM eller ephrin-A1-Fc resulterede i en drastisk ændring i cellemorfologi, hvilket afspejler ved celle afrunding så tidligt som 15 minutter, ankommer til peek virkning i 30 min og aftagende med 2 timer efter CM og ephrin-A1-Fc behandling. Selv blev observeret morfologiske ændringer af U-251 celler under CM stimulation, yderligere funktionelle eksperimenter er stadig nødvendigt at vise, om hypoxi-induceret opløselig ephrin-A1 kan fremkalde EphA2 fosforylering eller endda tumor angiogenese.

signaleringskaskade involveret i ephrin-A1-induceret angiogenese er kendetegnet skematisk i figur 6.

diskussion

Den aktuelle undersøgelse afslørede en mekanisme, hvorved ephrin-A1 modulerer angiogenese og en drivende faktor for ephrin-A1 op -regulering. Ephrin-A1-induceret angiogenese indebærer en forøget NO-produktion, der er senere end et PI3K /Akt-afhængig aktivering af P-eNOS

Ser1177 i endotelceller. Hypoxi kunne aktivt fremkalde forstærkning af både membranbundne og opløselige ephrin-A1 i tumorceller. Disse resultater giver det første bevis på, at PI3K /Akt /eNOS signaleringskaskade kan repræsentere en fælles vej for hypoxi-inducerbare ephrin-A1-afhængig angiogenese i vaskulær udvikling og tumor progression.

Akkumulerende beviser bekræftede, at en effektiv angiogenese kræver bioaktive NO syntetiseret af eNOS som udtrykkes overvejende i vaskulære endotelceller. Det er blevet rapporteret, at NO er ​​en kritisk mediator af VEGF-induceret angiogenese som kan blokeres af L-NAME [27]. Tilsvarende Statiner kan opregulere eNOS-ekspression og fremme NO-afhængig angiogenese ved at reducere caveolin-1 overflod [28]. For første gang, fandt vi, at NO-produktion er også afgørende for angiogenese som respons på den pro-angiogene molekyle ephrin-A1. Ephrin-A1-Fc-induceret cellemigration og kapillær samling blev svækket når EC’er blev behandlet med L-NAME. Interessant nok viste vores videre undersøgelse, forhøjet NO syntese i ephrin-A1-induceret EC’er blev primært tilskrevet eNOS fosforylering på Ser1177 rest men ikke forøgelse af eNOS udtryk. Det er velkendt, at phosphorylering er et af de vigtigste regulatoriske mekanismer post-overgangs- underliggende eNOS aktivering [20], [29]. Som dokumentation for vores konklusion, er også observeret mange slags stimuli, der fremmer eNOS aktivering til at forårsage phosphorylering på forskellige steder, såsom Thr495, Ser633 og Ser1177 [30]. Vores resultater giver det første bevis på, at ephrin-A1 har en koordineret krydstale med eNOS /NO i at fremme angiogenese.

Selvom korrelationen af ​​øget eNOS aktivitet med ephrin-A1-stimuleret angiogenese blev fundet i nærværende undersøgelse, signalvejen er involveret i ephrin-A1-induceret forøgelse af eNOS aktivitet stadig behov for yderligere undersøgelser. Det er blevet rapporteret, at forskydningsspænding-induceret NO-produktion synes at være styret af Akt-afhængig phosphorylering af eNOS i dyrkede EC’er [31]. Derudover har Akt protein kinase vist sig at fungere som en EF overlevelsesfaktor og fremme kanaldannelse in vitro [32]. Tidligere undersøgelser har også foreslået, at PI3K /Akt pathway medierer angiogenese induceret af flere angiogene stimuli, såsom VEGF [33], forskolin [34], vægtløshed [35], og så videre. For at undersøge den funktionelle inddragelse af PI3K /Akt pathway i ephrin-A1-eNOS krydstale, virkningen af ​​LY294002 på ephrin-A1-induceret signalering begivenheder blev bestemt. Efter stimulering med ephrin-A1-Fc i 30 minutter, phosphoryleringen af ​​både Akt og eNOS var forhøjet betydeligt. Denne elevation skyldtes phosphorylering af Akt

Ser473 og eNOS

Ser1177, som påvist ved Western blot analyse. Udsættelse for LY294002 forhindrede ephrin-A1-induceret ekspression af P-Akt

Ser473 og P-eNOS

Ser1177 tilsyneladende, hvilket indikerer, at PI3K /Akt -afhængige signalvej deltog i at kontrollere ephrin-A1-medieret aktivering af eNOS.

Hypoxi er en af ​​de vigtigste karakteristika i tumor mikromiljø, og modulerer sorter af angiogene faktorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [36]. Ephrin-A1 er også kendt som en angiogen faktor, og spiller afgørende roller i neovaskularisering i forskellige cancere [4]. Tidligere undersøgelser har fundet, at ephrin-A1-gen kan induceres ved tumornekrosefaktor-α (TNF-α) i endotelceller [37]. For nylig, Uemura et al. identificeret ephrin-A1 som en mulig kandidat hypoxi-inducerbare gen ved microarray analyse af vævsprøver fra metastatisk colorectal cancer [38]. Også, blev ekspressionen af ​​ephrin-A1 og beslægtede gener markant reduceret i HIF-2α knockdown (kd /kd) endotelceller, hvilket indebærer rolle hypoxi i ephrin-A1 regulering [39]. I nærværende undersøgelse, vi forudsat direkte beviser for, at eksponering for hypoxi resulterede i forhøjet ephrin-A1-ekspression i cancerceller ved Western blot analyse. Ephrin-A1 blev først identificeret som en GPI-forankret protein, der kræver membran binding eller clustering /oligomerisering for sin aktivering af EphA2 [40]. Derfor er vores resultater antydede, at opregulering af membranbundet ephrin-A1 induceret af hypoxia kan fremme tumorangiogenese gennem interaktion med dets receptor EphA2 på endotelceller i tumormikromiljøet. Desuden har vi dokumenteret i dette studie, at hypoxi opreguleret en opløselig form af ephrin-A1 frigivelse fra cancerceller i ekstracellulære miljø. I overensstemmelse med vores fund, har ephrin-A1 også blevet påvist i serum fra patienter med lever carcinom [41]. For nylig har flere undersøgelser vist, at opløselige monomere ephrin-A1 er en funktionel ligand for EphA2, og at opløseligt ephrin-A1 frigivet fra HeLa og SK-BR3 celler er nødvendig for cellevækst og transformation [4]. Svarende til disse undersøgelser, vi observerede morfologiske ændringer af U-251 celler under CM stimulation. Men der er behov for yderligere undersøgelse for at bekræfte, om hypoxi-induceret opløselig ephrin-A1 funktionelt kan interagere med EphA2 at initiere angiogenese.

Sammenfattende de mest betydningsfulde og nye resultater, der præsenteres i denne undersøgelse omfatter, at en) ephrin -A1 samarbejder med eNOS i fremme angiogenese i HUVEC’er; at 2) krydstale mellem ephrin-A1 og eNOS medieres af PI3K /Akt-afhængige vej; og at 3) hypoxi opregulerer både membranbundet og udskilt ephrin-A1-protein i cancerceller. Som kun få studier har fokuseret på de ephrin-A1-udløst nedstrøms molekylære begivenheder, resultaterne rapporteret her identificerer PI3K /Akt-afhængig eNOS

Ser1177 fosforylering som en ny mekanisme, der ligger til grund ephrin-A1modulation af angiogenese (figur 6).

Støtte Information

Figur S1.

Ekspression af EphA2 receptoren i de dyrkede HUVEC’er. Immunofluorescens (A), RT-PCR (B) og Western blot-analyse (C) viste positiv EphA2-ekspression i HUVEC’er

doi:. 10,1371 /journal.pone.0074464.s001

(TIF)

Figur S2 .

cellemigrationsassay viste, at L-NAME og LY294002 hæmmede ephrin-A1-stimuleret migrering af HUVEC’er (200 ×). Endothelcellemigration blev målt i HUVEC’er, der var blevet udsultet i vækstfaktor-free 0,1% BSA EBM-2 natten over og behandlet med ephrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 24 timer

doi:. 10,1371 /tidsskrift. pone.0074464.s002

(TIF)

figur S3.

Tube formation assay viste, at L-NAME og LY294002 inhiberede ephrin-A1-stimuleret rør dannelsen af ​​HUVEC’er. A, B, C: Repræsentative billeder på 40 ×. D:. Repræsentative billeder på 200 ×

doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s003

(TIF)

Figur S4.

endotelcelleproliferation blev målt i HUVEC’er behandlet med ephrin-A1-Fc (1 pg /ml) i 0 timer, 24 timer og 48 timer. Der var ingen statistisk signifikans mellem EA1-Fc og kontrolgruppen. EA1-Fc, ephrin-A1-Fc. (#,

P

0,05, n = 3)

doi: 10,1371 /journal.pone.0074464.s004

(TIF)

Figur S5..

Virkning af ephrin-A1-Fc på phosphorylering af eNOS og Akt i HUVEC’er. A, B, C: Western blots viser, at P-eNOS

Ser1177 og P-Akt

Ser473 var opreguleret under ephrin-A1-Fc stimulering i en tidsafhængig måde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0074464.s005

(TIF)

Figur S6.