PLoS ONE: Matrix (MMP) -9 i Cancer-associerede fibroblaster (CAFS) undertrykkes af Omega-3 flerumættede fedtsyrer in vitro og in vivo

Abstrakte

Cancer forbundet fibroblaster (CAFS) er ansvarlige for tumorvækst, angiogenese, invasion, og metastase. Matrixmetalloproteinase (MMP) -9 secerneres fra cancer stroma befolket af CAF er en forudsætning for cancer angiogenese og metastase. Omega-3 polyumættede fedtsyrer (omega-3 PUFA) er blevet rapporteret at have anti-tumor effekt på forskellige typer af maligniteter. Fat-1-mus, som kan omdanne omega-6 og omega-3 PUFA uafhængig af kost, er egnede til at undersøge funktionerne af endogent omega-3 PUFA. For at undersøge virkningen af ​​omega-3 PUFA på tumorigenese, TC-1-celler, en murin epitelcellelinie udødeliggjort af human papillomavirus (HPV) onkogener, blev injiceret subkutant i fedt-1 eller vildtypemus. Tumorvækst og angiogenese af TC-1 tumor blev undertrykt signifikant i fedt-1 sammenlignet med vildtypemus. cDNA microarray af tumorerne afledt af fedt-1 og vildtypemus afslørede, at MMP-9 nedreguleres i fedt-1-mus. Immunhistokemisk undersøgelse viste immunoreaktivitet for MMP-9 i tumoren stromale fibroblaster var diffust positiv i vildtype henviser fokal i fedt-1-mus. MMP-9 blev udtrykt i primære dyrkede fibroblaster isoleret fra fedt-1 og vildtype-mus, men blev ikke udtrykt i TC-1-celler. Co-kultur af fibroblaster med TC-1-celler forøgede ekspression og proteinase aktivitet af MMP-9, selvom proteaseaktiviteten af ​​MMP-9 i fedt-1-afledte fibroblaster var lavere end den, vildtype fibroblaster. Vores data tyder på, at omega-3 PUFA’er undertrykke MMP-9 induktion og tumorangiogenese. Disse resultater kan give indsigt i mekanismer, som omega-3 PUFA udøve anti-tumor effekt ved at modulere tumor mikromiljø

Henvisning:. Taguchi A, Kawana K, Tomio K, Yamashita A, Isobe Y, Nagasaka K, et al. (2014) matrixmetalloproteinase (MMP) -9 i Cancer-associerede fibroblaster (CAFS) undertrykkes af Omega-3 flerumættede fedtsyrer

In Vitro

og

In Vivo

. PLoS ONE 9 (2): e89605. doi: 10,1371 /journal.pone.0089605

Redaktør: Zhongjun Zhou, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 10. oktober 2013; Accepteret 22. januar 2014 Publiceret: 27 feb 2014

Copyright: © 2014 Taguchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Tokyo IGAKUKAI (KK), Japan Science and Technology Agency precursory Forskning for embryonale Videnskab og Teknologi (PRESTO) (MA), Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (MA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumormikromiljøet består af mikrovaskulære endotelceller, tilstødende normale epitelceller og cancerassocierede fibroblaster (CAF), og er rapporteret at være en vigtig regulator af tumorigenese [1], [2]. Som den mest almindelige cellulære population findes i tumormikromiljøet, CAF er ansvarlige for syntesen af ​​proteiner involveret i remodellering af den ekstracellulære matrix (ECM), og for sekretionen af ​​vækstfaktorer og cytokiner, der regulerer tumorcelleproliferation og invasion [3 ], [4]. I murine ovarian cancer xenograftmodeller, p53 /NF-KB-vejen i CAF steget betydeligt i vivo tumorvækst [5]. I tyktarmskræft, Zhu Y et al. rapport, at IL-1β forøgede coloncancer celleproliferation og invasion ved opregulering COX-2-signalering i CAF [6].

Matrix-metalloproteinaser (MMP’er) syntetiseres som proenzymer og aktiveres typisk ved proteolytisk fjernelse af en propeptid [7]. MMP’er er rapporteret at påvirke tumorprogression ved at lette begivenheder centrale for neovaskularisering og etablering af fjernmetastaser, herunder spredning, overlevelse og migration af endotel, tumor og stromale celler [8], [9]. MMP-2 og MMP-9 er impliceret som forudsætninger for angiogenese og metastase i carcinogenesic proces. MMP-2 udtrykkes i de forskellige cancercellelinier [10]. I modsætning hertil MMP-9 har meget begrænset eller ingen ekspression i disse cancerceller. I stedet MMP-9 er velkendt at blive udskilt fra cancer stromale fibroblaster og endotelceller [11], [12]. MMP-9 er et medlem af en familie af zinkholdige endoproteinaser, der er involveret i nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM) og i vaskulær remodellering [13].

docosahexaensyre (DHA, 22:6n-3) og eicosapentaensyre (EPA, 20:5n-3) er repræsentative mediatorer af omega-3 polyumættede fedtsyrer (omega-3 PUFA) og udøve anti-inflammatoriske virkninger i akutte og kroniske patologiske inflammatoriske reaktioner ved at modvirke inflammation [14]. Omega-3 PUFA’er rapporteres også at have anti-cancer effekt baseret på in vitro og in vivo undersøgelser [15] – [17]. Adskillige mekanismer er blevet foreslået til at forklare anti-cancer virkninger af omega-3 PUFA. Omega-3 PUFA’er ændrer væksten af ​​tumorceller ved at modulere cellereplikation, ved at forstyrre komponenter af cellecyklus eller ved at øge celledød via nekrose eller apoptose [18], [19]. Omega-3 PUFA’er er også kendt for at udøve anti-angiogene virkninger ved at inhibere produktionen af ​​mange angiogene mediatorer herunder: vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), og prostaglandin E2 (PGE2) [20] – [24].

kosttilskud er en traditionel tilgang til at ændre væv ernæringsmæssige sammensætning i dyreforsøg for ernæring. Fodring af dyr kostvaner, der ændrer specifikke ernæringsmæssige og ikke-ernæringsmæssige komponenter kan bidrage til at differentiere forsøgsgrupper; men det kan være meget vanskeligt at tilvejebringe diæter, som er identiske i alle undtagen en enkelt eller et lille men kontrolleret antal komponenter. Kang et al. nylig udviklet en transgen mus, der bærer fedt-1-genet fra rundorm

Caenorhabditis elegans

[25]. Dette gen koder en omega-3 fedtsyredesaturase, som katalyserer omdannelsen af ​​omega-6 til omega-3 PUFA og som er fraværende i de fleste dyr, herunder pattedyr. Der er en bemærkelsesværdig forskel i vævet omega-6- /omega-3 PUFA-forhold mellem vildtype og fedt-1 transgene mus [26]. Fat-1-mus, som typisk udviser en mere afbalanceret forhold mellem omega-6 og omega-3 PUFA i deres væv og organer er uafhængige af kost, tillader omhyggeligt kontrollerede undersøgelser, der skal udføres i fravær af potentielle forstyrrende faktorer af kost. Dette gør dem en nyttig model til at undersøge de biologiske egenskaber af endogene omega-3 PUFA [25]. Adskillige rapporter ved hjælp fedt-1-mus har vist anti-cancer virkninger af omega-3 PUFA’er [27] – [30]. I disse undersøgelser, omega-3 PUFA’er udøvede anti-cancer effekter ved at undertrykke inflammatoriske reaktioner og PGE2 udskillelse fra cancerceller. Til dato er der kun få undersøgelser, der undersøger inddragelsen af ​​omega-3 PUFA i biologi CAF.

I denne undersøgelse har vi en hypotese, at omega-3 PUFA kan ændre tumor mikromiljøer ved at påvirke CAF-aktivitet. For at undersøge denne hypotese blev fibroblaster afledt af fedt-1 og vildtypemus vurderet både in vitro og in vivo, og således, interaktion med TC-1 cancerceller. TC-1-celler blev afledt fra epitelet i C56BL /6-mus og udødeliggjort af humant papillomvirus (HPV) type 16 E6 og E7 oncoproteiner. De er almindeligt anvendt in vitro og in vivo i murine modeller af HPV-relateret cancer [31]. Her undersøgte vi involvering af omega-3 PUFA’er i TC-1 tumorigenese ved at sammenligne fedt-1 og vildtypemus. Vores specifikke fokus involveret studiet af tumorassocierede fibroblaster. Disse modeller er egnede i studiet af CAF fordi cancercellerne stammer vildtype murint epitel, mens kræft stromale komponenter, herunder CAF, stamme fra fedt-1 (omega-3 PUFA’er-rige) eller vildtype (normale PUFA’er) mus.

Materialer og metoder

Dyr og kost

Fat-1 mus blev oprettet på en C57BL /6 baggrund som beskrevet [26] og efterfølgende tilbagekrydses (mindst fire gange) på en C57BL /6 baggrund. Dyr blev fodret med en speciel diæt (AIN-76A + 10% saflorolie, CLEA Japan, Inc.), der indeholdt 10,3% fedtstof med fedtsyresammensætning C16:0 (7,6%), C18:0 (2,7%), C18 :1n-9 (14,1%), C18:2n-6 (73,2%), C18: 3n-3 (0,3%), C20:4n-6 ( 0,1%), C20:5n-3 ( 0,1 %), C22: 6n-3 ( 0,1%), høj i n-6 og lav i n-3 fedtsyrer, indtil den ønskede alder (6-8 uger) til forsøg. At forhindre oxidation af lipider i kosten, blev alle fødevarer opbevaret i køleskabet med antioxidanter (AGELESS; Mitsubishi Gas Chemical Inc.) og fremstillet nyligt hver anden dag. Dyreforsøg blev godkendt af University of Tokyo Animal Udvalg.

Tumorvækst assay i mus

TC-1 celler er afledt fra en primær lunge epitel celle fra C56BL6 /mus og udødeliggjort hjælp HPV 16 E6 /E7 plus c-Has-ras (slags gave fra Dr. TC Wu, Johns-Hopkins University, Baltimore MD USA) [32]. TC-1-celler blev dyrket i DMEM (Gibco, NY, USA) indeholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin og 0,25 g /ml amphotericin B. Otte uger gamle hunmus blev injiceret med 5 × 10

6 murine TC-1-celler suspenderet i 100 pi DMEM. Tumorvolumen, baseret på tykkelsesmålinger, blev beregnet til 7 og 14 dage efter injektion efter følgende formel: (tumorvolumen) = på 1/2 × (den korteste diameter)

2 × (den største diameter). Mus blev aflivet 14 dage efter inokulering, tumorer blev udskåret og opbevaret ved -80 ° C i fremtidige analyser.

cDNA microarray

Totalt RNA fra TC-1-tumorer (ovenfor) blev ekstraheret under anvendelse af en RNeasy MINIKIT (QIAGEN, Hilden, Tyskland). For cDNA microarray analyse, blev 0,5 ug af total RNA poolet amplificeret og mærkes under anvendelse af en Amino Allyl MessageAmpTM II mRNA Amplification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Hver prøve af mRNA mærket med Cy3 og reference-mRNA mærket med Cy5 blev cohybridized til GeneTM Mouse Oligo chip 24 k (Toray Industries Inc., Tokyo, Japan) ved 37 ° C i 16 timer. Efter hybridisering blev hver DNA-chip vasket og tørret. Hybridiseringssignaler afledt af Cy3 og Cy5 blev scannet med Scan Array Express (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Det scannede billede blev analyseret under anvendelse GenePix Pro (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Alle analyserede data blev skaleret med global normalisering. GEO tiltrædelse nummer er GSE54079.

Immunhistokemi

Paraffinsnit (4 um) af TC-1 tumorer blev afvokset i xylen og rehydreret gennem gradueret ethanol til vand. Antigener blev hentet ved kogning i 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i 30 minutter. De afkølede snit blev inkuberet i DAKO REAL Peroxidase-blokerende opløsning (DAKO, Carpinteria, CA, USA) i 10 minutter for at standse endogen peroxidase. For at blokere ikke-specifik binding blev snit inkuberet i DAKO Protein blokeringsopløsning (DAKO) i 10 minutter ved stuetemperatur. Snit blev derefter inkuberet med et kanin polyklonalt antistof mod muse MMP-9 (PAB12714, Abnova, 1:100 fortynding) i DAKO REAL Antibody Diluent (DAKO) natten over ved 4 ° C. Objektglassene blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer, vasket, inkuberet med DAB, modfarvet med hematoxylin, dehydreret gennem en ethanolserie og xylen, og monteret. At evaluere tumor mikrokardannelse blev tumorsnit farvet for CD-31 under anvendelse af et monoklonalt rotte-antistof mod muse CD-31 (ab56299, Abcam, Tokyo, Japan, 1:100 fortynding).

RT-kvantitativ PCR ( RT-qPCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra TC-1 tumorer og dyrkede fibroblaster under anvendelse af et RNeasy MINIKIT (QIAGEN, Hilden, Tyskland) efterfulgt af revers transkription. cDNA blev amplificeret i 40 cykler i en Light Cycler 480 (Roche, Basel, Schweiz) under anvendelse af en Universal Probe Master Mix og de følgende primere og Universal probebibliotek (UPL) prober (Roche). Primerparrene og de universelle prober svarende til hver primer, der blev anvendt i amplificeringer var som følger: muse β-actin, 5’ATTGAAACATCAGCCAAGACC-3 ‘og 5′-CCGAATCTCACGGACTAGTGT-3′ probe88; muse MMP-9, 5’-ACGACATAGACGGCATCCA-3 ‘og 5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3’ probe19. Ekspression af MMP-9 blev normaliseret under anvendelse af β-actin mRNA som en intern standard. Ekspressionsniveauer blev beregnet ved den sammenlignende Ct metoden under anvendelse af β-actin som et endogent henvisning gen.

Primært fibroblast kultur og co-kultur med TC-1 celler

Lunger blev isoleret fra fedt-1 transgene mus og vildtypemus og vasket med saltvand til fjernelse blodceller. Isolering og dyrkning af pulmonale fibroblaster blev udført ved anvendelse af fremgangsmåder tidligere [33] beskrevne. Lungevæv blev hakket i små stykker og inkuberet i DMEM (Gibco, NY, USA) indeholdende type I collagenase (0,25%; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og deoxynuclease I (15 U /ml; TaKaRa, Tokyo, Japan) i 120 minutter ved 37 ° C. De resulterende spredte celler blev adskilt ved filtrering gennem nylon celle sier (70 um, BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Fibroblaster i filtratet blev opsamlet, anbragt i 10 cm skåle i DMEM indeholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin og 0,25 mg /l amphotericin B og inkuberet i 7-10 dage. Fibroblaster blev oprenset fra andre cellepopulation ved differentiel vedhæftning og seriel passage.

Konfluente fibroblaster og TC-1-celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i DMEM indeholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin, og 0,25 g /ml amphotericin B og 1 x 10

5 celler /ml celler af hver celletype blev udpladet sammen i 12 brønds-dyrkningsplader. Co-kulturer blev inkuberet ved 37 ° C 5% CO2 i en fugtig atmosfære i 24 timer. Homotypisk kulturer fungerede som kontroller.

gelatinezymografi

gelatinezymografi assays blev udført ved anvendelse af en gelatinezymografi kit (Cosmobio, Sapporo, Japan) i henhold til producentens instuctions. Cellekultursupernatanter blev opsamlet og centrifugeret ved 1.500 rpm i 5 minutter. Den cellefri supernatant blev blandet med 2 x prøvebuffer og elektroforesebehandlet anvendelse af præfabrikerede geler (10% polyacrylamid, 0,1% gelatine) ved 4 ° C i 1 time. Subsequentnzymatic reaktioner blev udført ved 37 ° C natten over. Gelatinase aktiviteter blev visualiseret ved hjælp af specifikke farvning løsninger og affarvet i eddikesyre-methanol-dH

2O (01:03:06). For semi-kvantitative analyser blev gelatinezymografi bands analyseret under anvendelse billedanalysesoftware (ImageJ).

Statistisk analyse

Data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Statistiske analyser blev udført af Students

t

-test, eller Wilcoxon analyse ved hjælp JMP software. En værdi på P 0,05 blev betragtet som signifikant. I figuren legender, stjerner angiver disse sammenligninger med statistisk signifikans (p 0,05).

Resultater

Tumor vækst og angiogenese af TC-1 tumorer undertrykkes i fedt-1 mus

for at undersøge effekten af ​​omega-3 PUFA på livmoderhalskræft tumorigenese, vi injicerede TC-1 celler subkutant i fedt-1 og strøelse-mate vildtype C57 /BL6-mus. TC-1 tumor formation satser og tumorvækst blev vurderet ved antallet af mus, der danner tumorer og tre-dimension tumorstørrelser hhv. Der var ingen forskel i tumordannelse satser mellem fedt-1 og vildtype-mus. TC-1 tumorstørrelser blev plottet i 14 dage i fedt-1 og vildtype-kontroller (fig. 1). Tumorvæksthastigheder var konsekvent lavere i fedt-1-mus sammenlignet med vildtype-mus på alle tidspunkter. I fedt-1-mus, tumorstørrelse efter 14 dage efter injektion var signifikant mindre end i vildtype kontroller (Fig. 1). Selv cellevækst af TC-1 celler er afhængig af HPV16 E6 /E7-ekspression, blev E6 og E7-ekspression i TC-1-tumorer ikke nedreguleret i fedt-1-mus (Fig. S1).

5 × 10

6 murine TC-1-celler suspenderet i 100 pi DMEM blev injiceret sc i hver af 10 fedt-1 og vildtypemus. Tumorvolumen, baseret på tykkelsesmålinger, blev beregnet til 7 og 14 dage efter injektion efter følgende formel: (tumorvolumen) = på 1/2 × (den korteste diameter)

2 × (den største diameter). Middelværdier med standardafvigelser er vist. Stjerner angiver disse sammenligninger (fedt-1 vs. vildtype mus) med statistisk signifikans (p 0,05).

For yderligere at afgrænse mekanismer bag disse forskelle i tumorvækst i denne model, især i form af den mulige rolle af host-afledt cancer-associerede stromale komponenter, herunder CAF, vi næste undersøgt, om omega-3 PUFA modificeret angiogenese i TC-1 tumor. Vi vurderede semikvantitativt tumor mikrokar densitet i TC-1-tumorer afledt af fedt-1 og vildtypemus ved at tælle antallet af CD31-positive mikrokar i immunhistokemisk assay (fig. 2A og 2B). CD31 immunfarvning af TC-1 tumorer afledt af fedt-1 og vildtypemus (fig. 2A) viste hypovascularity af fedt-1-afledte TC-1-tumorer i sammenligning med vildtype-afledte tumorer. Antallet af CD31-positive mikrokar pr high-power field i fedt-1 mus var væsentligt lavere end i vildtype mus (fig. 2B). Disse in vivo data viste, at TC-1 tumorvækst og angiogenese mindst blev undertrykt i fedt-1-mus sammenlignet med vildtype modstykker selv om det var vanskeligt præcist estimere TC-1 cellevækst i fedt-1-mus.

CD31 immunfarvning af TC-1 tumor afledt fra vildtype (WT) mus (A) og fedt-1 (B). Streger indikerer 200 um. (C) mikrokar tætheder i TC-1 tumorer er udtrykt som repræsentativt antal mærkede fartøjer i 4 felter (n = 5). Middelværdier med standardafvigelser er vist. Stjerner angiver disse sammenligninger (fedt-1 vs. vildtype mus) med statistisk signifikans (p 0,05).

MMP-9 nedreguleres i fedt-1 mus-afledte TC-1 tumorer

at undersøge potentielle forskelle i genekspression profiler af TC-1-tumorer vokser i huden af ​​fedt-1 og vildtypemus blev TC-1 tumorvæv opnået fra fedt-1 og vildtypemus analyseret ved cDNA-mikroarray. Da omega-3 PUFA’er er rapporteret at påvirke celleproliferation og inflammation, Tabel 1 viser de relative genekspressionsniveauer for repræsentative gener associeret med tumorvækst og inflammation (tabel 1). Med undtagelse af EGF, ekspressionsniveauer af næsten alle inflammatoriske cytokiner /chemokiner og vækstfaktorer i TC-1 tumorer fra fedt-1-mus var højere end dem, i tumorer fra kontrolgruppen vildtype. Dette antydede, at anti-inflammatoriske og anti-cellevæksten virkninger af omega-3 PUFA’er er usandsynligt at være central for deres anti-tumor aktiviteter, i det mindste i denne model. Vi undersøgte dernæst ekspressionen af ​​MMP’er i disse TC-1-tumorer til yderligere adresse stroma-relateret angiogenese i tumoren mikromiljøer (tabel 1). cDNA microarray viste, at ekspressionen af ​​MMP-2 og -9 blev undertrykt i fedt-1-mus-afledt TC-1 tumor mens andre MMP’er var tendens til at blive opreguleret i sammenligning med kontroller. For at bekræfte disse virkninger på RNA-niveau, blev RT-qPCR for MMP-9 udført. MMP-9 RNA-niveauer i fedt-1-mus var ca. 60% lavere end i vildtype kontroller (Fig. 3A). TC-1 tumor immunohistokemi bekræftede disse resultater på proteinniveauet. MMP-9-immunoreaktivitet i vildtype mus-afledt TC-1-tumorer var helt stærkere end fedt-1 Mouse-afledte tumorer (fig. 3B). Høj effekt histokemisk analyse af MMP-9 immnoreactivity i TC-1-celler (fig. 3B, indsætter) afslørede ubetydelige ekspression, medens de stromale komponenter, herunder CAF og endotelceller var stærkt positiv kun i vildtype-afledt TC-1-tumorer . Disse data viste, at produktionen af ​​MMP-9 i CAF og endotelceller klart blev undertrykt i fedt-1-mus.

Totalt RNA blev ekstraheret fra TC-1-tumorer, efterfulgt af revers transkription. MMP-9 mRNA-niveauer blev målt ved QRT-PCR. Ekspressionsniveauer af MMP-9 blev normaliseret til p-actin som intern standard (n = 4 i hver gruppe). Stjerner angiver disse sammenligninger (fedt-1 vs. vildtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05). MMP-9 immunfarvning af TC-1 tumorer afledt fra vildtype (WT) og fedt-1-mus. Barer angiver 200 um i energibesparende felter, 50 um i high-power felter.

MMP-9-ekspression og gelatinase aktivitet blev undertrykt i dyrkede primære fibroblaster afledt af fedt-1 mus

for at efterligne kræft stromale mikromiljø in vitro, vi co-dyrkede fibroblaster isoleret fra fedt-1 og vildtype mus med TC-1 celler. Vi brugte lungevæv fra fedt-1 og vildtype mus som kilderne til fibroblaster og differentieret vedhæftning metodologi for deres isolation. Alle fibroblaster blev passeret 3-4 gange før anvendelse i forsøg. Baseline MMP-9 ekspressionsniveauer i primære fibroblaster fra fedt-1 mus var ca. 60% lavere end dem fra vildtype-afledte fibroblaster (Fig. 4A). Kultursupernatanter fra hver primære fibroblast undertype blev opsamlet og underkastet polyacrylamidgelelektroforese at undersøge forskellene i MMP gelatinase aktiviteter (fig. 4B). Ved hjælp af denne metode, MMP-2 blev opdaget, men MMP-9 var ikke i begge fedt-1 og vildtype fibroblast

(A) Primære fibroblaster isoleret fra murine lunger blev dyrket. Totalt RNA fra fibroblaster blev revers transkriberet og MMP-9 mRNA-niveauer blev målt ved QRT-PCR. Ekspressionsniveauer af MMP-9 blev normaliseret til p-actin som intern standard. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Data blev analyseret ved hjælp af Students

t

-test. Stjerner angiver disse sammenligninger (fedt-1 vs. vildtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05). (B) gelatinezymografi: Supernatant fra primære fibroblastkulturer blev opsamlet og separeret ved elektroforese. Gelatinase aktiviteter blev visualiseret ved standard farvningsteknikker.

Dernæst disse primære fibroblaster blev co-dyrket med TC-1-celler for at undersøge fibroblaster aktivering ved in vitro eksponering for cancerceller

11. Fibroblaster og TC-1-celler blev co-dyrket i 24 timer og MMP-9 transkription blev målt ved RT-qPCR. Fibroblaster fra fedt-1 og fra vildtypemus øget demonstreret MMP-9-ekspression ved udsættelse for TC-1-celler (fig. 5A). I fibroblaster afledt fra fedt-1-mus, omfanget af MMP-9-induktion var lavere end i fibroblaster fra vildtypemus (Fig.5A). MMP-9 blev ikke udtrykt i homotypiske TC-1-celler, i overensstemmelse med immunhistokemiske data fra vores in vivo-model. Endvidere bekræftede vi, at MMP-9 ikke blev udtrykt i TC-1-celler ved anvendelse af en transwell co-kulturmodel (fig. S2). Derfor blev MMP-9 i co-kultur tilstand afledt ikke fra TC-1-celler, men fra fibroblaster. MMP-2 gelatinase-aktivitet blev detekteret i alle celledyrkningsbetingelser, herunder homotypisk TC-1-cellekulturer, og blev ikke ændret ved co-dyrkningsbetingelser (Fig 5B, 5D). MMP-9 gelatinase aktiviteter var imidlertid påviselige i fibroblast-TC-1 celler co-kulturer, selvom MMP-9 gelatinaseaktivitet involverer fedt-1-fibroblaster blev klart undertrykt sammenlignet med vildtype-fibroblaster (Fig 5B, 5C), igen støtter konceptet, at MMP-9-ekspression og gelatinaseaktivitet undertrykkes af endogene omega-3 PUFA i CAF afledt af fedt-1-mus.

(A) Isolerede fibroblaster blev co-dyrket med TC-1-celler i 24 timer og ekspressionsniveauer af MMP-9 i fibroblaster blev målt ved RT-qPCR. Ekspressionsniveauer af MMP-9 blev normaliseret til p-actin som intern standard. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Data blev analyseret ved hjælp af Students

t

-test. Stjerner angiver disse sammenligninger (fedt-1 vs. vildtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05). “N.D.” angiver “ikke fundet”. (B) gelatinezymografi: Supernatanter fra fibroblast homotypiske kulturer og fibroblast /TC-1 co-kulturer blev opsamlet og separeret ved elektroforese. Gelatinase aktiviteter blev visualiseret ved standard farvningsteknikker. (C, D) For semi-kvantitative analyser blev gelatinezymografi bands analyseret under anvendelse billedanalysesoftware. Resultater er repræsenteret som middelværdi ± SEM af tre uafhængige forsøg. Data blev analyseret ved hjælp af Students

t

-test. Stjerner angiver disse sammenligninger (fedt-1 vs. vildtype (WT) mus) med statistisk signifikans (p 0,05).

Diskussion

I denne undersøgelse har vi undersøgt inddragelse definerede kostfaktorer (omega-3 og omega-6 PUFA) i tumorigenese hjælp HPV-positive TC-1-celler og foreslog et nyt anti-tumor mekanisme til omega-3 PUFA, der afhænger af aktiviteter CAF. Omega-3 PUFA har vist sig at undertrykke forekomsten af ​​kræft og vækst i forskellige typer af kræft [18], [19], [27]. Mange undersøgelser har vist, at omega-3 PUFA’er har disse virkninger gennem anti-inflammatoriske reaktioner direkte og /eller indirekte [25] – [27] samt ved fremkaldelse af tumor celle apoptose og /eller undertrykkelse tumorcelleproliferation [18], [19 ]. Imidlertid har der været få rapporter om virkningerne af omega-3 PUFA på CAF. CAF er blevet impliceret i at lette væksten af ​​adskillige tumorer ved direkte stimulering af tumorcelleproliferation og ved at forbedre angiogenese [34], [35]. Målretning gener og signalveje medierer interaktion af CAF og tumor-mikromiljø, anses for at være af afgørende betydning for udvikling af nye og effektive kræftbehandlinger [36], [37]. I denne undersøgelse, hjælp fedt-1 mus og TC-1 tumorceller, var vi i stand til at afklare effekten af ​​omega-3 PUFA-rige CAF på tumorigenese.

Mange molekyler, herunder vækstfaktorer, cytokiner, og MMP’er, spiller stimulerende og hæmmende roller i at fremme angiogenese [21]. Vi undersøgte genekspression af angiogenese-relaterede cytokiner, vækstfaktorer og MMP’er i TC-1 tumorer af fedt-1 og vildtypemus ved cDNA-mikroarray. Ekspressionsniveauerne for næsten alle inflammatoriske cytokiner /chemokiner og vækstfaktorer i TC-1 tumorer fra fedt-1-mus var højere end i tumorer fra kontrolgruppen vildtype. I modsætning hertil EGF og MMP-2 og -9 ekspressionsniveauer i fedt-1-mus var lavere end i vildtypemus. Eftersom nedregulering af EGF i TC-1 tumorer fra fedt-1-mus blev forudsagt at fremme TC-1-celleproliferation men tumorstørrelse i fedt-1 mus var signifikant mindre end i kontroller vildtype, vi hypotesen, at forskelle i MMP produktion mellem fedt-1 og vildtype-mus kan være ansvarlige for undertrykkelsen af ​​TC-1 tumorvækst. Vores in vitro-data bekræftet, at MMP-9 stammer fra CAF aktiveret af TC-1 celle eksponering blev nedreguleret i fedt-1 mus. MMP’er er rapporteret at påvirke tumorprogression ved at lette begivenheder pivotale for neovaskularisering og til etablering af fjernmetastaser, herunder spredning, overlevelse og migration af endotel, tumor og stromale celler [8], [9]. MMP-inhibitorer reducerer angiogenese, tumor nummer, og tumorvækst, ligesom genetisk ablation af MMP-9 [38]. I modsætning til MMP-2, som udtrykkes konstitutivt, MMP-9-niveauer er normalt lav og enzym ekspression induceres af cytokiner, der stimulerer NF-KB [8], [39]. Desuden er forhøjede serum- og vævsniveauer af MMP-9 rapporteret at være associeret med cancer invasion og metastase [40]. I brystcancer, har MMP-9-aktivitet blevet lokaliseret omkring CAF og CAF co-dyrket med cancerceller som udskiller TGF-β, TNF-α og andre cytokiner, øge produktionen af ​​MMP-9 [11], i overensstemmelse med vores in vitro data. I vores data, undertrykkelse af MMP-9 vil bidrage til at ledsage hypo-angiogenese i tumoren stromale komponent i fedt-1 tumor.

Adskillige transkriptionsfaktorer, herunder aktivator protein-1 (AP-1), SP- 1, og NF-KB, er rapporteret at være involveret i ændringer i MMP-9-ekspression efter eksponering for forskellige cytokiner [41] – [43]. Omvendt har flere rapporter vist, at omega-3 PUFA’er har en hæmmende virkning på NF-KB-vejen når de aktiveres af forskellige stimuli [43] – [47]. Vore egne data antyder, at aktivering af NF-KB-vejen ved co-dyrkning med TC-1 celler kan blive undertrykt af forhøjet niveau af omega-3 PUFA i fibroblast opnået fra fedt-1-mus.

I vores eksperimenter , vi konsekvent anvendes primære fibroblaster, der var blevet passeret 3-4 gange kun. Alligevel lipid mediator analyse af fibroblaster viste, at sådanne afledt af fedt-1-mus producerede større mængder af omega-3 PUFA’er herunder EPA-afledte metabolitter sammenlignet med sådanne afledt af vildtype kontroller (Fig.S3), bekræfter, at de dyrkede fibroblaster beholdt den karakteristiske at gøre omega-3 PUFA rigt miljø.

TC-1 tumor microarray data viste, at adskillige inflammatoriske cytokiner /chemokiner og vækstfaktorer blev opreguleret i fedt-1-mus. Men de data viste genekspressionsniveauer i både TC-1-celler og stromale komponenter, herunder fibroblaster, endotel- og immunceller. Derfor ekspressionsniveauerne af hver cytokin /chemokinet var afhængige af deres primære kilder til produktion. MMP-9 blev produceret af fibroblaster afledt af fedt-1-mus, men ikke af TC-1-celler. Derfor kan undertrykkelse af NF-KB-vejen ved forhøjede niveauer af omega-3 PUFA i fedt-1-afledte stromale komponenter har en specifik og potent virkning på MMP-9 ekspressionsniveauer sammenlignet med de andre inflammatoriske cytokiner /chemokiner. På den anden side, en tidligere undersøgelse viser, at omega-3 PUFA’er aktivere NK-celler og øge andelen af ​​aktiverede CD8 + -celler; dette efterfølges af forbedrede antitumorvirkninger [48]. Derfor kan omega-3 PUFA udøver både antiinflammatoriske og proinflammatoriske virkninger på immunceller.

I denne undersøgelse har vi vist, at en omega-3 PUFA’er-rige mikromiljø kan undertrykke MMP-9-sekretion fra CAF og at dette er forbundet med efterfølgende tumor hypo-angiogenese. Denne undersøgelse foreslår et nyt anti-tumor effekt af omega-3 PUFA ved at modulere tumor mikromiljø især på CAF.

Støtte Information

figur S1. Salg Ekspressionsniveauer af E6 og E7 mRNA i TC-1 tumor. Totalt RNA blev ekstraheret fra TC-1-tumorer, efterfulgt af revers transkription. E6 og E7-mRNA-niveauer blev målt ved QRT-PCR. Ekspressionsniveauer af E6 og E7 mRNA blev normaliseret til p-actin som intern standard. E6 primere var fremadrettet, 5′-TGCACAGAGCTGCAAACAAC 3 ‘, og revers, 5’AGCATATGGATTCCCATCTC 3’. E7 primere var fremad, 5’TTTGCAACCAGAGACAACTGA -3 “, og omvendt, 5’GCCCATTAACAGGTCTTCCA -3 ‘

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089605.s001

(TIF)

Figur S2 .

MMP-9 mRNA blev ikke induceret fra TC-1-celler ved co-kultur med fibroblaster.