PLoS ONE: Caudal homeobox Protein CDX-2 Samarbejder med Wnt Pathway at regulere Claudin-1 ekspression i Colon Cancer Cells

Abstrakt

dysregulering af tight junctions (TJs) er ofte forbundet med humane sygdomme, herunder carcinogenese og nyere undersøgelser understøtter rolle TJ integrerede proteiner i reguleringen af ​​Epithelial-til-Mesenchymale Transition (EMT). I denne henseende er ekspression af claudin-1, er en væsentlig del af TJs, stærkt forøget i colon cancer og er kausalt forbundet med tumorvækst og progression. Men mekanisme /r, underliggende regulering af claudin-1-ekspression i intestinale epitelceller stadig dårligt forstået. I vores undersøgelser har vi identificeret formodede bindingssteder for intestinal transkriptionsfaktorer Cdx1, -2 og GATA4 i 5′-flankerende region af claudin-1-genet. Vore yderligere undersøgelser ved hjælp af fuld længde og /eller sletning mutant konstruktioner i to forskellige humane coloncancer-cellelinjer, SW480 og HCT116 viste nøglerolle Cdx1, CDX2 og GATA4 i reguleringen af ​​claudin-1 mRNA-ekspression. Men overekspression af CDX2 havde den mest potente virkning på claudin-1 mRNA-ekspression og promotor-aktivitet. Også i tyktarmskræft patientprøver, observerede vi en signifikant og parallel korrelation mellem claudin-1 og CDX2 udtryk. Kromatin immunofældning (chip) assay bekræftede CDX2 binding med claudin-1 promotor

in vivo

. Brug CDX2 sletning mutant-konstruktioner, vi yderligere kortlagt CDX2 C-terminalen domæne til at være vigtige i reguleringen af ​​claudin-1 promotor-aktivitet. Interessant, co-ekspression af aktiveret β-catenin yderligere inducerede CDX2-afhængige opregulering af claudin-1-promotor-aktivitet, mens ekspression af den dominante negative (DN) -TCF-4 ophævede denne aktivering. Tilsammen konkluderer vi, at homeodomæne transskription faktorer Cdx1, CDX2 og GATA4 regulerer claudin-1 genekspression i humane colon cancerceller. Desuden er en funktionel krydstale mellem Wnt-signalering og transkriptionel aktivering relateret til caudale-relateret homeobox (CDX) proteiner og GATA-proteiner er påvist i reguleringen af ​​claudin-1 promoter-aktivering

Henvisning:. Bhat AA, Sharma A, Pope J, Krishnan M, Washington MK, Singh AB, et al. (2012) Caudal homeobox Protein CDX-2 Samarbejder med Wnt Pathway at regulere Claudin-1 ekspression i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 7 (6): e37174. doi: 10,1371 /journal.pone.0037174

Redaktør: Frederic Andre, Aix-Marseille Universitet, Frankrig

Modtaget: Januar 6, 2012; Accepteret: 17. april, 2012; Udgivet 15. juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Bhat et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud CA124977 (P. Dhawan) og DK088902 (AB Singh). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tight junctions (TJs), den mest apikale celle-celle-adhæsion, hjælpe med at regulere polariteten og differentieret tilstand epitelceller. Afbrydelse af celle-celle kryds sammen med samtidige ændringer i ekspressionen af ​​associerede proteiner hjælper fremkalde invasion og metastatisk progression i kræft. Den claudin familie af proteiner er en integreret del af strukturen og funktionen af ​​tætte forbindelser, og ændret udtryk for claudin familiemedlemmer; selv på en vævsspecifik måde, er blevet påvist i flere cancertyper. Flere linjer af beviser tyder på, at claudin-1 er en vigtig bestanddel af TJs [1], [2], og er direkte involveret i de funktioner barriere og hegn af TJs [3], [4]. Endvidere har undersøgelser herunder vores vist, at claudin-1-ekspression er dysreguleret i en række forskellige cancere, herunder colorectal cancer [3], [5]. Vi har yderligere vist, ved hjælp af en stor kohorte af patienter med coloncancer, at claudin-1-mRNA-ekspression også er stærkt forøget i tyktarmskræft [25]. Det er endvidere værd her at bemærke, at i coloncancer, dysregulerede claudin-1-ekspression forbinder med tumorprogression og metastase [5]. Også claudin-1 er et mål for β-catenin /Tcf signalering, en central regulator af colon homeostase og neoplastisk vækst /progression [6]. Dog er ikke klart forstået oplysninger om den transkriptionelle regulering af colon claudin-1-ekspression.

A. Western blot analyse af Cdx1, CDX2, GATA4, claudin-1 og claudin-4 proteinekspression i SW480-celler. SW480-celler blev transient transficeret med Cdx1, CDX2 og /eller GATA4 ekspressionsvektorer og 20 ug af hele celleekstrakter blev analyseret. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. B. Densitometri for claudin-1 og claudin-4-ekspression. C. Kvantitativ Real-Time PCR-analyse. SW480-celler blev co-transficeret med Cdx1, CDX2 og GATA4 ekspressionsvektorer i nærvær af de indikerede reporterkonstruktioner, og kvantitativ RT-PCR blev udført. Otteogfyrre timer senere blev totalt RNA isoleret og udsat for real-time PCR under anvendelse af genspecifikke primere. Resultater blev afbildet som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg og præsenteres som gange ændring. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontrol. Forskelle mellem to grupper blev analyseret ved den tosidede Student t-test og mere end to grupper ved envejs ANOVA med post-hoc Bonferroni multiple sammenligningstest.

homeodomæneproteiner Cdx1 og CDX2 er medlemmer af den kaudale-relaterede homeobox-genfamilien [7] – [9]. Undersøgelser støtte den rolle, Cdx1 og CDX2 i reguleringen af ​​tidlig differentiering og vedligeholdelse af intestinale epitelceller. Undersøgelser ved anvendelse af epitelceller i intestinal oprindelse har vist, at modulering af ekspressionen af ​​Cdx1 og /eller CDX2 har signifikante funktionelle virkninger på intestinal differentiering [10], [11], proliferation [10], [12], og tarm-specifik gentranskription programmet [13] – [16]. Det skal bemærkes, at Cdx1 og CDX2 binder til flere tarmen promotorer til at regulere tarm-specifik gentranskription [13] – [15], [17], [18]. Også GATA4, et zinkfinger transskriptionsfaktor, er involveret i reguleringen af ​​proliferation og differentiering af intestinale epitelceller og hjælper med at regulere fosterudvikling af mavetarmkanalen [19]. Undersøgelser har endvidere vist, at interaktioner af GATA4 med CDX2 og HNF-1α hjælp regulerer ekspressionen af ​​flere celle-celle adhæsion gener, herunder E-cadherin og claudin-2 [19], [20].

I denne rapport, vi viste, at colon claudin-1 genekspression er også et mål for den transkriptionelle regulering af Cdx1, CDX2 og GATA4 hvor CDX2 syntes at have mest potente virkning som en inducer af colon claudin-1-ekspression. Vi leverer data til støtte parallel korrelation mellem claudin-1 og CDX2 udtryk i tyktarmskræft patientprøver yderligere. Vigtigst er det, vores data antydede, at CDX2 regulerer claudin-1-ekspression i samarbejde med Wnt-signalering, en kendt regulator af claudin-1-ekspression.

Sekvensen af ​​claudin-1-promotoren og identifikation af transcription- initieringssite er tidligere blevet beskrevet [21]. Formodede store konsensus bindingssteder er understreget. B. Cdx1, CDX2 og GATA4 regulering af claudin-1 luciferasereportergenet. SW480 (B), HCT116 (C), MCF-7 (D) og MDCK (E) celler blev transient transficeret med et 1,2-kb claudin-1-luciferasereporterplasmid sammen med Cdx1, CDX2 og /eller GATA4 ekspressionsvektorer. Tøm pGL3-grundlæggende vektor blev anvendt til kontrolformål. Uspecifik plasmid DNA blev anvendt til at opretholde lige mængder DNA i alle transfektionsforsøg prøver. Resultater udtrykkes i fold-aktivering af relativ luciferaseaktivitet efter normalisering med

Renilla

aktivitet fra 3 uafhængige eksperimenter, og værdierne er udtrykt som middelværdi ± SD. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontrol. Forskelle mellem to grupper blev analyseret ved den tosidede Student t-test og mere end to grupper ved envejs ANOVA med post-hoc Bonferroni multiple sammenligningstest.

Resultater

Tvunget Angivelse af Cdx1, CDX2 eller GATA4 Fremkalde claudin-1 ekspression i Colon Cancer Cells

for at undersøge, om Cdx1, CDX2 og /eller GATA4 hjælpe med at regulere colon claudin-1-ekspression, vi bestemt effekten af ​​overekspression af ovennævnte transkriptionsfaktorer upon endogen claudin-1-ekspression. Til dette formål anvendte vi SW480 colon cancerceller, som udtrykker lave niveauer af endogent claudin-1 [5]. Mammale ekspressionsplasmid konstruktioner indeholdende fuld-længde Cdx1, CDX2 eller GATA4 blev transient transficeret i SW480-celler. Tomme ekspressionsplasmider tjente som kontrol. Otteogfyrre timer efter transfektion blev prøver opsamlet og blev udsat for fremstillingen af ​​lysatet eller total RNA ekstrakt. Immunoblotting under anvendelse antigen-specifikt antistof blev gjort for at bekræfte overekspression og tilsvarende niveauer af overekspression af antigener, der undersøges (figur 1A). Som vist i figur 1B, observerede vi robust opregulering af claudin-1 i celler, der overudtrykker Cdx1 (3,8 fold ± 0,451), CDX2 (6,5 fold ± 0,854) eller GATA4 (3,3 fold ± 0,115) ved proteinniveauet. Kvantitativ RT-PCR viste lignende induktion af claudin-1 mRNA-ekspression ved overekspression af alle ovennævnte transkriptionsfaktorer og endnu en gang denne induktion var maksimum i celler over-udtrykkende CDX2 (figur 1C). Denne virkning af Cdx1, CDX2 eller GATA4 upon claudin-1-ekspression var specifik, fordi ekspression af claudin-4, endnu et claudin familiemedlem, ikke blev påvirket af den tvungne ekspression af nogen af ​​ovennævnte transkriptionsfaktorer (figur 1A og amp; B).

SW480-celler blev co-transficeret med forskellige kombinationer af Cdx1, CDX2 og GATA4 ekspressionsvektorer i nærvær af indikerede reporterkonstruktioner, og luciferaseassays blev udført. Otteogfyrre timer senere blev cellerne lyseret, og luciferaseaktivitet blev målt. Resultater blev afbildet som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg og normaliseret luciferaseaktivitet i hver cellelinje blev præsenteret som relativ luciferaseaktivitet. Middelværdien af ​​celler transficeret med pGL3-basisk vektor i fravær af ekspressionsvektorer blev sat til 1. B og C. Western blot-analyse af claudin-1-protein-ekspression i SW480-celler. SW480-celler blev transficeret med forskellige kombinationer af Cdx1, CDX2 og GATA4 ekspressionsvektorer og 20 ug af proteiner blev analyseret. ** P 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 sammenlignet med kontrol. Forskelle mellem to grupper blev analyseret ved den tosidede Student t-test og mere end to grupper ved envejs ANOVA med post-hoc Bonferroni multiple sammenligningstest.

A. Reporter konstruktioner indeholdende sekventielt udgår 5′- flankerende fragmenter af 1,2 kb claudin-1 (-1160 /-260) blev fremstillet og transficeret ind SW480 (B) og HCT116 (C) celler som beskrevet under “eksperimentelle procedurer”. Resultaterne er udtrykt som relativ luciferaseaktivitet af tre forskellige eksperimenter, der udføres i tre eksemplarer (middelværdi ± S.D.). Forskelle mellem to grupper blev analyseret af to-tailed t-test og mere end to grupper ved envejs ANOVA med post-hoc Bonferroni Multiple Sammenligning test.

Cdx1, CDX2 og GATA4 Regulere claudin-1 gentranskription i Colon Cancer Cells

i ovennævnte undersøgelser, tvungen udtryk for Cdx1, CDX2 eller GATA4 resulterede i en stigning i claudin-1 protein og mRNA udtryk. Derfor vi yderligere fastslået, om Cdx1, CDX2 og /eller GATA4 hjælpe med at regulere claudin-1 transskription. I denne henseende udførte vi luciferase reporter assay under anvendelse af et humant claudin-1 promotoren (-1160 /+ 160) -luciferase reporterkonstruktion beskrevet før [21] benævnt pGL3 /-1.2Cld-1 (figur 2A) i hele manuskriptet. Den -1160 til +160 bp region af human claudin-1-promotoren indeholder formodede CDX, HNF og GATA bindingssteder langs med de formodede bindingssteder for TCF /Lef-1 (figur 2A). SW480-celler blev transient transficeret med pGL3 /-1.2Cld-1 eller pGL3-basic (vektor alene) sammen med en henvisning reporterplasmid. Luciferaseaktiviteten af ​​pGL3 /-1.2Cld-1 blev normaliseret til den for pGL3-basisk udover referencen vektor. Ektopisk udtryk for Cdx1 eller GATA4 ændrede ikke ekspressionsniveauet af CDX2, heller ikke CDX2 overekspression have en mærkbar effekt på Cdx1 eller GATA4 protein udtryk (figur 1A). Over-ekspression af enten Cdx1 eller GATA4 resulterede i en -3-fold stigning i promotoraktivitet i pGL3 /-1.2Cld-1. Imidlertid ligner overekspression af CDX2 resulterede i et 6-fold stigning i aktiviteten af ​​det samme konstrukt (figur 2B). Vi observerede en lignende tendens for induktion af pGL3 /-1.2Cld-1-drevet luciferaseaktivitet i HCT116 tyktarmskræft, som var 2,5-3 gange ved overekspression af Cdx1 og GATA4 og -4 gange ved overekspression af CDX2 (Figur 2C). Vi opnåede tilsvarende resultat anvendes en længere 3,3 kb (-3140 til +160) claudin-1 promoter reporter assay, hvilket ikke var signifikant forskellig i forhold til 1,2 Kb claudin-1 promotoren (fig S1). Derfor fortsatte vi brug af den 1,2 Kb claudin-1 promotor for yderligere undersøgelser. Vore yderligere undersøgelser støttede specificitet af vores ovennævnte resultater som overekspression af endnu en transskription faktor HNF-1α påvirkede ikke claudin-1 promotor-aktivitet i enten SW480 celler (Figur S2). Vi bekræftede yderligere specificitet af vores resultater til colon claudin-1-ekspression som tilsvarende forbigående overekspression af Cdx1, CDX2 eller GATA4 i human bryst cancerceller (MCF-7) eller renale epitelceller (MDCK II-celler) steg ikke claudin-1 promotor aktivitet (figur 2D A, B, C: konserverede domæner. B. Luciferaseaktivitet efter co-transfektion med CDX2 vildtype- og afstumpningsmutanter. Sletning af CDX2 C-terminalen (Cdx2CD) signifikant (***

s

0,001) reducerede claudin-1 reporter aktivitet. C. Western blot-analyse under anvendelse af anti-Flag-antistof til at kontrollere ækvivalent ekspression af CDX2 afstumpningsmutanter i SW480-celler transient transficeret med CDX2 trunkering mutant ekspressionsvektorer. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. D. CDX2 binding til 5′-flankerende region i claudin-1-genpromotoren vist af Chip assay. Formaldehyd tværbundet chromatin fremstillet ud fra 5 × 10

7 SW480-celler blev inkuberet med antistoffer mod CDX2 eller med IgG (negativ kontrol). Tværbinding af de immunpræcipitater blev vendt og DNA’et oprenset og analyseret under anvendelse af primere specifikke for enten claudin-1 promoter region eller for glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase. Resultater viser, at induktionen af ​​claudin-1-promotor-aktivitet ved CDX2 kræver CDX2-C-terminale domæne.

Cdx1, CDX2 og GATA4 transkriptionsfaktorer arbejder synergistisk for at regulere ekspression af forskellige gener [19]. Derfor har vi fastslået, om en lignende synergisme eksisterede blandt Cdx1, CDX2 og GATA4 i reguleringen af ​​claudin-1 gentranskription. For at teste, vi co-transficeret Cdx1 med CDX2, Cdx1 med GATA4 og CDX2 med GATA4 i SW480 celler. Faktisk co-ekspression af Cdx1 med CDX2, Cdx1 med GATA4 eller CDX2 med GATA4, alle resulterede i signifikant stigning (9-13 gange) i claudin-1 promotor-aktivitet (figur 3A). Denne synergi i reguleringen af ​​claudin-1-ekspression blev yderligere bekræftet på protein niveauer, hvor claudin-1-ekspression blev induceret (8-10 gange) sammenlignet med (3-6 gange) med Cdx1, CDX2 eller GATA4 alene (figur 3B C)

Claudin-1 promotoraktivitet i SW480 (A) og HCT 116 celler (B).. Celler blev forbigående co-transficeret med ekspressionsvektoren konstruktioner til aktiveret β-catenin (S33Y) sammen med Cdx1, CDX2 eller GATA4 ekspressionsvektorer. Claudin-1 promoter aktivitet blev ophævet ved co-transfektion af dnTcf-4 med Cdx1, CDX2 eller GATA4 ekspressionsvektorer SW480 (C) og HCT116 (D) celler.

Claudin-1 Promotor indeholder bindende steder for CDX og GATA transkriptionsfaktorer

Baseret på vores ovenstående resultater, vi undersøgt yderligere formodede bindingssteder for Cdx1, CDX2 og GATA4 i claudin-1 promotor. Vi anvendte beregningsanalyse hjælp Matlnspector software (Oxford Molecular Group) at identificere de formodede bindingssteder for konsensus Cdx- og GATA-bindende elementer (figur 2A). For at bekræfte den funktionelle virkningsfuldhed af disse formodede bindingssteder og påvise de er involveret i reguleringen af ​​claudin-1 gentransskription regioner, genereret vi claudin-1 promotor deletionskonstruktioner startende fra 5′-flankerende region som tidligere [21] beskrevne. Figur 4A viser den fulde længde promotor konstruktion (-1160 /+ 160) og ni deletionskonstruktioner (-850 /+ 160, -740 /+ 160, -665 /+ 160, -550 /+ 160, -490 /+ 160, -420 /+ 160, -350 /+ 160 og -260 /+ 160). De reporter konstruktioner genereret ovenfor blev derefter cotransficeret med Cdx1, CDX2 eller GATA4 ekspressionskonstrukter ind SW480 og HCT116 celler. Promotorkonstruktionen fuld længde indeholdt konsensus bindingssteder for CDX og GATA4, sammen med bindingsstedet for Tcf /Lef-1, og induceret claudin-1-promotor-aktivitet 5-6 gange i SW480-celler (figur 4B). Men denne induktion tabt efter sletning af den proksimale 310 bp (-1160 til -850), der foreslog, at denne 310 bp region har sites vigtige for claudin-1 promoter induktion ved transkriptionsfaktorer, der undersøges. Lignende resultater fra HCT116 celler støttede dette begreb (figur 4C). Begge cellelinjer udviste lignende mønstre af promotor-aktivitet, selv om signalerne generelt var stærkere i SW480 celler. Dette 310 bp region indeholdt en CDX, to GATA konsensus bindingssteder og en Tcf /Lef-1 bindingssted tyder potentielle betydning af disse steder i reguleringen af ​​claudin-1 genekspression.

A. Sammenhæng mellem claudin-1 og CDX2 udtryk i tyktarmskræft. Data fra brugerdefinerede kolorektal cancer væv arrays (væv microarrays udviklet på Vanderbilt), der indeholder kirurgiske prøver fra 50 primære og parrede metastatiske frisk-frosne humane kolorektal cancer prøver vises. En betydelig direkte sammenhæng mellem claudin-1 og CDX2 ekspression blev observeret (** P 0,01) ved hjælp af Yates ‘s chi square test. B. repræsentativt farvning for claudin-1 (a) og CDX2 (b) i tyktarmskræft patientprøver. Sektioner blev modfarvet med hæmatoxylin at bestemme de strukturelle detaljer.

C-terminale domæne er påkrævet for CDX2 medieret aktivering af Claudin-1 transkriptionel aktivitet

Over undersøgelser antydet en rolle Cdx1 , CDX2 og GATA4 i reguleringen af ​​claudin-1 promotor. , CDX2 viste sig imidlertid at have den mest potente virkning på claudin-1 promotor-aktivitet. Derfor, i yderligere undersøgelser, vi bestemmes CDX2 domæne, der er nødvendig for transkriptionel aktivering af claudin-1 promotor. I den forbindelse testede vi virkningen af ​​CDX2 deletionsmutant konstruktioner for deres evne til at inducere claudin-1-promotor-aktivitet (figur 5A) [22]. Immunoblotanalyse under anvendelse af anti-FLAG-antistoffet bekræftes lignende ekspressionsniveauer af CDX2 deletionsmutant konstruktioner (figur 5C). Resultaterne viste, at deletion af den kanoniske transkriptionsaktiveringsdomæne (CDX2 δ55-136), de N-terminale domæner (CDX2 δ15 eller CDX2 δ50) eller regionen mellem aminosyrerne 140 og 180 (CDX2 δ140-180) havde ingen signifikant virkning på claudin -1 promotoraktivitet. I modsætning hertil sletning af CDX2 C-terminalen 244-311 (Cdx2CD) reducerede claudin-1 promoter aktivitet ved 5-gange sammenlignet med vildtype CDX2 (figur 5B). Tilsammen disse undersøgelser tyder på, at CDX2 C-terminalen domæne er nødvendig for CDX2-afhængige induktion af claudin-1 promoter aktivering.

For yderligere at bestemme, om CDX2 binder til claudin-1 promotor

in vivo

, udførte vi chipanalyse og sammenlignet SW480 celler, der overudtrykker CDX2 med SW480-celler transficeret med den tomme ekspressionsplasmid vektor. Figuren 5D viser det resulterende DNA trækkes ned af anti-CDX2 antistofholdige sekvensen, der flankerer CDX-bindingssted. Dette antydede, at CDX2 binder til CDX-sekvenselementer inden for 310 bp af claudin-1-promotoren og denne binding stigninger upon overekspression af CDX2 i SW480-celler, som igen øger claudin-1-promotor-aktivitet. For yderligere at bestemme om C-terminal er vigtigt for CDX2 binding til claudin-1 promotoren, vi overudtrykkes Cdx2CD (C-terminal deletion mutant) eller en N- terminal deletion mutant, der ikke påvirker claudin-1 transkriptionel aktivitet (CDX2 δ50 ) i SW480 celler og udført chip analyse. Chippen analyse viste, at den forøgede binding skyldes fuldlængde CDX2 overekspression blev ophævet ved overekspression af Cdx2CD men ikke det N-terminale deletion (CDX2 δ50) mutanten (figur 5D). Disse resultater antydede, at CDX2 C-terminale domæne er vigtig for bindingen af ​​CDX2 til claudin-1 promotor og CDX2-afhængig induktion af claudin-1 promotor-aktivitet.

En funktionel Crosstalk af Wnt Signaling og CDX-relaterede Transkriptionel aktivering Regulerer Claudin-1 promotoraktivitet

Claudin-1 er et kendt mål af TCF /Lef-1-signalering [6] og Tcf /Lef-1 elementer er til stede i -1160 til -850 regionen claudin- 1 promotoren. For at teste virkningen af ​​β-catenin /Tcf /Lef-1, claudin-1-promotoren blev underkastet co-transfektion i nærvær eller fravær af aktiveret β-catenin (S33Y) sammen med Cdx1, 2 eller GATA4. Forbigående transfektioner blev udført i SW480 og HCT116-celler og luciferaseaktivitet af pGL3 /-1.2Cld-1 blev normaliseret til pGL3-Basic foruden referencen vektor. Overekspression af aktiveret β-catenin (S33Y) med Cdx1, CDX2 eller GATA4 resulterede i mindst to gange yderligere induktion af claudin-1-promotor-medieret genekspression i forhold til Cdx1, CDX2 eller GATA4 alene (figur 6A B). Omvendt, når vi overudtrykkes Cdx1, CDX2 eller GATA4 med dnTcf-4 blev induktionen af ​​claudin-1-promotoren ophævet tyder på et potentiale krydstale mellem disse faktorer (figur 6C 0,01) mellem claudin-1 og CDX2 udtryk i 36:50 (72%) coloncancer prøver (figur 7A.). Tilsammen tyder disse data en direkte sammenhæng mellem de udtryk for CDX2 og claudin-1 i kolorektale karcinomer.

Diskussion

dysregulering af colonocyte differentiering ligger kernen i colon carcinogenese. Claudin-1-ekspression er stærkt forøget i colon cancer og er kausalt forbundet med tumorvækst og progression [5]. Af interesse, ud over den dysreguleret proteinekspression og lokalisering, claudin-1 mRNA-ekspression øger også i tyktarmskræft [25]. Det er også værd at bemærke, at genetisk manipulation af claudin-1-ekspression i kolon kræftceller medførte skarpe og omvendte ændringer i deres differentiering status, herunder E-cadherin udtryk [5], [24]. Også, induktion af epitheldifferentiering i colon cancerceller ved anvendelse histondeacetylase (HDAC) -hæmmere forbundet med en specifik reduktion i claudin-1-ekspression blandt claudin familiemedlemmer [25]. Tilsammen vises claudin-1 ekspression til at påvirke kolon carcinogenese gennem modulering af colon epitelcelledifferentiering. Derfor undersøgte vi betydningen af ​​transkriptionsfaktorer vigtige i reguleringen af ​​intestinal epitheldifferentiering samt kolon carcinogenese i reguleringen af ​​claudin-1 mRNA transkription. Det centrale resultat af vores undersøgelser med anvendelse af to forskellige og udbredte tyktarmskræft cellelinjer var (i) Cdx1, CDX2 og GATA4 hjælp regulerer claudin-1-genet transskription og denne forordning var specifikke for cellerne i colon oprindelse, (ii) CDX2 er mest potent inducer af claudin-1 promotor-aktivitet blandt Cdx1, CDX2 og GATA4, og fysisk binder til CDX-konsensus bindingssted /si claudin-1 promotor, som bestemmes af chip-analyse, (iii) Cdx1, CDX2 og GATA4 regulere colon claudin-1-ekspression gennem potentiel synergi blandt hver-anden og gennem den potentielle krydstale med Wnt-signalvejen. Tilsammen i denne rapport giver vi de første indblik i de komplekse transkriptionel aktivering begivenheder, som regulerer colon claudin-1-ekspression.

Den caudale Homeoboxen protein Cdx1 hovedsageligt udtrykkes i krypten rummet, mens CDX2 protein er påvist i både krypten og villus rummene [26]. Vigtigere, resultat fra flere undersøgelser tyder på, at den rolle Cdx1 og CDX2 i reguleringen af ​​intestinal homeostase er ofte komplementære og kan afhænge af modningen af ​​de intestinale epitelceller [27]. Disse resultater er suppleret med en demonstration af en temmelig diskret rolle Cdx1 i reguleringen af ​​intestinal epitelcelleproliferation, mens CDX2 spille vigtig rolle i reguleringen af ​​differentiering status for de intestinale epitelceller [28]. GATA4 også tilhører en familie af transkriptionsfaktorer, der spiller vigtig rolle i reguleringen af ​​embryogenese og muligvis tidlig modning af intestinale epitelceller [29]. GATA4 sammen med GATA5 /6 er blevet associeret med celleoverlevelse, celleproliferation, og neoplastisk transformation af forskellige celletyper [8] – [15]. Især blandt gastrointestinale cancere, er GATA4 amplificeret i ~ 10% af esophageal adenokarcinom og Barrett metaplasi [30]. Rolle GATA4 i reguleringen af ​​colon carcinogenese er ikke godt undersøgt selvom begrænsede undersøgelser antydet, at det kan fungere som en tumor suppressor i tyktarmskræft [31]. Men man behøver at være advares i den specifikke funktionelle formulering af sådanne transkriptionsfaktorer som deres funktion /s er ofte sammenhæng afhængige og interaktion med andre transkriptionelle regulatorer er også vigtige.

Af interesse, rolle CDX2 transskription faktor i reguleringen af ​​tyktarmen carcinogenese forbliver kontroversielle og undersøgelser tyder på sin rolle som en positiv eller negativ “tumor modulator«. I denne henseende mus, som er heterozygote-null for CDX2 gen udvikle colon hamartomer efter den resterende CDX2 allelen er tabt [32], [33]. Disse heterozygotiske-null CDX2 mus er også følsomme over for azoxymethan (AOM) -induceret colon adenocarcinom [34]. Også de sammensatte heterozygoter for CDX2 og adenomatøs polypose Coli (APC) gener udvikle mere adenomatøs polypper i tyktarmen i forhold til deres heterozygot

Apc

søskende [35]. Tilsammen ville ovenstående resultater tyder funktion af CDX2 som et kolon tumor suppressor. Imidlertid har immunhistokemisk analyse opdaget stærk CDX2 udtryk i -90% af de menneskelige tyktarmskræft prøver [38], [39]. Endvidere CDX2-overekspression i kolon kræftceller inducerer forankringsuafhængig vækst og celle overlevelse [36]. Af interesse, CDX2 fremmer forankringsuafhængig vækst gennem transkriptionel repression af IGFBP-3 [37]. Således kan man forestille sig en tumor-fremmende rolle CDX2 i tyktarmskræft. Tilsammen kan det postuleres, at den rolle CDX2 i reguleringen af ​​tyktarmskræft kan afhænge af differentiering status tyktarmskræft celler og interaktion med andre transkriptionsfaktorer.

Resultater fra flere undersøgelser har afsløret eksistensen af et komplekst samspil mellem Cdx1, CDX2, GATA4 og HNF-1α i induktion af intestinal genekspression herunder claudin familiemedlem, claudin-2 [40], [41]. Det er vigtigt at bemærke, at i lighed med claudin-1, er claudin-2-ekspression også opreguleret i colon carcinogenese [42]. CDX2 er blevet påvist at spille rolle i reguleringen af ​​andre celle-celleadhæsionsproteiner herunder LI-cadherin, claudin-3 og claudin-4 [20]. I vores aktuelle undersøgelse har vi identificeret konsensus CDX-bindingssted samt GATA-bindingssted i den menneskelige claudin-1 promotor. Den omstændighed, at tvungen ekspression af Cdx1, CDX2 eller GATA4 inducerede ikke kun claudin-1-protein og mRNA-ekspression, men også induceret luciferase-reporter-aktivitet afhængig af fuld længde human claudin-1 promotoren (-1160 til +160) understøtter en kausal rolle på over transkriptionsfaktorer i reguleringen af ​​claudin-1-ekspression. Navnlig deletion af claudin-1 promotorsekvens fra -1160 til -840 bp (310 bp deletion) af 5′-flankerende region, der indeholder Cdx- og GATA4 bindingssteder modvirkede stigningen i luciferaseaktiviteten, ved anvendelse af fuld længde promotorkonstruktionen. Endvidere vores konklusion, at Cdx1, CDX2 eller GATA4-afhængig induktion af claudin-1 promotor-aktivitet kan øges yderligere, når over transkriptionsfaktorer blev co-udtrykt understøtter en kompleks indbyrdes afhængighed mellem disse transkriptionsfaktorer i reguleringen af ​​claudin-1-ekspression . Det faktum, at lignende tvungen udtryk for HNF-1α ikke påvirkede claudin-1-ekspression gør specificitet til vores resultater (Figur S2). Yderligere, vores fund, at tilsvarende overekspression af Cdx1, CDX2 eller GATA4 i de renale epiteliale og brystcancerceller havde ingen tilsyneladende virkning på claudin-1-ekspression antyder, at dette ikke er en universel mekanisme claudin-1 ekspression og er snarere colon specifik. Det er muligt, at disse faktorer kan kræve andre cofaktorer at være aktiv, som er til stede i tyktarmen cancerceller.

Vores data foreslås endvidere, at blandt de transkriptionsfaktorer der undersøges, CDX2 er den mest potente inducer af claudin-1-ekspression. Faktisk vores undersøgelser under anvendelse chipanalyse påvist en direkte association af CDX2 med claudin-1-promotoren og således foreslået, at claudin-1 er et direkte mål for CDX2-afhængig transkriptionel regulering. Det er endvidere bemærkelsesværdigt, at observeret binding af CDX2 med claudin-1-promotoren ikke var afhængig af CDX2-transkriptionsaktiveringsdomæne som deletion af CDX2 N-terminus (Cdx2ND) havde ingen virkning på CDX2 binding med claudin-1-promotoren.