PLoS ONE: Analyse af MET mRNA ekspression i Gastric kræftformer Brug RNA in situ-hybridisering assay: Dens kliniske betydning og sammenligning med Immunhistokemi og sølv in situ-hybridisering

Abstrakt

Vi undersøgte

MET

mRNA-ekspression status ved hjælp af RNA in situ hybridisering (ISH) teknik i primære og metastatiske læsioner af 535 kirurgisk resektion gastrisk karcinom (GC) tilfælde. Vi sammenlignede resultaterne med dem af immunhistokemi og sølv in situ hybridisering, og undersøgt sammenhængen med clinicopathologic karakteristika og prognose. Blandt 535 primære GCS, 391 (73,1%) blev bedømt 0, 87 (16,3%) blev bedømt 1, 38 (7,1%) blev bedømt 2, 12 (2,2%) blev bedømt 3 og 7 (1,3%) blev bedømt 4 af RNA ISH. Høj

MET

mRNA-ekspression (score ≥3) var forbundet med lymfeknude metastaser (

P

= 0,014), fjernmetastaser (

P

= 0,001), og højere TNM stadie (

P

0,001).

MET

mRNA ekspression blev korreleret med proteinekspression (r = 0,398;

P

0,001) og gen-kopi nummer (r = 0,345;

P

. 001). Patienterne viser høj

MET

mRNA i primære eller metastatiske læsioner havde kortere samlet overlevelse end de viser lav

MET

mRNA (primære tumorer,

P

= 0,002; metastatiske lymfeknuder,

P

0,001). De patienter, der viser positive konvertering af

MET

mRNA status i metastatisk lymfeknude havde kortere samlet overlevelse end dem uden konvertering (

P

= 0,011). Multivariat analyse viste, at høj

MET

mRNA-ekspression i metastatisk lymfeknude var en uafhængig prognostisk faktor for samlet overlevelse (

P

= 0,007). Derfor er denne undersøgelse tyder på, at

MET

mRNA-ekspression vurderet af RNA ISH kunne være nyttig som en potentiel markør for at identificere

MET

onkogen-afhængige GC

Henvisning:. Choi J Lee HE, Kim MA, Jang BG, Lee HS, Kim WH (2014) Analyse af

MET

mRNA ekspression i Gastric kræftformer Brug RNA in situ-hybridisering assay: Dens kliniske betydning og sammenligning med Immunhistokemi og sølv In situ hybridisering. PLoS ONE 9 (11): e111658. doi: 10,1371 /journal.pone.0111658

Redaktør: Svetlana Pack, CCR, National Cancer Institute, NIH, USA

Modtaget: 11. marts 2014 Accepteret: 6 okt 2014; Udgivet: November 3, 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grundforskningsfonden Korea (NRF) A3 fremsyn program (https://www.nrf.re.kr). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i det sidste årti, receptor (RTK) veje har vist sig at være attraktive lægemiddelkandidater mål for anticancer terapi [1], og MET vej er en af ​​disse lovende mål.

MET

er et proto-onkogen beliggende på 7q31 locus og koder for en RTK til hepatocytvækstfaktor (HGF) [2], [3]. Den stramme regulering af HGF /met-vejen, der er observeret i udvikling og regeneration er tabt i cancer, og en sådan deregulering sker via flere mekanismer [1]. Afvigende MET-aktivering spiller en vigtig rolle i cancer celle overlevelse, vækst, angiogenese og metastase i forskellige cancerformer, herunder lunge-, bryst-, nyre- og gastrointestinalkanalen maligniteter [4]. Men selv om patienten lagdeling ifølge MET ekspression eller aktivitet er vigtig for terapeutisk succes, metoderne til at vurdere niveauet af MET ekspression eller aktivitet er ikke fastslået [4].

For gastrisk karcinom (GC), afvigende MET aktivering, er blevet anset for at være relateret til et gen doseringseffekt [5], og

MET

genamplifikation (GA) eller protein-overekspression er blevet forbundet med aggressive tumor egenskaber og /eller dårligere kliniske resultater [6] – [14]. Desuden

MET

-amplified eller -overexpressed GC viste respons på behandling med flere hæmmere af HGF /MET signalvejen i prækliniske undersøgelser [15] og fase I kliniske forsøg [12], [16]. Derfor MET inhibering har potentiale som en anden succesfuld terapeutisk strategi efter human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) -targeted terapi i avanceret GC. Imidlertid har tidligere undersøgelser anvendt forskellige metoder til at identificere MET-positive GC og har vist uoverensstemmelsen i forekomsten af ​​MET overekspression eller forstærkning: MET overekspression varierede 18% til 73,7% i undersøgelser med anvendelse af immunhistokemisk (IHC) [7] – [9], [13], [14], [17],

MET

genkopitallet (GCN) gevinst varierede 10% til 21,2% i undersøgelser ved hjælp af kvantitativ real-time polymerase chain reaction (qPCR) [10], [ ,,,0],11], og

MET

GA varierede 2% til 3,9% i undersøgelser under anvendelse af fluorescens in situ hybridisering (FISH) [12], [18], eller sølv in situ hybridisering (SISH) [13]. Af disse metoder, er IHC almindeligt anvendt i klinisk praksis og den mest sandsynlige screening metode til påvisning af MET-positive GC. Imidlertid er yderligere udforskning stadig behov for at finde en prædiktiv biomarkør eller analyse metodologi for MET inhibering terapi.

I denne undersøgelse udførte vi et RNA in situ hybridisering (ISH) under anvendelse af parrede DNA oligonukleotidprober og forforstærker-forstærker -mærket, prober til visualisering [19]. Denne metode bruger formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) væv og muliggør enkelt molekyle visualisering under en lys-felt mikroskop. I vores tidligere undersøgelse, vi bevist, at

HER2

mRNA-ekspression evalueret af RNA ISH var godt korreleret med protein overekspression og GA evalueret af IHC og fisk i 211 GC tilfælde [20]. Også, vi viste sammenhængen mellem

MET

GCN og proteinekspression i en tidligere undersøgelse [13]. Her har vi evalueret

MET

mRNA-ekspression ved hjælp RNA ISH metode, og sammenlignet resultaterne med dem af IHC og SISH i en stor serie af GC. Desuden clinicopathologic parametre og kliniske resultater af GC patienter i henhold til

MET

mRNA-ekspression status blev evalueret.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Vi indsamlede arkivering vævsprøver af GC patienter, der fortløbende undergik gastrektomi ved Seoul National University Hospital, Seoul, Korea, fra januar 2004 gennem december 2005. Endelig 535 prøver af primær GC og 199 prøver af synkron regional metastatisk lymfeknude (LN) fra 535 patienter var tilgængelige for denne undersøgelse. De clinicopathologic karakteristika for de patienter blev undersøgt ved at gennemgå medicinske diagrammer og patologiske optegnelser (tabel 1). TNM stadie blev klassificeret i henhold til ordningen for amerikanske Blandede Cancer Staging Manual, 7

th edition. Kliniske resultater blev fulgt op fra datoen for operationen indtil døden eller 60 måneder.

Alle vævsprøver blev fikseret i 10% bufferet formalin i 24-48 timer og derefter indlejret i paraffin. Core væv (2 mm i diameter) blev taget ved hjælp af en trepan apparat (Superbiochips Laboratories, Seoul, Korea). For de primære GC’ers blev invasionen foran hver primær tumor valgt. Metastatiske LN blev underkastet den vævsarray men tilfælde med mikrometastase blev udelukket. I alt 22 væv microarray blokke, som indeholdt op til 60 kerner blev konstrueret.

Etisk erklæring

Alle humane prøver blev opnået under terapeutisk kirurgi. Deltagerne gav ikke skriftligt samtykke til at deltage i denne undersøgelse. Den retrospektiv undersøgelse blev udført ved anvendelse af prøverne i løbet af hylderne efter patologisk diagnose, og alle prøverne blev anonymiseret før undersøgelsen. Vores IRB (Seoul National University Hospital) godkendte denne retrospektiv undersøgelse på betingelse af anonymisering (Reference: H-1006-035-320).

RNA ISH

For in situ detektion af

MET

mRNA, den RNAscope FFPE 2,0 assaykit (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA) blev anvendt ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev 2- til 3-um tyk FFPE vævssnit afparaffineret, opvarmet, behandles med protease, og hybridiseret med probe ved 40 ° C i 2 timer (referencesekvensen, NM_001127500; proberegion, 1236-2257). Efter vask og amplifikation, 3, 3′-diaminobenzidin tilsat til påvisning af mål-RNA. Kerner blev modfarvet med hematoxylin. Positiv farvning blev indikeret ved brune punktformig prikker i kernen og /eller cytoplasma.

MET

mRNA ekspression niveauer blev kategoriseret i 5 karakter efter producentens scoring retningslinje: score 0, ingen farvning eller 1 dot per celle; score 1, 1-3 punkter pr celle (synlige ved 20-40 ×); score 2, 4-10 punkter pr celle og ingen eller meget få dot klynger (synlige ved 20-40 ×); score 3, 10 dots per celle og 10% positive celler har dot klynger (synlige på 20 ×); score 4, 10 dots per celle og 10% positive celler har dot clusters (synlige ved 20 ×) (figur 1). Proberne for

UBC

(ubiquitin C) og

dapB

(et bakterielt gen) blev anvendt som den positive og negative kontrol hhv. Prøver blev anset tilstrækkeligt, når de

UBC

mRNA-signaler var let synlige under en 10x objektiv og

dapB

signal var ikke synlig.

(A-C) en negativ tilfælde viser

MET

RNA ISH score 0: (A)

MET

mRNA, (B)

UBC

mRNA, og (C)

dapB

mRNA . (D-F) en positiv sag viser MET RNA ISH score 4: (D)

MET

mRNA, (E)

UBC

mRNA, og (F)

dapB

mRNA (original forstørrelse: × 400).

IHC og SISH

immunhistokemisk farvning for markedsøkonomisk behandling blev udført med anti-alt MET (SP44) kanin monoklonale primære antistoffer (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA). En automatisk immunostainer (BenchMark XT, Ventana Medical Systems) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. MET immunfarvning blev scoret med HercepTest scoringsvejledning for GC (DAKO, Glostrup, Danmark): score 0, ingen membranfarvning eller membranfarvning i 10% af tumorcellerne; score 1, svag /næppe mærkbar delvis membran farvning i 10% af tumorcellerne; score 2, svag til moderat farvning af hele membranen i 10% af tumorcellerne; score 3, stærk farvning af hele membranen i . 10% af tumorceller (figur 2)

(A) IHC score 1, (B) IHC score 2, (C) IHC score 3, og (D) genamplifikation (original forstørrelse: × 400).

Dual-farve SISH assay blev udført med INFORM MET DNA-probe og INFORM kromosom 7 sonde (Ventana Medical Systems) på en Ventana BenchMark XT efter fabrikantens protokoller. Signaler blev optalt i 40 tumor kerner per kerne, og

MET

gen status blev klassificeret i 6 grupper ved hjælp af University of Colorado Cancer Center kriterier for epidermal vækstfaktor receptor genet [21] (Figur 2).

Statistisk analyse

χ

2 test eller Fishers eksakte test blev anvendt til at teste sammenhængen mellem markedsøkonomisk status og clinicopathologic faktorer. Den studerendes

t

-test blev brugt til at sammenligne hjælp af kontinuerlige variabler. Den Spearman korrelation test blev anvendt til at vurdere forholdet mellem RNA ISH resultater og IHC eller SISH- resultater. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere den samlede overlevelse (OS), og OS forskelle mellem grupper med forskellige MET status blev sammenlignet ved hjælp af log-rank test. Multivariat overlevelse analyse blev udført under anvendelse af Cox proportional hazard ratio model. Dataanalyse blev udført ved hjælp af SPSS-version 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA), og resultaterne blev betragtet som signifikante, når

P

. 0,05

Resultater

1.

MET

mRNA status vurderet af RNA ISH

Af 535 primære tumorer, 391 (73,1%), 87 (16,3%), 38 (7,1%), 12 (2,2%) og 7 ( 1,3%) viste RNA ISH score 0, 1, 2, 3, og 4, hhv. Når vi sammenlignede resultaterne af RNA ISH med clinicopathologic data, herunder overlevelse, og analyseret resultaterne af RNA ISH med IHC og SISH- data, de grupper af score 3 og 4 viste særlige kendetegn. Derfor vi betragtet stillingen 3 og 4 som høj-

MET

mRNA gruppe, og alt 19 tilfælde (3,5%) tilhørte fremhæve

MET

mRNA.

Høj –

MET

mRNA var forbundet med højere alder (

P

= 0,002), større tumor størrelse (

P

= 0,006), LN metastaser (

P

= 0,014), lymfatisk invasion (

P

0,001), øget antal metastatiske lymfeknuder (

P

0,001), fjernmetastaser (

P

= 0,001), og højere TNM stadie (

P

0,001) sammenlignet med lav-

MET

mRNA (tabel 2). Men høj

MET

mRNA viste ingen forbindelse med køn, tumor placering, Lauren klassificering, og invasion dybde (tabel 2).

Af 199 synkrone metastatiske LN, 119 (59,8%), 45 (22,6%), 22 (11,1%), 4 (2,0%) og 9 (4,5%) viste RNA ISH score 0, 1, 2, 3, og 4, hhv. Derfor 13 tilfælde (6,5%) var høj

MET

mRNA. Blandt 199 par af primære og metastatiske læsioner, 186 (93,5%) viste overensstemmende

MET

mRNA status og 13 (6,5%) ikke gjorde. Af disse 13 uharmoniske tilfælde blev negativ konvertering fundet i 50% (7/14) af høj-

MET

mRNA primære tumorer, og positiv konvertering blev fundet i 3,2% (6/185) i lav-

MET

mRNA primære tumorer (tabel 3).

2. MET protein og GCN status vurderet af IHC og SISH-

Ved hjælp af IHC, 236 (44,1%), 171 (32%), 113 (21,1%) og 15 (2,8%) primære tumorer blev scoret 0, 1, 2 og 3, henholdsvis. IHC score 3 viste tydelige clinicopathologic funktioner, og denne MET overekspression gruppe var signifikant associeret med højere alder (

P

= 0,005), større tumor størrelse (

P

= 0,009), invasion dybde (

P

= 0,05), LN metastaser (

P

= 0,018), lymfatisk invasion (

P

= 0,026), øget antal metastatiske lymfeknuder (

P

0,001), fjernmetastaser (

P

= 0,007), og højere TNM stadie (

P

= 0,001). Men MET overekspression ikke nogen forbindelse med køn, tumor placering, og Lauren klassifikation (tabel S1).

Af 199 synkron metastatiske LN, 46 (23,1%), 92 (46,2%), 46 (23,1 %) og 15 (7,5%) viste IHC score 0, 1, 2 og 3, henholdsvis. Blandt 199 par af primære og metastatiske læsioner, 187 (94,0%) viste overensstemmende MET protein status og 12 (6,0%) ikke gjorde. Af disse 12 uharmoniske tilfælde blev negativ konvertering fundet i 36,4% (4/11) af primære tumorer med MET overekspression, og positiv konvertering blev fundet i 4,3% (8/188) af primære tumorer uden markedsøkonomisk overekspression.

Brug SISH,

MET

GA blev observeret hos 2,6% (14/535) af primære tumorer.

MET

GA viste signifikant sammenhæng med større tumorstørrelse (

P

= 0,038), lymfatisk invasion (

P

= 0,009), øget antal metastatiske lymfeknuder (

P

0,001), fjernmetastaser (

P

= 0,005), og højere TNM stadie (

P

= 0,002). Men

MET

GA viste ingen forbindelse med køn, tumor placering, Lauren klassificering, invasion dybde og LN metastaser (tabel S2).

3. Korrelation af markedsøkonomisk behandling evalueret af RNA ISH, IHC og SISH

Sammenhængen mellem

MET

mRNA og protein status vurderet af RNA ISH og IHC er præsenteret i tabel 4. I 535 primære tumorer, der var en positiv korrelation mellem

MET

mRNA og protein-ekspression (r = 0,398,

P

0,001). Alle 7 tilfælde med RNA ISH score 4 viste MET protein overekspression. Blandt 12 tilfælde med RNA ISH score 3, 5 tilfælde (41,7%) viste IHC score 3. tilfælde med RNA ISH score 2 udstillet variable IHC scoringer. Tilfælde med RNA ISH score 0 eller 1 viste ikke MET protein overekspression bortset fra 1 tilfælde. Blandt 10 sager viser uoverensstemmelse (dvs. positiv i RNA ISH og negativ i IHC eller omvendt), 8 viste IHC score 2 eller RNA ISH score 2. I 199 metastatiske LN, der var en god positiv korrelation mellem

MET

mRNA og protein-ekspression (r = 0,462,

P

0,001). (tabel S3)

Desuden var der en positiv korrelation mellem

MET

mRNA-ekspression og

MET

GCN (r = 0,345;

P

0,001) (tabel 4). Blandt de 7 tilfælde med RNA ISH score 4, 6 (85,7%) viste

MET

GA og kun ét tilfælde viste HP (14,3%). De 12 tilfælde med RNA ISH score 3 viste GA (50%) eller polysomy (50%) af SISH. Sagerne med RNA ISH score 2 viste forskellige SISH- mønstre herunder GA (5,3%). Ingen af ​​de tilfælde med RNA ISH score 0 eller 1 viste GA.

Tabel 5 opsummerer resultaterne af RNA ISH, IHC og SISH af primær GC. Blandt de 535 sager, 513 sager (95,9%) var negative ved både RNA ISH og IHC, og kun 22 tilfælde (4,1%) viste positive resultater ved enten RNA ISH eller IHC. Disse 22 tilfælde udstillet

MET

GA (54,5%) eller polysomy (45,5%) ved SISH, og disomi eller trisomi blev aldrig observeret. Med hensyn til SISH, blandt de 14 tilfælde, der viser GA, 11 sager (78,6%) udviste høj ekspression af både mRNA og protein. Blandt de 58 tilfælde, der viser HP dog kun 7 tilfælde (12,1%) udviste høj ekspression af enten mRNA eller protein. Blandt de 111 tilfælde, der viser LP, kun 3 tilfælde (2,7%) udviste høj mRNA-ekspression. Alle 352 sager viser disomi eller trisomi udstillet negative resultater af både RNA ISH og IHC.

4. Prognostiske konsekvenser af markedsøkonomisk behandling i primære og metastatiske læsioner

High

MET

mRNA i primære tumorer eller metastatisk LN var signifikant forbundet med dårlig OS (primære tumorer,

P

= 0,002, figur 3A, metastatiske LN,

P

0,001, figur 3D). I de primære tumorer med lav

MET

mRNA, patienter med positive konvertering viste dårligere OS end dem uden konvertering (

P

= 0,011, figur 3F). I de primære tumorer med høj

MET

mRNA, patienterne med negativ konvertering viste bedre OS end dem med ingen konvertering, men der var ingen statistisk signifikans (

P

= 0,137, figur 3F ).

I 535 primær GC, (A) høj

MET

mRNA blev forbundet med dårlig OS i forhold til lav-

MET

mRNA (

P

= 0,002), (B) MET overekspression blev forbundet med dårlig OS sammenlignet med ingen overekspression (

P

= 0,001), og (C)

MET

genamplifikation blev forbundet med dårlig OS sammenlignet med ingen forstærkning (

P

= 0,005). I 199 metastatisk lymfeknuder, (D) høj-

MET

mRNA blev forbundet med dårlig OS i forhold til lav-

MET

mRNA (

P

0,001), og (E) MET overekspression blev forbundet med dårlig OS sammenlignet med ingen overekspression (

P

= 0,024). (F) I 199 matchede primære tumorer og metastatiske LN, samstemmende positive og positive konvertering grupper blev forbundet med dårlig OS i forhold til samstemmende negativ gruppe (samstemmende negativ vs. negativ konvertering,

P

= 0,640; samstemmende negativ vs . positive konvertering,

P

= 0,011; samstemmende negativ vs. samstemmende positive,

P

0,001; samstemmende positiv vs. negativ konvertering,

P

=. 137; samstemmende positive vs. positiv konvertering,

P

= 0,382;. negative konvertering vs. positive konvertering,

P

= 0,260)

MET overekspression i primære tumorer eller metastatisk LN var signifikant forbundet med dårlig OS (primære tumorer,

P

= 0,001, figur 3B, metastatiske LN,

P

= 0,024, figur 3E). I de primære tumorer uden MET overekspression, positiv konvertering trended mod forudsigelse af dårlig OS, men der var ingen statistisk signifikans (

P

= 0,393). I de primære tumorer med MET overekspression viste negativ konvertering en tendens til bedre OS end ingen konvertering, men det nåede ikke statistisk signifikans (

P

= 0,132). Desuden

MET

GA i primære tumorer var også signifikant forbundet med dårlig OS (

P

= 0,005, figur 3C).

I multivariat analyse, høj-

MET

mRNA i metastatiske LN var en uafhængig negativ prognostisk faktor for OS, efter justering for alder ( 60 y vs. ≥60 y), Lauren klassifikation (tarm form vs. diffus eller blandet type), og TNM trin (I-II vs. III-IV). Det var hazard ratio 2,27 (

P

= 0,007) (tabel 6). Men MET overekspression i metastatiske LN var ikke en statistisk signifikant prognostisk faktor ved multivariat analyse, selv var hazard ratio 1,76 (

P

= 0,067). Desuden

MET

GA, høj-

MET

mRNA eller protein overekspression i primær tumor ikke var en statistisk signifikant prognostisk faktor ved multivariat analyse (data ikke vist).

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, vi viste, at høj

MET

mRNA-ekspression signifikant associeret med negative clinicopathologic funktioner og dårlig prognose i en stor serie af GC patienter, der anvender RNA ISH metode. Derudover blev RNA ISH resultater godt korreleret med de SISH og IHC. De tidligere undersøgelser evaluere

MET

mRNA-niveauer i GC brugte Northern blot-assay [8], [22] eller revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR) [8], [14], [23] – [25]. Men de fleste af studierne havde små stikprøvestørrelser, og kun få af dem undersøgt sine kliniske implikationer [22], [24] eller udført sammenligning med DNA eller protein status [14], [25]: Kuniyasu et al. først studerede MET mRNA-ekspression ved hjælp af Northern-blot-analyse, og de rapporterede, at ekspressionen af ​​6,0 kb udskrift var tæt korreleret med tumor scene og LN metastaser [22]. Amemiya et al. rapporterede, at trin IV GC patienter med levermetastaser viste højere MET-ekspression på både mRNA og protein niveauer end stadie IV GC patienter uden levermetastaser anvendelse af RT-PCR og IHC [24].

For nylig har vi beskrevet, at høje niveauer af

HER2

mRNA var godt korreleret med protein overekspression og GA ved at sammenligne resultaterne af 4 forskellige in situ-baserede metoder (RNA ISH, IHC, FISH, og SISH-) i 211 GC sager [20]. Ligeledes i denne undersøgelse for markedsøkonomisk status, resultaterne af RNA ISH viste temmelig god korrelation med de IHC og SISH. Disse resultater understøtter, at RNA ISH kan være en pålidelig analyse for FFPE vævsprøver, selv om der er behov for yderligere valideringsundersøgelser.

Vi viste, at

MET

GA, høj

MET

mRNA og protein-overekspression evalueret af SISH, RNA ISH og IHC var stærkt overensstemmende, og høj MET status på DNA, mRNA og protein blev signifikant associeret med dårlig prognose. Disse resultater understøtter, at MET overekspression skyldes primært øget

MET

GCN og denne mekanisme bidrager til aggressiv adfærd

MET

onkogen-afhængige GC. Ikke desto mindre var der nogle tilfælde, der viser uoverensstemmelse blandt de

MET

GCN, mRNA og protein niveauer. Vi spekulere, at tekniske problemer (fx sensitivitet og specificitet af proben eller antistoffet, og dårlig mRNA kvalitet af FFPE væv) og intratumoral heterogenitet markedsøkonomisk status kan være de væsentligste årsager til denne uoverensstemmelse. Dog kan nogle biologiske mekanismer også være relateret til denne uoverensstemmelse. For eksempel, MET overekspression uden GA kan opstå gennem transkriptionel aktivering via HGF-afhængig autokrine /parakrine løkker eller andre signalveje [23], [26]. Tværtimod

MET

GA kan ikke øge genproduktet. Asaoka et al. rapporterede, at nogle få GC cellelinier huser

MET

GA udtrykte protein som samme niveau som andre cellelinjer uden GA, men deres tyrosinrester på kinasedomænet var mere phosphoryleret [27]. Mekanismerne i MET-aktivering og den rolle af HGF i GC mangler at blive belyst.

Det er velkendt, at

MET

spiller en rolle i metastaserende progression af cancer. Flere undersøgelser har vist, at

MET

GA eller overekspression var forbundet med LN metastaser [7], [13], [22] eller fjernmetastaser [13], i GC patienter. Derudover blev det vist, at indgivelsen af ​​MET inhibitor reduceret peritoneal formidling af GC i en xenograft model [23]. Endvidere Di Renzo et al. fandt, at cancerceller, der bærer

MET

aktiverende mutationer blev valgt under metastatisk spredning af hoved og hals pladecellecarcinomer ved at sammenligne gensekvensen mellem primær tumor og metastatisk lymfeknude [28]. Imidlertid har direkte sammenligning af markedsøkonomisk behandling mellem primær tumor og metastase ikke udført i et stort serie af GC. Når vi sammenlignede MET udtryk status mellem 199 matchede primære tumorer og metastatiske LN, og den samlede konkordans var 93,5% og 94% af RNA ISH og IHC hhv. Disse resultater antyder, MET ekspression status GC er relativt konstant under metastase til regionale LN. Men positiv konvertering af

MET

mRNA status var signifikant associeret med dårlig prognose ved univariate og multivariate analyse. Derfor er disse resultater antyder, at evalueringen af ​​MET-status i metastatiske læsioner kan være vigtigt at forudsige prognose og at identificere yderligere kandidater til MET-målrettet terapi.

In situ-baserede RNA-analyse har flere fordele i forhold til “grind og binder ‘analyse, såsom RT-PCR [19] og gælder for både klinisk praksis og retrospektiv forskning. Desuden RNA ISH er gunstigere end IHC når der ikke er egnet antistof eller når målmolekylet er udskilt protein. Med hensyn til

MET

, kan denne fordel være nyttige, fordi de HGF-producerende celler kan visualiseres i et vævssnit ved hjælp af HGF-proben. Imidlertid sårbar mRNA-stabilitet under vævsbehandling og højere omkostninger end for IHC er ulemperne ved RNA ISH metode. Vi håber, at yderligere tekniske forbedringer vil løse disse begrænsninger.

I denne retrospektive undersøgelse,

MET

mRNA status evalueret af RNA ISH er godt korreleret med protein og GCN vurderet af IHC og SISH henholdsvis og

MET

GA er meget samstemmende med høj ekspression af enten mRNA eller protein. I overlevelsesanalyse, høj ekspression af

MET

mRNA i primære eller metastatiske læsioner, og positiv konvertering af

MET

mRNA status er signifikant associeret med dårlig prognose. Desuden

MET

mRNA status i metastatiske LN er en uafhængig prognostisk faktor ved multivariat analyse. Vores resultater viser, at

MET

mRNA kan være et alternativ markør for at identificere den

MET

onkogen-afhængige GC.

Støtte oplysninger

tabel S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0111658.s001

(DOCX)

tabel S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0111658.s002

(DOCX)

tabel S3.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0111658.s003

(DOCX)

Tak

Vi er meget taknemmelige for Ms Hyun Ju Park for hendes teknisk support