PLoS ONE: Sammenligning af CpG Island Methylator Fænotype (CIMP) Frekvens i Colon Cancer Brug af forskellige Probe- og Gene-Specific Scoring Alternativer på Anbefalet Multi-Gene paneler

Abstrakt

Baggrund

I kolorektal cancer en særskilt undergruppe af tumorer demonstrere CpG øen methylator fænotype (CIMP). Men en konsensus om, hvordan man score CIMP ikke nået, og variation i definitionen kan påvirke rapporterede CIMP prævalens i tumorer. Således har vi søgt at sammenligne øjeblikket foreslåede definitioner og cut-offs for methylering markører, og hvordan de påvirker CIMP klassificering i tyktarmskræft.

Metoder

Methylering-specifikke multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MS -MLPA), med efterfølgende fragment analyse blev anvendt til at undersøge methylering af tumorprøver. I alt blev 31 CpG sites, som ligger i 8 forskellige gener (RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 og CACNA1G) undersøgt i 64 forskellige kolon kræft og 2 tyktarmskræft cellelinjer. Den Ogino genet panel omfatter alle 8 gener, ud over den Weisenberger panel hvoraf kun 5 af de 8 gener inkluderet blev undersøgt. I alt blev 18 alternative kombinationer af scoring af CIMP positivitet på probe-, gene- og panel-niveau analyseret og sammenlignet.

Resultater

For 47 prøver (71%), den CIMP status var konstant og uafhængig af kriterier, der anvendes til scoring; 34 prøver blev konstant scoret som CIMP negativ, og 13 (20%) konsekvent scoret som CIMP positiv. Kun fire af 31 prober (13%) undersøgte viste ingen forskel i antallet af positive prøver under anvendelse af de forskellige cut-offs. Inden panelerne blev der observeret en tendens, at forøgelse af genet niveau stringens resulterede i en større forskel i CIMP positive prøver end på at øge probe-niveau stringens. En væsentlig forskel mellem positive prøver ved hjælp ‘de strengeste’ i forhold til ‘de mindst strenge’ kriterier (20% vs. 46%, henholdsvis; p 0,005). Blev demonstreret

Konklusioner

en statistisk signifikant variation i hyppigheden af ​​CIMP afhængig af cut-offs og gener, der indgår i et panel blev fundet, med dobbelt så mange positiver prøver ved mindst i forhold til de strengeste anvendte definition

Henvisning:. Berg M, Hagland HR, Søreide K (2014) Sammenligning af CpG Island Methylator Fænotype (CIMP) Frekvens i Colon Cancer Brug af forskellige Probe- og Gene-Specific Scoring Alternativer på Anbefalet Multi-Gene paneler. PLoS ONE 9 (1): e86657. doi: 10,1371 /journal.pone.0086657

Redaktør: Hassan Brim, Howard University, USA

Modtaget: September 17, 2013; Accepteret: 16. december 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Berg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse var delvist finansieret af tilskud fra Folke Hermansen Cancer Foundation (tilskud # 424.508 til KS for MB som en ph.d.-stipendiat) (https://www.folke-fondet.org), Mjaaland Cancer Fund (tilskud # 424.506 til KS ), Stavanger Universitetshospital Forskningsråd og med tilskud fra Institut for kirurgiske Fakultet, universitetet i Bergen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en genetisk sygdom forårsaget af ophobning af molekylære ændringer og modifikationer på DNA, der driver tumorigenese [1]. Korrekt molekylær karakterisering af kræft geno- og fænotyper er vigtigt at afsløre markører for tidlig påvisning, prognosticering eller forudsigelse, samt øge forståelsen for sygdomsprocesser, der kan tilvejebringe oplysninger til terapeutisk intervention. Tyktarmskræft er en godt undersøgt cancer model, for hvilke tumorer er nu adskilt i tre fænotypiske undergrupper, afhængigt af den fremherskende type genetiske afvigelser: chromosomal ustabilitet (CIN) henviser til ændringer på kromosom niveau (fx kopital ændringer); mikrosatellit instabilitet (MSI) henviser til ændringer i basepar-repeats (fx baseændring i dinukleotidet gentage CA

6), og; CpG island methylator fænotype (CIMP) betegner en afvigende methylering spektrum (f.eks hypo- eller hyper methyleret cytosiner i promotorregionen), sammenlignet med normale celler [2], [3].

CpG-ø methylering test har blevet foreslået som et redskab til kræft påvisning, prognose, og påvisning af tilbageværende sygdom i både blod eller andre kropsvæsker [4], og indikerer, at status for methylering er af klinisk relevans [5] – [9]. Desuden methylering specifikke analyser er kommercielt tilgængelige i dag for at opdage kolorektal cancer, enten som test for methylering af vimentin i fæcesprøver eller teste for methylering af

SEPT9

i blod [6], [10].

i de senere år har opmærksomheden været fokuseret på biologi og potentielle kliniske betydning af CpG øen methylator fænotype (CIMP) i CRC [11], [12]. Selv om det er generelt godt accepteret, at der findes ætiologisk og klinisk adskilte undergrupper [13], [14], en præcis definition af CIMP stadig at blive etableret, både metodisk og på molekylært niveau [15]. Den stigende brug af avanceret teknologi også for methylering undersøgelser har vist stor effekt og foreslog flere paneler,

f.eks

at støtte i diskrimination af kolorektal tumor fra epitelceller, skelne mellem sygdom stadier, prognostiske grupper og undergrupper forbundet til andre molekylære funktioner [16] – [18]. Den manglende konsensus til bestemmelse af CIMP fænotype skyldes dels det faktum, at årsagen til ændrede methylering mønster stort set forbliver ukendte [13], [19].

Som følge, flere gen paneler, laboratorieteknikker, og markør tærskelværdier er i øjeblikket i brug, som alle kan føre til forskelle i den rapporterede forekomst af CIMP [20]. Da der ikke er nogen universel standard eller konsensus om kvantificere fænotype, oprettelse dens sande prævalens er en udfordring og hæmmer sammenligning mellem undersøgelser. Således målene med denne undersøgelse var at systematisk teste flere kriterier for at definere CIMP i kolorektal cancer prøver, og undersøge forskellen i CIMP frekvens, når ændre score niveauer.

Metoder

Menneskelig Materiale og Study Etik

Kræft væv blev opnået fra tyktarmskræft patienter, der gennemgår kirurgi ved Institut for Gastrointestinal Surgery, Stavanger Universitetshospital, Norge. Patienterne blev rekrutteret til en potentiel sentinel node retssag, og alle indvilliget i at studere deltagelse forud for inklusion og væv hentning. Den vestlige Norge Regional Health Authority godkendt brugen af ​​menneskelige deltagere efter at have skrevet informeret samtykke, godkendelse # 197,04. Alle data blev håndteret i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen.

Væv blev opnået som tidligere beskrevet [21], og frisk-frosne biopsier opbevaret ved -80 grader Celsius. En prøve sæt af 64 trin II og III patienter, og 2 tyktarmskræft cellelinjer (Caco2 og HT29), blev vilkårligt udvalgt til evaluering i den aktuelle undersøgelse.

DNA Isolation

Frisk frossen kræft vævsprøver, fra et lige antal patienter blev medtaget. Desuden blev en referenceprøve af normal colon epitel opnået sikre en betydelig afstand uden resektionsranden af ​​tyktarmen tumor. DNA-prøverne blev ekstraheret ved anvendelse af DNeasy Mini kit eller AllPrep DNA . RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland)

methyleringsspecifik Multiplex Ligation-afhængig Probe Amplification (MS-MLPA) for CIMP status

fra alle 64 DNA-prøver, 100 ng DNA blev denatureret i et samlet volumen på 5 pi Tris-EDTA-buffer, og yderligere udføres som anbefalet af leverandøren (MRC-Holland, Amsterdam, Holland).

methyleringsspecifik multiplex ligering-afhængig probe amplifikation (MS-MLPA) er en metode til samtidig påvisning af methylering ved flere positioner i én reaktion [22], [23]. Kort sagt, en blanding af probe-mix (ME042-B1 CIMP for nærmere oplysninger om de specifikke prober se tabel S1) og puffer blev tilsat til det denaturerede DNA og prober fik lov til at hybridisere til DNA’et ved 60 C i 16 timer . Hver prøve blev delt i to rør, hvor den ene halvdel blev ligeret, og den anden blev ligeret og fordøjet ved hjælp af methylering-sensitive restriktionsenzym

Hhal

. Begge prøver blev efterfølgende udsat for en PCR-reaktion under anvendelse af et termisk cykliseringsapparat (GeneAmp 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og fragmentet analysen foretages på en kapillær sequencer (ABI 3130

xl Salg, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). DNA fra normale colon-mucosa blev anvendt som normal reference. Outputtet fra analysen, efter inter- og intra-prøve normalisering, er en procentdel af methylering i prøven.

Data Analyse af MLPA data

De rå data fra fragment analyse blev analyseret ved hjælp af Coffalyser.NET ™ Software, beta-version, (MRC-Holland, Amsterdam, Holland). Kort sagt, methylering af hver position i hvert prøve i forhold til referencen blev beregnet ved hjælp af Coffalyser.net ™ software, med standardindstillinger.

Alle kvalitetsmål /parametre var inden tilfredsstillende område. Alle prøver blev normaliseret mod flere kørsler af referenceprøven (inter prøve normalisering), og desuden blev alle sonder justeret til at henvise til sonder inden for hver prøve (intra normalisering prøve).

For methylering scoring alle sonder inden alle prøver, forholdet mellem tophøjde af fordøjet versus ufordøjet prøve blev beregnet individuelt i Coffalyser, og procentdelen af ​​methylering anvendes til yderligere analyse.

Definitioner og cut-offs.

for at undersøge forskelle i CIMP frekvens, der afhænger af graden af ​​methylering, forskellige scoring parametre blev testet.

To paneler af gener blev undersøgt. Den Ogino scorer Panelet omfatter 8 gener (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

CDKN2A

,

MLH1

CRABP1

), mens Weisenberger panelet omfatter fem af de ovennævnte gener (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

). For Weisenberger panelet (kaldet Weisenberger herefter) en positiv score for tre eller flere af de fem gener betragtes CIMP positiv, mens to forskellige definitioner for Ogino panelet blev testet; CIMP positivitet hvis 5 af 8 gener var positive (kaldet Ogino 5/8), og CIMP positivitet hvis 6 af 8 gener var positive (Ogino 6/8).

Desuden forskellige cut-offs til at lave positive methylering for hver probe, samt forskellige definitioner af den samlede status for methylering for et specifikt gen blev undersøgt: Alle positioner /prober blev scoret med to forskellige niveauer af methylering (≥20% eller ≥30%) til at definere en specifik position /probe som methylerede. Tre forskellige cut-offs blev testet for at definere methylering for hvert gen; enten mindst 33% (1/3) af prober var methyleret; mindst 66% (2/3) var methyleret, eller; har mindst én eller flere methylerede prober inden for genet.

I hvert gen blev adskillige bindingssteder for methylering studeret, der spænder fra 3 til 6 steder pr gen. Antallet af methylering sites for de undersøgte gener var som følger: 3 sonder hver for

RUNX3

,

CACNA1G

IGF2

; 4 sonder hver til

MLH1

,

CRABP1

,

SOCS1

CDKN1A

, og; 6 prober til

NEUROG1

.

For CIMP beslutning blev de tre paneler anvendes i kombination med alle de probe- og gen-wise cut-offs, figur 1. Dette resulterede i alt 18 alternative scoring definitioner for CIMP. Forskelle i positive prøver blev observeret, og den statistiske signifikans evalueret.

‘de strengeste kriterier “for scoring af CIMP blev defineret som methylering af mindst 30% på sonde niveau, mindst 66% positive prober inden for et gen, og 6 ud af 8 positive gener i Ogino panelet. De “mindst strenge kriterier« blev defineret som 20% methylering på sonde niveau, et eller flere positive sonder inden for et gen, og 3 af 5 gener scoret som positiv i Weisenberger panelet.

Statistisk analyse.

Alle statistiske analyser blev udført ved SPSS V21 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).

antallet af positive prøver fremkommer ved hver af de forskellige scoring kriterier blev sammenlignet under anvendelse McNemars test på en 2 × 2 tabel. Alle tests var to-sidet, og statistisk signifikans indiceret til p-værdier. 0,05

Resultater

Probe-wise Cut-off

For hver probe, den relative methylering af prøven, sammenlignet med en normal reference, blev givet som en procentdel. Cut-off for at udføre en probe som methyleret blev testet under anvendelse af både 20% og 30% methylering af prøven vs reference, figur 2. Begge cut-offs blev testet for alle prober i assayet. Samlet set anvendelse af 30% afskæringsværdi, antallet af positive prøver for de 31 testede forskellige prober, varierede fra 0 (0%) til 63 (95%), hvorimod anvendelse af 20% afskæringsværdi, variationen var fra 0 (0%) til 64 (97%). Den gennemsnitlige variation i scoring af positive prøver mellem 20% og 30% cut-offs var 3 (5%), varierende fra et minimum på 0 til maksimalt 8 prøver (0-12%). Fire af 31 prober (13%), i to forskellige gener, viste ingen forskel i antallet af positive prøver ved hjælp af to cut-offs (03-037.010.228 i

MLH1

, 16-011.256.544, 16-011.256.960 og 16-011257200 i

SOCS1

). Den største variation blev observeret for probe 09-021965200 i

CDKN2A

, hvori 8 patienter (12%) blev bedømt forskelligt ved hjælp af de to forskellige cut-offs. Tre prober (16-011.256.544, 16-011256960 og 16-011257200 i

SOCS1

) havde ikke nogen positive prøver ved hjælp af enten af ​​kriterierne, som den procentvise methylering varierede fra 0 til 5%.

aksen til venstre viser antallet af positive prøver, og aksen til højre viser den procentdel af positive prøver.

Gen-wise Cut-offs

antallet af undersøgte for hvert gen varierede fra 3 til 6. Tre forskellige intra-gen indstillinger sonder blev testet; en eller flere positive prober, mere end 33% positive prober eller mere end 66% positive prober. Alle tre indstillinger blev testet både i en probe-wise afskæring på 20% og 30%.

Dette resulterede i seks scoringer pr gen, for hvilket en middelværdi på 44,8% af prøverne blev bedømt som positiv i de 8 gener. Den gennemsnitlige andel af positive prøver på tværs af generne for hver score kriterier, varierede fra 34,3% til 57,0%, ved hjælp af den mest vidtgående (30% sonde cut-off, 66% positive sonder pr gen), og mindst strenge kriterier (20% sonde cut-off, ≥1 positiv sonde per gen) henholdsvis tabel 1.

SOCS1 havde det laveste antal af positive prøver, med en gennemsnitlig score på positive prøver af 5,8%, der spænder fra 0 til 18,2%, mens den gennemsnitlige score på positive prøver for IGF2 var 96,0% for de 6 alternative kriterier, der spænder fra 92,4 til 97,0%, tabel 1 /Figur 3.

CDKN2A

viste største variation i positive prøver under anvendelse af de 6 alternative kriterier. Antallet af positive prøver varierede fra 39 prøver, fra 5 til 44 ved hjælp af de strengeste og mindst stringente kriterier hhv. Tværtimod

RUNX3

IGF2

viste den mindste variation; i begge tilfælde kun 3 patienter blev scoret forskelligt i de 6 forskellige kriterier. For

RUNX3

24 patienter blev scoret som positive ved hjælp af de mest stringente kriterier, i forhold til 27 patienter med de mindst strenge kriterier. For

IGF2

antallet af positive prøver var 61 og 64, ved hjælp af de mest og de mindst strenge kriterier, henholdsvis.

CIMP Frekvenser

Resultatet, med hensyn til antallet af positive prøver ved hjælp hver af de tre paneler, herunder de forskellige kombinationer af sonde-kloge og gen-wise scoringer, er præsenteret i tabel 2 /Figur 4.