PLoS ONE: Kræft stamceller i småcellet lungekræft cellelinje H446: Højere afhængighed af oxidative fosforylering og mitokondrie Substrat-Level Phosphorylering end ikke-Stem Cancer Cells

Abstrakte

For nylig rettet mod cancer stamceller (CSCS) stofskifte bliver en lovende terapeutisk tilgang til at forbedre kræft behandlingsresultater. Imidlertid er viden om den metaboliske tilstand af CSCS i småcellet lungecancer stadig mangler. I denne undersøgelse fandt vi, at CSCS havde betydeligt lavere ilt forbrug sats og ekstracellulær forsuring end ikke-stamceller kræftceller. Imidlertid bliver denne underpopulation af celler forbruges mindre glucose, producerede mindre lactat og opretholdes lavere ATP-niveauer. Vi viste også, at CSCS kunne producere mere ATP gennem mitokondrie substrat-niveau phosphorylering under respiratorisk inhibering sammenlignet med ikke-stamceller cancerceller. Endvidere var de mere følsomme over for undertrykkelse af oxidativ phosphorylering. Derfor oligomycin (hæmmer af oxidativ phosphorylering) kunne alvorligt forringe sfære-dannende og tumorfremkaldende evner CSCS. Vores arbejde tyder på, at CSCS repræsenterer metabolisk inaktive tumor subpopulationer, som opretholder i en tilstand, der viser lav metabolisk aktivitet. mitokondrie substrat-niveau phosphorylering af CSCS kan imidlertid være mere aktiv end den for ikke-stamceller cancerceller. Desuden viste CSCS fortrinsret brug af oxidativ fosforylering i glycolysen at opfylde deres energibehov. Disse resultater udvide vores forståelse af CSCS stofskifte, potentielt giver nye behandlingsstrategier målrettet metaboliske veje i småcellet lungekræft

Henvisning:. Gao C, Shen Y, Jin F, Miao Y, Qiu X (2016) Cancer Stem Celler i småcellet lungekræft cellelinje H446: Højere afhængighed af oxidative fosforylering og mitokondrie Substrat-Level Phosphorylering end ikke-Stem kræftceller. PLoS ONE 11 (5): e0154576. doi: 10,1371 /journal.pone.0154576

Redaktør: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, MEXICO

Modtaget: Marts 25, 2015; Accepteret: April 15, 2016; Udgivet: Maj 11, 2016

Copyright: © 2016 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Funding:.. Denne undersøgelse blev støttet af Research Program i Applied Basic og avancerede teknologier i Tianjin under kontrakt nr 14JCZDJC35500

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) er en form for højt aggressiv tumor, som udgør omkring 15% af alle tilfælde af lungekræft [1,2]. Selv patienter med SCLC have et oprindeligt god klinisk respons på kemo- strålebehandling, vil de fleste patienter, der behandles med disse fremgangsmåder tilbagefald efter en kort periode [3]. Dette kan delvis tilskrives manglende udrydde cancer stamceller (CSCS), som har evnen til at forny sig selv, til at differentiere til flere slægter og iværksætte tumorer hos immunkompromitterede mus [4,5]. CSCS menes at være mere modstandsdygtige over for radio- og kemoterapi end de ikke-stamceller cancerceller [5]. Det er derfor afgørende at udvikle lovende terapeutiske strategier rettet mod CSCS ved at overvinde deres resistens.

For nylig, fremgår det i stigende grad klart, at “metaboliske omprogrammering” af kræftceller har været en spirende kendetegnende for kræft fænotype [6 , 7]. Modsætning til normale celler, cancerceller vedtage en alternativ metabolisk vej og udvise forøget glucosemetabolisme og produktion af lactat selv i nærvær af oxygen [8-10]. Denne fortrinsret brug af aerob glykolyse [11], er kendt som Warburg effekten. Selvom aerob glykolyse menes at være en næsten universelt fænomen i kræftceller, metaboliske funktioner i CSCS og deres relevans i kræftmedicin forblive stadig kontrovers [12]. Ciavardelli et al [13] har rapporteret, at brystkræft stamceller er mere glykolytisk end deres ikke-stamceller modstykker. Undersøgelsen fra Liao [14], og hans kolleger har også vist, at ovariecancer stamceller-lignende celler overvejende metabolisere glucose ved anaerob glykolyse og pentose cyklus. I mellemtiden, Yuan et al [5] har vist, at glioblastom stamceller (GSCS) udviser fortrinsret brug af glykolyse i mitokondrie respiration. Men Vlashi et al [15] har vist, at GSCS stole mere på oxidativ fosforylering (OXPHOS) end glykolyse. Lagadinou et al [16] har også vist, at CSCS viste en større afhængighed af OXPHOS for energiforsyningen i leukæmiceller. Pasto et al [9] har vist, at cancer stamceller fra epitelial ovariecancerpatienter udstillet en metabolisk profil domineres af OXPHOS. Selv om der findes begrænsede publicerede data vedrørende metaboliske egenskaber CSCS [17], ingen i SCLC. Derfor, for at designe nye terapeutiske metoder, der er målrettet metaboliske veje af CSCS i SCLC, er indgående kendskab til den metaboliske tilstand af denne celle subpopulation haster [7].

At udforske de metaboliske egenskaber CSCS, den første mission er berigelse for CSCS i SCLC celler. Isolering af CSCS både in vivo og in vitro er afhængig af specifikke overfladearealer biomarkører, som letter sortering af cancerceller i fænotypisk distinkte subpopulationer [18]. Urokinase-plasminogenaktivator receptor (uPAR) er en glycosylphosphatidylinositol (GPI) -forankret protein [19] og er normalt opreguleret i flere typer af kræft [20]. Vigtigere er det, har vores arbejde og andres identificeret uPAR som mægler for kræft stamceller funktion [21,22]. For eksempel uPAR

+ -celler i SCLC-cellelinier udviste multilægemiddelresistens og forøget klonogenisk aktivitet in vitro sammenlignet med uPAR

– celler [23]. Tidligere arbejde fra vores laboratorium har også vist, at stamme-lignende cellesubpopulationer kan beriges i uPAR

+ celler [24]. Vi har derfor anvendt uPAR sortering for at berige for CSCS i SCLC cellelinie H446.

I denne undersøgelse vi først sammenlignet den metaboliske tilstand af CSCS med den for ikke-stamceller cancerceller og fandt, at CSCS var metabolisk inaktive tumor subpopulationer som var bosat i en tilstand, der viser lav metabolisk aktivitet. Derefter studerede vi de store energiproducerende veje for CSCS i SCLC. I modsætning til ikke-stamceller kræftceller, viste CSCS fortrinsret brug af OXPHOS løbet glykolysen at opfylde deres energibehov. Derudover har vi også konstateret, at CSCS kunne producere ATP gennem mitokondrie substrat-niveau phosphorylering.

Materialer og metoder

Cell kultur

SCLC cellelinie NCI-H446 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse celler blev dyrket i RPMI-1640 (Biological Industries) suppleret med 10% FBS (Thermo Scientific HyClone), 100 U /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin i befugtet luft ved 37 ° C med 5% CO

2.

Flowcytometrianalyse

cellesortering blev udført på enkelt cellesuspension fra H446 celler farvet med primært antistof mod uPAR (Mouse monoklonalt antistof, 1: 100, American Diagnostica, nr 3936). Derefter blev cellerne vasket og inkuberet med FITC-konjugeret sekundært antistof (Dako) i 30 min. Alle prøver blev målt under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences) og analyseret med CellQuest software (BD Biosciences). uPAR

+ celler og uPAR

– celler sorteret efter FACS blev brugt i alle vores eksperimenter (S1 Fig)

Oxygen forbrug og ekstracellulær forsuring rate

Det ekstracellulære Flux Analyzer. giver mulighed for at analysere iltforbrug sats (OCR) og ekstracellulær forsuring rate (ECAR) af et defineret antal celler i realtid og til overvågning af deres reaktion på lægemiddelbehandling [15]. Celler blev udpladet ved en densitet på 1 x 10

5 celler hver brønd i 24-brønds plader. Den følgende dag blev cellerne vasket og frisk medium blev tilsat. Patronen blev indlæst at dispensere tre metaboliske inhibitorer sekventielt som specifikke tidspunkter: oligomycin (inhibitor af ATP-syntase, 1 pM), efterfulgt af FCCP (a protonophore og afkobler af mitokondriel OXPHOS, 0.3μM), efterfulgt af tilsætning af en kombination af rotenon (mitokondrie kompleks I-inhibitor, 1 pM) og antimycin (mitokondriel kompleks III-inhibitor, 1 pM). Basal OCR og ECAR blev målt, samt ændringer i ECAR forårsaget af metaboliske inhibitorer er beskrevet ovenfor. Adskillige parametre blev fratrukket ændringer i OCR, såsom basal OCR, maksimal mitokondrie kapacitet, og mitokondrie reservekapacitet (= [maksimal mitokondrie kapacitet] – [basal OCR]). Som beskrevet tidligere [15,25]

glucoseoptagelse og lactatproduktion målinger og beregning af bioenergetic organisation

til måling af glucoseoptagelse, sorterede celler blev udpladet ved en densitet på 1 x 10

6 /ml /brønd i 6-brønds plader og inkuberet i glucose-free RPMI 1640 i 2 timer ved 37 ° C. Efter tilsætningen af ​​2- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoxy-D-glucose (2-NBDG) til en slutkoncentration på 100 uM, cellerne blev inkuberet i yderligere 1 time, vaskes to gange med PBS, og analyseret ved flowcytometri [26]. L-lactat-produktion blev detekteret ved anvendelse af en L-lactat assaykit (Eton Bioscience, San Diego, USA) som tidligere beskrevet [27] og ifølge producentens instruktioner og L-lactat-niveauer blev normaliseret til celleantal. De bioenergetic organisationer cellerne blev beregnet som beskrevet i rapporten fra Hao et al, brugte vi følgende: Lac (c) = koncentration laktat i kontrolgruppen mediet efter 6h inkubation; Lac (o) = lactat koncentration i mediet efter 6 timer af inkubation med 2 ug /ml oligomycin; Glycolysis% = Lac (c) × 100 /Lac (o); og OXPHOS% = 100 -. Glycolysis% [28]

ATP assays

Cellular ATP-koncentration blev målt ved anvendelse af ATP-baserede CellTiter-Glo Luminescent Cell Levedygtighed kit (Promega, Madison, WI) modificeret fra fabrikantens protokol. Kort fortalt blev cellerne udpladet i 96-brønds plader med forskellige densiteter. Tre timer senere blev et tilsvarende volumen af ​​en enkelt-trins reagens tilvejebragt af kittet tilsat til hver brønd og rystet i 10 min ved stuetemperatur. Cellulære ATP-indholdet blev målt ved anvendelse af en luminescerende pladelæser. For at teste ATP nedbrydende virkning af de metaboliske inhibitorer, blev forskellige koncentrationer af forbindelse sat til cellerne podet ved 1 x 10

4 celler /brønd for yderligere 3 timer, og cellulær ATP-indholdet blev målt som beskrevet ovenfor.

MTT assay

celler blev podet i 96-brønds plade ved 3000 celler per brønd i 100 pi celledyrkningsmedium og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer og derefter behandlet med angivne forbindelser ved forskellige koncentrationer. Efter 72h inkubation blev cellerne inkuberet med 10 pi MTT (i en endelig koncentration på 0,5 mg /ml) ved 37 ° C i 4 timer [29]. Mediet blev fjernet, og det udfældede formazan blev opløst i 100 pi DMSO. Efter omrystning i 10 min, blev absorbansen ved 490 nm påvises ved anvendelse TECAN Genios Pro (Biotek Instruments).

Tumor sfære-dannende assay

For at få kugler i kultur, uPAR

+ celler behandlet med angivne forbindelser i 3 timer. Derefter 1 x 10

3-celler blev podet i serumfrit medium (SFM) (DMEM /F12) suppleret med 20 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og epidermal vækstfaktor (EGF) (PeproTech), 5 ug /ml insulin (Sigma-Aldrich), 0,4% bovint serumalbumin (BSA, Invitrogen), og 0,02 × B27 (Invitrogen). Dyrkningsmedium blev erstattes eller suppleres med yderligere vækstfaktorer to gange om ugen. Det samlede antal tumor sfærer blev talt efter 14 dages kultur.

Tumorigenicitet assay i nøgne mus

Dyreforsøg blev udført på fire uger gamle BALB /CA nøgne mus købt fra Beijing HFK Bio- Teknologi. Co, LTD (Beijing, Kina). Protokollerne blev udført efter godkendelse fra udvalget om den etiske af dyreforsøg i Tianjin Medical University (Permit nummer: TMHaMEC2014030). Den sorteret uPAR

+ -celler blev behandlet med 2 pg /ml oligomycin i 24 timer, vasket og høstet til subkutan podning i venstresiden flankerne af BALB /CA nøgne mus. De samme antal af kontrolceller blev podet på de rigtige flanker de samme mus subkutant. Hver podningsstedet blev injiceret med 5 x 10

5 celler. Musene blev derefter overvåget for tumordannelse uden yderligere lægemiddelbehandling in vivo. Mus blev observeret 2-3 gange ugentligt laboratoriepersonale og overvåges for tegn på lidelse (dvs. ændringer i udseende, respiration, aktivitet, etc.). Tumorer blev målt en gang om ugen. Alle dyr i begge grupper var stadig i god stand, indtil eksperimentets afslutning. Ingen af ​​dyrene krævede eutanasi før den eksperimentelle endpoint. Efter seks uger blev forsøgsdyrene bedøvet med natriumpentobarbital (45 mg /kg, intraperitoneal injektion) og aflivet ved cervikal dislokation. Tumor volumen = 0,5 × længde × bredde

2

Elektronmikroskopi

uPAR

+ celler og uPAR

-. Celler blev sorteret ved FACS som beskrevet ovenfor. Den ultrastrukturelle analyse af sorterede celler blev udført som beskrevet i rapporten fra Varum et al [30].

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved hjælp af SPSS til Windows-version 17,0 software (SPSS Inc., Chicago , IL, USA). Hvert forsøg blev udført i mindst tre uafhængige forsøg. Alle resultater er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. og statistiske sammenligninger af datasættene blev analyseret ved anvendelse af uparret t-test eller ANOVA-test. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Ekstracellulær flux analyse viste de metaboliske forskelle CSCS og ikke-stamceller kræftceller

For at få indsigt til den metaboliske profil. CSCS og at sammenligne det med de ikke-stamceller kræftceller, vi uropført ekstracellulære metaboliske flux analyse [16]. OCR og ECAR blev målt. Som vist i fig 1A, CSCS-beriget uPAR

+ -celler viste en lavere basal OCR, indikerer lavere mitokondriel respiration, i forhold til deres uPAR

– modstykker. Når basal ECAR af uPAR

+ celler og uPAR

– celler blev sammenlignet, det uPAR

+ celler var også mindre aktive med hensyn til fermentativ glykolyse. At studere de metaboliske egenskaber af to subpopulationer i detaljer, brugte vi en farmakologisk profilering strategi, ved at kombinere anvendelsen af ​​tre metaboliske hæmmere (oligomycin, FCCP, en kombination af rotenone og antimycin) [30]. Behandling af oligomycin resulterede i fald i OCR af to cellesubpopulationer. Alligevel uPAR

+ -celler udviste en mindre udtalt fald i OCR forhold til uPAR

– celler (Fig 1B). Afkobling af OXPHOS hjælp FCCP øgede OCR til maksimum i begge celle subpopulationer, med overholdes en mindre udtalt respons i uPAR

+ celler (Fig 1B og 1C). Forskellen mellem FCCP OCR og basal OCR er en god indikator for respiratorisk evne (også omtalt som det mitokondrielle reservekapacitet) af disse celler [30]. Selvom den basale OCR af uPAR

+ -celler var lavere, den mitokondrielle reservekapacitet af uPAR

+ -celler var sammenlignelig med uPAR

– celler (Fig 1C). Selv om den basale ECAR er lav i uPAR

+ celler, er det muligt, at uPAR

+ -celler kan opregulere glykolyse, når mitokondrie OXPHOS blokeres [16]. At undersøge muligheden målte vi ECAR af disse celler behandlet med OXPHOS inhibitorer, som er en parameter for compensative potentiale glykolyse [16]. Interessant uPAR

+ -celler viste en signifikant nedsat compensative potentiale glykolyse, når mitokondrie energiproduktion blev inhiberet (Fig 1D og 1E). Desuden viste vores resultater, at uPAR

+ celler var faldet ATP niveauer i forhold til uPAR

-celler (Fig 1F). Tilsammen vores data tyder på, at CSCS beriget uPAR

+ celler er metabolisk inaktive cellepopulationer i SCLC

(A) Basal OCR og ECAR for uPAR

+ og uPAR

-. Delmængder . (B) OCR efter behandling med angivne inhibitorer i uPAR

+ celler versus uPAR

– celler. (C) Maksimal mitokondrie respiratoriske kapacitet og mitokondrie reservekapacitet i to subpopulationer. (D) Den ECAR efter behandling med angivne inhibitorer i uPAR

+ celler versus uPAR

– celler. (E) Den compensative potentiale glykolyse af uPAR

+ celler og uPAR

– celler. (F) ATP-indhold i uPAR

+ celler og uPAR

– celler. Data er udtrykt som middelværdi ± middelfejl. af tre uafhængige forsøg. T-test blev anvendt til at beregne statistisk signifikans. * P 0,05

CSCS viste mindre glukoseoptagelse og laktat produktion i SCLC

For yderligere at undersøge de metaboliske forskelle uPAR

+ celler og uPAR

– celler. vi evaluerede glukose optagelse af to subpopulationer. uPAR

+ celler viste mindre glukoseoptagelse end uPAR

– celler (Fig 2A). Vores ECAR målinger har vist forskelle i laktat generation mellem uPAR

+ celler og uPAR

– celler (Fig 1A og 1D). I overensstemmelse med disse resultater, uPAR

+ celler udviste signifikant reducerede niveauer af laktat produktion i forhold til uPAR

– celler (Fig 2B). Dette viste igen, at CSCS var mindre glykolytisk end deres ikke-stamceller kræftceller. Glutaminolysis er normalt aktiv i tumorceller, derfor har vi målt den 2-deoxyglucose-følsomme laktat produktion i uPAR

+ celler og uPAR

– celler. Som vist i S2 Fig, 2-DG forårsagede en væsentlig nedsættelse af lactat produktion. Disse resultater antyder glutaminolysis ikke var så aktiv i småcellet lungecancer-cellelinie H446 som i andre tumorceller

(A) Glucoseoptagelse af uPAR

+ celler og uPAR

-. Celler ved anvendelse af 2- NBDG. Venstre, histogram repræsentation af 2-NBDG intensitet. Right, kvantificering af 2-NBDG optagelse som forskel i den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) mellem prøver og kontroller. (B) lactatproduktion satser uPAR

+ celler og uPAR

– celler. Data er udtrykt som middelværdi ± middelfejl. af tre uafhængige forsøg. T-test blev anvendt til at beregne statistisk signifikans. * P. 0,05

Mitokondrisk antal og morfologi CSCS var forskellig fra ikke-stamceller kræftceller

Nedsat mitokondrie respiration i uPAR

+ celler kunne tilskrives lavere antal mitokondrier eller umodenhed mitokondrier i disse celler sammenlignet med uPAR

– celler. For at undersøge dette problem, vi udførte transmission elektronmikroskopi [30] for uPAR

+ celler og uPAR

– celler. Som vist i figur 3, at størstedelen af ​​mitokondrier i uPAR

– celler blev rundet til ovale, viser sparse og uregelmæssig cristae og en elektron-Lucent matrix. Men uPAR

+ celler fortrinsvis besat aktiverede mitokondrier, herunder gruppering af mitokondrier, fortykket cristae, og “vognhjul” morfologi [17,31]. Denne morfologiske vurdering tyder på, at mitokondrier af uPAR

+ celler er mere modne i udseende end uPAR

– celler. Disse resultater står i skarp kontrast til den nedre respiratoriske aktivitet uPAR

+ celler i forhold til uPAR

-. Celler

Ultrastrukturel analyse af sorteret uPAR

+ celler og uPAR

– celler hjælp transmissionselektronmikroskopi. Repræsentative billeder vises ved forstørrelse på x 10.000 i øverste paneler og × 30.000 i lavere paneler. Pile i nederste panel angiver eksempler på mitokondrier. Scale barer: 5 um (øverste paneler) og 1 um (lavere paneler)

Afhængighed af OXPHOS og mitokondrier substrat-niveau phosphorylering varierede i CSCS og ikke-stamceller kræftceller i SCLC

at udforske den relative betydning af OXPHOS og glykolysen i CSCS, besluttede vi at behandle begge undergrupper med forskellige metaboliske hæmmere og genanalysere ATP niveauer efter behandling [15]. 2-DG var en kompetitiv glycolyse inhibitor og oligomycin blev anvendt til at inhibere ATP-produktion via det mitokondrielle ATP syntase. Som vist i fig 4A, ATP niveauer af uPAR

+ -celler i H446 faldt med 43,2% og 64,1% af kontrolværdien ved behandling med 2-DG og oligomycin hhv. I uPAR

– celler, 2-DG forårsagede en 81,9% ATP drop, mens ATP drop induceret af oligomycin var 54,7% (figur 4B). Når virkningen af ​​oligomycin og 2-DG på ATP-niveauer blev sammenlignet i to subpopulationer, oligomycin havde mere potent virkning på uPAR

+ -celler. Derimod 2-DG påvirkede uPAR

– celler mere intensivt end uPAR

+ celler (S3 Fig). Dataene viste, at uPAR

+ celler var mere følsomme over for OXPHOS hæmning i forhold til uPAR

– celler. For yderligere at udforske den vigtigste energi-genererende vej hos CSCS, vi beregnet de bioenergetic organisationer af glykolyse og OXPHOS [28] i uPAR

+ celler og uPAR

– celler. De bioenergetic organisationer er heterogene og forudsige forskellen bioenergetic afhængighed af glykolyse og OXPHOS for begge subpopulationer (S4 Fig). Disse resultater tyder på, at CSCS kan afhænge mere på OXPHOS stedet glykolyse at opfylde energikravene. Endvidere observerede vi de to cellesubpopulationer stadig kunne producere ATP selvom behandlet med kombinationen af ​​2-DG og oligomycin. Dette indebar, at disse celler kan påberåbe sig andre energi-genererende veje, såsom mitokondrie substrat-niveau phosphorylering under respirationsdepression.

(A, B) ATP indholdet af uPAR

+ celler og uPAR

– celler behandlet med 2-DG, oligomycin (OLI) eller en kombination af to-DG og OLI. (C) Effekten af ​​kombinationen af ​​to-DG og OLI for forskellige tid på intracellulære ATP-niveauer i uPAR

+ celler og uPAR

– celler. (D) Den uPAR

+ celler, ikke uPAR

– celler kunne producere mere ATP gennem mitokondrie substrat-niveau phosphorylering under hypoxiske betingelser end normoksiske betingelser (E) Tilsætning af substrater (SUB) kunne afhjælpe ATP udtømning forårsaget af 2-DG og OLI i uPAR

+ celler, men ikke i uPAR

– celler. Data er udtrykt som middelværdi ± middelfejl. af tre uafhængige forsøg. T-test blev anvendt til at beregne statistisk signifikans. * P 0,05. SUB, substrater (α-ketoglutarat og aspartat). ns, uden betydning.

Rapporter har antydet, at “tvinge” substrat-niveau phosphorylering overarbejde kan være en levedygtig strategi for at overleve i energikrisen induceret af OXPHOS nedskrivninger i gær [32,33] . For at optimere denne strategi til SCLC, vi inhiberede glykolyse og OXPHOS og således tvunget celler til at producere ATP gennem mitokondrie substrat-niveau phosphorylering. Til dette formål, vi først satte sig for at bestemme en lav dosis af oligomycin og 2-DG, der fuldstændig hæmmede OXPHOS og glykolyse aktivitet hhv. Ved behandling af uPAR

– celler med forskellige doser af 2-DG området fra 5 til 80 mM i 3 timer, ATP niveauer af disse celler blev målt. ATP blev ikke faldet yderligere ved at hæve 2-DG fra 20 til 40 og 80mm, hvilket indikerer, at 20 mM 2-DG helt undertrykte ATP produktion i uPAR

– celler (S5A Fig). På samme måde, foreslog vi, at 2 pg /ml oligomycin kunne hæmme OXPHOS fuldstændigt i uPAR

+ celler (S5B Fig). Vi observerede, at uPAR

+ celler produceret mere ATP indhold via substrat-niveau phosphorylering end gøre uPAR

– celler (Fig 4C). Desuden uPAR

+ -celler producerede mere ATP gennem substrat-niveau phosphorylering under hypoxiske betingelser end under normoxiske betingelser (Fig 4D). Desuden viste ATP analyser, at α-ketoglutarat /aspartat tilskud til dyrkningsmediet kunne afhjælpe ATP udtynding forårsaget af oligomycin og 2-DG i uPAR

+ celler. Imidlertid var dette fænomen ikke observeret i uPAR

– celler (Fig 4E). Disse observationer er angivet endvidere, at mitokondriel substrat-niveau phosphorylering i uPAR

+ -celler kan være mere aktiv end i uPAR

-. Celler

oligomycin forringet kugle-dannende evne CSCS

Vores observationer dokumentere, at CSCS beriget uPAR

+ celler stærkt kan afhænge OXPHOS som deres vigtigste energi-genererende vej. Vi derefter testet, om oligomycin kunne føre til effektiv aflivning af CSCS i SCLC, baseret på det rationale, oligomycin ville udtømme det cellulære ATP-indholdet væsentligt ved at hæmme OXPHOS. Da in vitro clonogenicity betragtes som en indikator for det tumor-tændevne af cancerceller in vivo [5], testede vi virkningen af ​​oligomycin og 2-DG på evnen af ​​CSCS i H446 til dannelse sfærer. 2-DG kunne ikke ophæver clonogenicity af CSCS, men oligomycin faldt antallet og størrelsen af ​​kugler i kultur (Fig 5A-5C). Tilsætning af 2-DG til dyrkningsmediet viste, at inhibering af anaerob glycolyse hårdt ramt væksten af ​​uPAR

– celler, men ikke uPAR

+ -celler. Derimod oligomycin signifikant nedsat proliferation af både celle- undertyper (Fig 5D).

(A) repræsentant morfologi af kugler opretholdelse i serum-frit medium blev etableret fra uPAR

+ -celler behandlet med oligomycin og 2- GD. (B) Beløb af de første generation sfærer genereret fra uPAR

+ celler behandlet med 2-DG og oligomycin. Klonogen potentiale uPAR

+ celler blev reduceret med oligomycin behandling. I modsætning hertil har 2-DG ikke væsentligt påvirker klonogene potentiale CSCS. (C) Antal celler pr sfære genereret fra uPAR

+ celler behandlet med 2-DG og oligomycin på dagen for 14. (D) oligomycin inhiberer proliferation af både uPAR

+ -celler og uPAR

– celler, men 2-DG påvirker kun uPAR

– celler, men ikke uPAR

+ celler. Data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. T-test blev anvendt til at beregne statistisk signifikans. * P. 0,05

oligomycin undertrykte tumor-initierende evne CSCS in vivo

For at teste effekten af ​​oligomycin at dræbe tumor-initierende celler i CSCS subpopulationer, uPAR

+ -celler blev behandlet ved den i fig 6A procedure. Derefter to grupper af celler blev inokuleret subkutant BALB /CA nøgne mus, som blev opdelt i to grupper. Musene blev derefter observeret for tumordannelse og tumorvækst uden yderligere behandling lægemiddel [12]. Seks uger senere, gruppen behandlet med oligomycin og kontrol gruppe dannet tumorer (Fig 6B og 6C). Gruppen behandlet med oligomycin havde en signifikant reduceret tumor volumen og vægt (125,8 ± 13,67 mm

3, 0,2 ± 0,1 g) i sammenligning med kontrolgruppen (451,5 ± 16,23 mm

3, 0,42 ± 0,15 g) (Fig 6D og 6E). Disse observationer tyder CSCS opretholde deres stamceller-lignende egenskaber ved OXPHOS i SCLC cellelinje H446.

(A) Eksperimentel ordning. (B) repræsentant fotografi af tumorer dannet af celler behandlet med oligomycin eller kontrolceller. (C) repræsentant fotografi af BALB /cA nøgne hanmus med tumor efter 42 dage. (D) Tumor vægt af xenograft tumorer volumen af ​​gruppen behandlet med oligomycin og kontrolgruppen. (E) Vækst kurve af xenotransplantattumorer volumen af ​​gruppen behandlet med oligomycin og kontrolgruppen. Data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. af seks mus. T-test blev anvendt til at beregne statistisk signifikans. * P. 0,05

For kliniske anvendelse, er det bedre at tage ikke-kræftceller i betragtning. I vores undersøgelse, at koncentrationen af ​​oligomycin er 2 ug /ml, hvilket er langt mindre end den dødelige dosis [34], og alle musene i forsøgsgruppen er stadig i god stand, indtil eksperimentets afslutning. Mener vi derfor, at den bivirkning af oligomycin er kun lidt i vores undersøgelse. Desuden har anden gruppe vist, at målrettede anti-mitokondrisk terapi ved anvendelse oligomycin er effektiv til at standse MCF-7 sfæroide vækst uden tilsyneladende virkning på normale epitel brystvæv ved lignende doser [35]. Men i betragtning af tid og vores oprindelige hensigt, er vi tilbøjelige til at illustrere de forskellige metaboliske fænotyper af hovedparten af ​​kræftceller og CSCS. Derfor betragter vi CSCS og ikke-stilk kræft som forskning objekter i dette papir.

Diskussion

Indtil nu har det store flertal af undersøgelser på dette område fokuseret på bulk tumorceller, som viser øget glycolyse selv i nærvær af oxygen i en række tumorer [17]. Men der er stigende tegn på, at den metaboliske tilstand af CSCS adskiller sig fra ikke-stamceller cancerceller [36-38]. Der vides kun lidt om de metaboliske egenskaber CSCS i SCLC hidtil. Her viste vi, at CSCS boede i en tilstand, der viser lav metabolisk aktivitet i SCLC. Vores resultater indebar, at CSCS beriget uPAR

+ celler var hvilende subpopulationer i SCLC. Den cellulære vækstdvale kunne bringe fordele for tumorceller. På den ene side er de fleste af nuværende terapier målrettet de prolifererende tumorceller. de hvilende CSCS kan således overleve målrettede behandlinger og være ansvarlig for tumor tilbagefald. På den anden side, denne relativt hvilende tilstand sandsynligvis gør CSCS fortsætter, selv under meget stressende forhold såsom lave næringsstof eller ilt niveauer [16]. Den nuværende forskning giver chancer for at forstå kompleksiteten i tumor vækstdvale, men mekanismen for denne proces kræver yderligere undersøgelse.

miRNA spiller vigtige regulatoriske roller i forskellige biologiske processer, såsom stofskiftet [27]. Tidligere arbejde fra vores laboratorium sammenlignede miRNA udtryk profiler af CSCS og ikke-stamceller kræftceller fra H446 hjælp miRNA vifte herunder 1212 modne miRNA. I arrayet, blev det konstateret, at 86 miRNA differentielt blev udtrykt mellem CSCS og ikke-stamceller cancerceller (P 0,01), herunder 48 opreguleret miRNA og 38 nedreguleret miRNA i CSCS. Blandt 86 differentielt udtrykte miRNA, 18 af de 48 opreguleres miRNA og 20 af de 38 nedreguleret miRNA viste mindst en 4-fold ændringer i CSCS forhold til ikke-stamceller cancerceller [29]. Derfor er vores næste arbejde er at undersøge effekten af ​​miRNA om metabolisk tilstand af CSCS i SCLC.

I denne undersøgelse viste vi, at CSCS viste fortrinsret brug af OXPHOS løbet glykolysen at opfylde deres energibehov. Så vidt vi ved, CSCS bor i hypoxiske miljøer [39]. Hvorfor er CSCS stadig meget afhængige af OXPHOS i hypoxisk mikromiljø? Vi mener årsagerne er som følger. For det første har oxygenkoncentrationen i en hypoxisk mikromiljø blevet foreslået at være inden for omfanget af 8-57μM [4,40-42], hvilket er højere end den begrænsende koncentration for O

2 dissociationskonstant for cytochrom c-oxidase [43 ]. Derfor CSCS kunne stadig stærkt afhængige OXPHOS selv under hypoxiske betingelser. For det andet er der en metabolisk symbiose mellem to subpopulationer af kræftceller med særskilte afhængigheder i energiproducerende veje [44,45]. Glycolytiske cancer s biprodukt lactat kan anvendes som en vigtig metabolit for OXPHOS af Cancer delmængder som er afhængige af mitokondriel metabolisme. Den metaboliske symbiose giver kræftceller til at gøre fuld brug af de tilgængelige ressourcer [45]. For det tredje har Otto Warburg ‘arbejde vist, at meget proliferative celler ofte fortrinsvis udføre glykolyse i OXPHOS [17].