PLoS ONE: Phosphorylering og Subcellulær Lokalisering af p27KIP1 Reguleret af Hydrogenperoxid Modulation i Cancer Cells

Abstrakt

cyklin-afhængige kinase inhibitor 1B (p27KIP1) er et centralt protein i beslutningen mellem proliferation og cellecyklus exit . Hvilende celler viser nukleare p27KIP1, men dette protein eksporteres til cytoplasmaet som reaktion på prolifererende signaler. Vi rapporterede for nylig, at katalase behandling øger niveauerne af p27KIP1

in vitro

in vivo

i en musemodel. For at karakterisere og udvide disse resultater, vi evaluerede reguleringen af p27KIP1 ved hydrogenperoxid (H

2) i humane melanomaceller og melanocytter. Vi observerede en høj procentdel af p27KIP1 positive kerner i melanomceller overudtrykkende eller behandlet med exogent katalase, mens ikke-behandlede kontroller udviste et cytoplasmatisk lokalisering af p27KIP1. Derefter undersøgte vi niveauerne af p27KIP1 phosphorylerede (p27p) ved serin 10 (S10) og ved threonin 198 (T198), fordi phosphorylering på disse steder muliggør nuklear eksport af dette protein, hvilket fører til akkumulering og stabilisering af p27pT198 i cytoplasmaet. Vi påvist ved western blot et fald i p27pS10 og p27pT198 niveauer som reaktion på H

2 fjernelse i melanomaceller, der er forbundet med nuklear p27KIP1. Melanocytter udstillet også nukleare p27KIP1 og lavere niveauer af p27pS10 og p27pT198 end melanom celler, som viste cytoplasmatisk p27KIP1. Vi viste ligeledes, at tilsætning af H

2 (0,1 uM) til melanomceller standset i G1 ved serumudsultning inducerer proliferation og øger niveauerne af p27pS10 og p27pT198 fører til cytoplasmatisk lokalisering af p27KIP1. Kernelokalisering og post-translationelle modifikationer af p27KIP1 blev også demonstreret ved katalase behandling af colorektal carcinom og neuroblastomceller, der strækker vores resultater til disse andre humane cancertyper. Afslutningsvis viste vi i den nuværende arbejde, H

2 latrintømning forhindrer nukleare eksport af p27KIP1, så cellecyklusstop, antyder, at kræftceller drage fordel af deres iboende pro-oxidant tilstand at favorisere cytoplasmatisk lokalisering af p27KIP1 .

Henvisning: Ibañez IL, Bracalente C, Notcovich C, Tropper I, Molinari BL, Policastro LL, et al. (2012) Phosphorylering og Subcellulær Lokalisering af p27KIP1 Reguleret af Hydrogenperoxid Modulation i kræftceller. PLoS ONE 7 (9): e44502. doi: 10,1371 /journal.pone.0044502

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: Januar 26, 2012; Accepteret: August 8, 2012; Udgivet: September 6, 2012 |

Copyright: © Ibañez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra det nationale agentur for Videnskabelig og Teknologisk Promotion (ANPCyT), Argentina (PICT 2007-01.628 og PICT 05-14.330) og non-profit organisation Fundación Florencio Fiorini. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cellecyklusprogression veje er slutpunktet for signalering kaskader impliceret i cellevækst og celledeling. Cellecyklussen stramt koordineret af sekventiel samling og aktivering af fase-specifikt protein kinase komplekser [1], [2], dannet af cycliner og cyclinafhængige kinaser (CDK’er), der også reguleres af de INK4 proteiner og CDK-inhibitorer ( CDKIs). D-type cycliner udtrykkes under hele cyklussen som respons på mitogen stimulering [2]. Cyclin D-CDK4 og cyclin E-CDK2-komplekser er nødvendige for overgangen fra G1 til S-fasen. Den CDKI 1B (CDKN1B), også kendt som p27KIP1, blev først identificeret som en kritisk negativ regulator af CDK2 og G1 /S cellecyklusprogression [2], [3]. Niveauerne af denne CDKI er høj i hvilende celler, falder som reaktion på mitogen stimulering, forblive på tærskelværdier i prolifererende celler, og stige igen, når mitogener trækkes tilbage [2].

I de senere år, blev det konstateret, at p27KIP1 er involveret i reguleringen af andre processer såsom celle migration [4] sammen med celledeling, differentiering og apoptose [5]. Interessant nok kan dette protein udøve både positive og negative funktioner på disse processer [5]. Aktiviteterne i p27KIP1 kontrolleres af dets koncentration, subcellulær lokalisering og phosphorylering status [5]. For eksempel phosphorylering af p27KIP1 i serin 10 (S10) medierer p27KIP1 udførsel til cytoplasmaet [6] – [9], phosphorylering på threonin 198 (T198) stabiliserer proteinet i cytoplasmaet og øger p27KIP1-afhængig cellemotilitet [4 ] og phosphorylering på threonin 187 (T187) peger p27KIP1 som et mål for proteolyse af polyubiquitination [9] – [11]. Phosphoryleringen af andre steder i proteinet svækker kerneimport af p27KIP1 og forbedrer samlingen af cyclin D1-CDK4-komplekset [9], [12] – [15] eller initierer overgangen af p27KIP1 fra inhibitor af cyclin E-CDK2 til substrat for proteolyse [16], [17]. Ændringer i p27KIP1 phosphorylering kan føre til tab af stabilitet, aberrerende funktion eller mislocalization af proteinet, som på sin side kan bidrage til onkogenese [5], [9]. I den forstand har både tab af nukleare p27KIP1 og dens cytoplasmatiske lokalisering blevet foreslået som prognostisk markør for melanom progression og værre kliniske udfald [18].

ekstracellulære miljø kan Indled Cell Cycle Division eller Arrest ved aktivering eller deaktivering Cyclin -CDK komplekser gennem forskellige veje

Reaktive ilt arter (ROS) er i stand til at udøve forskellige virkninger på cellerne efter deres karakter, lokalisering og niveauer [19]. Især mange typer af pattedyrceller kan øge deres vækst, når de udsættes for moderate niveauer af hydrogenperoxid (H

2) og kan inducere apoptose [20], terminal differentiering [21] eller cytotoksicitet [20], hvis de udsættes for høje niveauer af H

2. Scavenging af H

2 i tumorceller enten behandlet med eksogent katalase eller ekspression transficeres katalase inhiberer celleproliferation [22] – [25]. Det er veldokumenteret, at H

2 er involveret i signaltransduktionsveje [26], [27], f.eks forøgede niveauer af H

2 inducerer mitogene signaler, såsom dem, der vedrører Ras /ekstracellulær signal-regulerede kinaser 1 og 2 (ERK1 /2) pathway, og stress-responsive signaler, såsom dem relateret til c -Jun N-terminale kinaser (JNK’erne) og p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) veje [26] – [28]. Desuden ROS, særlig H

2, blev også underforstået i modulering af receptortyrosinkinaser (RTK) [29] og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT [30] pathways.

det er blevet rapporteret, at udsving observeret i den intracellulære redox tilstand under cellecyklusprogression kunne forbinde oxidative metaboliske processer til celle cyklus regulering [31], [32]. H

2 udsving langs cellecyklus var forbundet med reguleringen af cyklin D1 udtryk [33]. I modsætning hertil fjernelse af endogent H

2 ved overekspression af katalase og glutathionperoxidase inducerer G0 /G1 arrest [25] og reducerer celle-DNA-syntese [34]. En nylig undersøgelse af vores laboratorium viste øget niveauer af p27KIP1 som reaktion på katalase behandling i en musemodel af pladecellekræft

in vitro

in vivo

[35]. Men der er involveret i denne celle cyklus protein regulering af H mekanismer

2O er ikke fuldt forstået

2. I betragtning af at p27KIP1 blev foreslået som et prognostisk biomarkør for humant melanom [18], og at disse tumorer udviste en pro-oxidant adfærd på grund af en ubalance i antioxidant-systemet [36], [37] og til melanin deregulering [38], human melanom celler bliver en interessant model for at udvide vores tidligere resultater på H

2 regulering af p27KIP1.

Formålet med denne undersøgelse var at vurdere virkningerne af modulation af H

2 etager i G1 /S overgang og, især, om regulering af den CDKI protein, p27KIP1, i human melanom og melanocyt cellelinjer. Vi demonstrerede den intracellulære relocalization af p27KIP1 efter katalase eller H

2 behandlinger. Dette var forbundet med variationer på niveauerne af phosphoryleret p27KIP1 på S10 (p27pS10) og T198 (p27pT198), som spiller en vigtig rolle i reguleringen af den subcellulære lokalisering af dette protein. Resultater på p27KIP1 graduering blev udvidet til andre humane cancer celletyper, kolorektal karcinom og neuroblastomceller. Vores resultater kan give et fingerpeg at forstå effekten af H

2 på graduering af en vigtig regulerende protein af G1 /S overgang med den deraf følgende effekt på cellecyklus og celledeling.

Resultater

katalasebehandling inhiberer melanom celleproliferation med G1 Arrest

det er blevet foreslået, at celler med et permanent oxidativ skift i redox status kan undergå løbende spredning, der kunne til gengæld være en afgørende begivenhed i udseendet af den maligne fænotype [23], [39]. I den forstand, produktion af store mængder af ROS og især, H

2, blev rapporteret i tumorcellelinjer [23], [40]. Katalase er en antioxidant enzym, der nedbryder H

2 i vand og ilt. Under hensyntagen til at H

2 kan diffundere over membraner, kunne tilsætning af katalase til dyrkningsmediet frembringe et fald i det intracellulære niveau af H

2 nå en tilsvarende nedre steady state koncentration i og uden for cellen [26], [33], [35]. Vi valideret vores model for melanomceller behandlet med katalase sat til dyrkningsmediet ved måling af faldet i niveauerne af ROS gennem 2 ‘, 7’-dichlorodihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA) assay (figur 1A og 1B). Dette fald i ROS-niveauer induceret af katalase resulterede i en signifikant inhibering (p 0,01) af celleproliferation (figur 2A). Endvidere A375 celler, der overudtrykker katalase (A375-CAT-E9) vises lave celleproliferation i sammenligning med kontrolceller (figur 2B). Denne klon, A375-CAT-E9, viste de laveste intracellulære ROS niveauer af stabil Geneticin-resistente kloner dannet (fig S1A) og et signifikant fald i disse niveauer sammenlignet med celler transficeret med et tomt plasmid (A375-pcDNA3) eller ikke transficerede (A375 kontrol) (fig 1C og 1D). Disse resultater er enig med de højere niveauer af katalase ekspression og aktivitet observeret i A375-CAT-E9 i forhold til kontrol-celler (Figur S1B og S1c).

(A-D) Intracellulær ROS niveauet faldt i melanom celler enten når de behandles med katalase eller når overekspression den. (A) Repræsentative histogrammer af DCF fluorescens af melanomceller behandlet med 500 (blå linie) og 1000 (orange linje) U /ml catalase eller venstre ubehandlet (grøn linje) i 24 timer. Kontrol celler ikke er udsat for DCFH-DA (sort linje) og kontrol celler behandlet med katalase lige før DCFH-DA inkubation (rød linje). (B) DCF betyde fluorescens (arbitrære enheder) vs. katalase (CAT) dosis. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ** P 0,01 vs. ubehandlede celler (0 U /ml katalase). (C) Repræsentative histogrammer for DCF fluorescens af melanom celler overekspression katalase (A375-CAT-E9) og dets kontroller (A375-pcDNA3 og ubehandlede A375 celler). Kontrol celler ikke er udsat for DCFH-DA (sort linje), kontrol celler behandlet med katalase lige før DCFH-DA inkubation (rød linje) og celler inkuberet med DCFH-DA (grøn linje). (D) DCF middelfluorescens (arbitrære enheder) af A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 og A375 kontrolceller. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ** P 0,01 vs. A375 kontrol. (E-F) melanomceller (A375) udviste højere niveauer af intracellulære ROS end deres ikke-tumor modstykke (Pig-1 melanocytter). (E) Repræsentative histogrammer for DCF fluorescens af Pig-1 og A375-celler: kontrol celler ikke er udsat for DCFH-DA (sorte linjer), kontrol celler behandlet med katalase lige før DCFH-DA inkubation (rød linje) og celler inkuberet med DCFH- DA (grøn linje). (F) DCF betyde fluorescens (arbitrære enheder) af PIG-1 melanocytter og A375 melanom celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ** P 0,01 over PIG-1

(A) Cell proliferationshastighed af melanomceller behandlet med katalase i 24 timer i forhold til kontrol celler, vurderet ved MTT-assayet.. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ** P 0,01 versus kontrol. (B) Proliferation sats i A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 og A375 kontrol celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. * P 0,05 over A375 kontrol. (C) Proliferation rate af ikke-tumor (PIG-1) og tumor (A375) celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ** P 0,01 vs. A375. (D-I) Cellecyklusanalyse vurderet ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid. (D) Repræsentative histogrammer af DNA-indholdet i A375 melanomceller blev behandlet med 1000 U /ml catalase (CAT) i 24 timer og A375 kontrolceller. (E) Procentdel af melanomceller i de forskellige faser af cellecyklus som respons på CAT behandling. FBS udsultede celler blev anvendt som kontrol af G1 arrest. (□) Ubehandlede kontrolceller, () 500 U /ml og (■) 1.000 U /ml CAT og () FBS udsultede celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. * P 0,05 og ** p 0,01 vs. ubehandlet kontrol. (F) Repræsentative histogrammer af DNA-indholdet i A375-CAT-E9, A375-pcDNA3 og A375 kontrolceller. (G) Procentdel af A375-CAT-E9 (■), A375-pcDNA3 () og A375 kontrolceller (□) i de forskellige faser af cellecyklussen. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ** P 0,01 vs. A375 kontrol. (H) Repræsentative histogrammer af DNA-indholdet af PIG-1 melanocytter og A375 melanom celler. (I) Procentdel af (■) ikke-tumor (PIG-1) og (□) tumor (A375) celler i de forskellige faser af cellecyklussen. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. ** P. 0,01 vs. PIG-1 celler

For at vurdere ikke-tumor og tumorceller i samarbejde med deres intracellulære ROS-niveauer, vi analyserede melanocytter vs. melanom celler. Figur 2C viser spredning på PIG-1 melanocytter i forhold til A375 melanom celler. Vi bekræftede, at tumorceller udviste højere intracellulære niveauer af ROS end deres ikke-tumor modstykke i denne melanom /melanocyt model (figur 1E og 1F). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i niveauet af ROS og i spredning sats (figur S2) mellem ikke behandlet og varme-inaktiveret katalase behandlede celler i melanom model. Således blev varmeinaktiveret katalase anvendt som kontrol.

En væsentlig G1 cellecyklusstandsnings blev fundet associeret med inhibering af celleproliferation i melanomceller behandlet med katalase i 24 timer (figur 2D og 2E). Analoge resultater blev observeret for A375-CAT-E9 vs. A375-pcDNA3 eller A375 kontrolceller (figur 2F og 2G). Melanocytter viste højere procentdel af celler i G1-fasen og en mindre procentdel i S-fasen end melanomceller (fig 2H og 2i).

Hvad angår niveauet for cycliner og CDK’er involveret i G1 /S overgang, cyclin D1, cyklin E, CDK4 og CDK2, evalueret ved western blot blev et signifikant fald i cyclin D1 niveauer observeret efter H

2 fjernelse af katalase behandling eller katalase overekspression (figur S3) efter aftale med tidligere resultater [35 ], [41].

Desuden signalet for cyclin D1 detekteret ved immunfluorescens var ekstremt lav i kernen af celler behandlet med katalase og et væsentligt fald i procentdelen af positive kerner blev fundet i disse celler sammenlignet med kontrol-celler (Figur S4). Melanom celler udviste større mængde af både cyclin D1 niveauet og procentdelen af positive kerner for cyklin D1, vurderet ved Western blot og immunfluorescens end deres ikke-tumor modstykke PIG-1 (figur S3 og S4), som vil blive relateret til de forhøjede niveauer af ROS og procentdelen af A375-celler i S-fase. Ingen signifikante forskelle i cyclin E, blev observeret CDK2 og CDK4 niveauer mellem katalase-behandlede og kontrolceller og mellem ikke-tumor celler og tumorceller (Fig S3). Således ville faldet i cyclin D1 observerede niveauer være involveret i G1 /S standsning induceret af katalase i A375-celler.

katalasebehandling induceret Nuclear Lokalisering af p27KIP1

I betragtning af G1 arrest induceret af katalase og betydningen af den subcellulære lokalisering af den hæmmende protein p27KIP1 for sin lovgivningsmæssige aktivitet, blev virkningen af H

2 scavenging på lokaliseringen af dette protein undersøgt ved immunofluorescens. Bemærkelsesværdigt, p27KIP1 blev lokaliseret primært i kernen i melanom celler behandlet med eller overekspression katalase sammenlignet med kontroller, hvor p27KIP1 fordeling var overvejende cytoplasmatisk (figur 3A-3D). Desuden melanocytter udviste en højere procentdel af positive p27KIP1 celler end det A375 melanomceller (figur 3E og 3F). Dette protein blev primært lokaliseret i kernen i ikke-tumorceller og i cytoplasmaet i tumorceller (fig 3E og 3F).

(A-F) subcellulære lokalisering af p27KIP1 evalueret af immunocytofluorescence. (A-B) melanomceller behandlet med 500 og 1000 U /ml catalase (CAT) i perioder på 6 eller 24 timer eller venstre ubehandlet. FBS udsultede celler blev anvendt som kontrol af G1 arrest. (C-D) Katalase overekspression model (A375-CAT-E9-celler) i forhold til kontroller (A375-pcDNA3 og A375 kontrolceller). (E-F) Non-tumor (PIG-1) vs. tumor (A375) celler. (A, C og E) Repræsentative billeder af p27KIP1 immunocytofluorescence viser den subcellulære lokalisering af proteinet. DAPI: farvning af nuklear DNA; p27KIP1: FITC farvning af p27KIP1 protein. (B, D og F) procentdelen af positive (□) cytoplasmaer og positive (■) kerner til p27KIP1 forhold til det totale antal optalte celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. (B) ** p 0,01 over for kontrol. (D) * p 0,05 og ** p 0,01 vs. A375 kontrol. (F) * p 0,05 og ** p 0,01 vs. non-tumorceller. (G-H) Øget ekspression af nuklear p27KIP1 i A375-celler efter 1.000 U /ml catalase (CAT) behandling sammenlignet med kontrol A375-celler (behandlet med 1.000 U /ml varmeinaktiveret katalase, IN-CAT) i 24 timer, detekteres ved Western blot af nukleare og cytosoliske ekstrakter (se fremgangsmåder). (G) Repræsentative immunoblot billeder skal vises. C: Cytoplasmiske planteekstrakter; N: Nuclear ekstrakter. Actin og Ku-70 densitometriske værdier blev brugt til at standardisere for cytoplasmatisk og nuklear protein lastning, hhv. (H) Relative densitometriske værdier af (□) cytoplasmatiske og (■) nukleare p27KIP1 niveauer. Resultater er omtalt kontrolceller. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. * P. 0,05 vs. kontrol

For at bekræfte virkningen af H

2 latrintømning på p27KIP1 lokalisering observeret af immunofluorescens, niveauet af dette protein i nukleare og cytosol ekstrakter af melanomceller behandlet med katalase blev evalueret ved Western blot. Vi viste en signifikant stigning i p27KIP1 niveauer i nukleare ekstrakter af celler behandlet med katalase i forhold til kontrol (figur 3G og 3H).

Disse resultater viser modulationen af den intracellulære lokalisering af p27KIP1 i reguleringen af celleproliferation ved katalase og bekræfter vores tidligere fund [35], at udvide disse resultater til humane A375-celler. Den vedvarende p27KIP1 i kernen fremkaldt af H

2 fjernelse ville favorisere blokering af cellecyklus ved G1 /S overgang.

2 Modulation fører til post-translationelle modifikationer af p27KIP1

Vi demonstrerede også en signifikant forøgelse af de samlede niveauer af p27KIP1 som reaktion på katalase behandling eller overekspression bedømt ved western blot (Figur 4). Dette kunne være relateret til de høje niveauer af p27KIP1 observeret i kernen af katalase behandlede celler (figur 3E). Desuden melanomceller udviste lavere niveauer af denne hæmmende protein sammenlignet med melanocytter (figur 4). Med hensyn western blot (Figur 4) og immunofluorescens (figur 3) resultater og i betragtning af at p27KIP1 niveauer, funktion og lokalisering er reguleret af phosphoryleringer, niveauerne af p27KIP1 phosphoryleret ved S10 (p27pS10), T198 (p27pT198) og T187 (p27pT187) som svar til H

2 scavenging blev evalueret ved Western blot. Phosphorylering af p27KIP1 på S10 og T198 er en central begivenhed for nuklear eksport af dette protein og progression af cellecyklus, og vi demonstreret et signifikant fald i niveauerne af p27pS10 og p27pT198 i celler, der overudtrykker eller behandlet med katalase i sammenligning med kontroller (figur 4 ). Desuden PIG-1 melanocytter afslørede lavere niveauer af p27pS10 og p27pT198 end deres tumor modstykke (figur 4).

udtryk for p27KIP1 og p27KIP1 fosforyleret på S10 (p27pS10) og T198 (p27pT198) blev analyseret ved Western blot . (A-B) A375 melanomceller behandlet med katalase (CAT) til 6 og 24 timer. FBS udsultede celler blev anvendt som kontrol af G1 arrest. (C-D) Katalase overekspression model (A375-CAT-E9-celler) i forhold til kontroller (A375-pcDNA3 og A375 kontrolceller). (E-F) Non-tumor (PIG-1) vs. tumor (A375) celler. (A, C og E) Repræsentative immunoblot billeder. (B, D og F) Relativ densitometriske værdier af () p27KIP1 niveauer, (□) p27pS10 og (■) p27pT198. Actin densitometriske værdier blev anvendt til at standardisere for protein loading. Resultaterne er henvist til at styre uden behandling (i B og D), og til ikke-tumor (PIG-1) celler (i F). Data er udtrykt som middelværdi ± SD. (B) * p 0,05 og ** p 0,01 vs. ubehandlet kontrol. (D) ** p 0,01 vs. A375 kontrol. (F) ** p. 0,01 vs. non-tumorceller

Disse resultater tyder på, at reducerede niveauer af H

2O forhindre

2 ved katalase phosphorylering af specifikke steder i p27KIP1 derfor undgår den nukleare udførsel af proteinet og fører til standsning af cellecyklus gennem akkumulering af p27KIP1 i kernen. Desuden blev phosphoryleringen af p27KIP1 på T187, som er involveret i udløsning proteolyse af dette protein, evalueret i katalase-behandlede melanomceller og ingen signifikante forskelle blev observeret vs ubehandlede kontroller (Fig S5).

I betragtning at vækstfaktorer udløser H

2 produktion, der fører til aktivering af signalveje for celleproliferation [27], vi vurderet, hvordan H

2O er involveret

2 i modulering af p27KIP1 i G1 arresteret A375 celler ved FBS sult inkuberet med forskellige niveauer af H

2 for 24 timer. Figur 5A viser øget intracellulære niveauer af ROS på en dosis-afhængig måde i celler behandlet med 0,1-10 uM H

2 i sammenligning med FBS udsultede celler. Det er tidligere blevet rapporteret, at anvendelsen af 0,1-7 uM H

2 til dyrkede celler resulterer i intracellulær H

2 etager på ca. 0,01-0,07 uM og direkte stimulerer celleproliferation. På den anden side, stigende mængder af celledød forekomme med anvendt koncentrationer af H

2≥10 pM [revideret i 26]. I vores cellulær model, inkubation af FBS udsultede celler med 0,1 uM H

2O inducerede

2 en stigning i proliferationshastighed sammenlignet med ubehandlede FBS udsultede celler. På den anden side blev ingen effekt i celleproliferation observeret med de andre doser af H

2 anvendes (figur 5B). Celler behandlet med 0,1 uM H

2 udstillet en overvejende cytoplasmatisk p27KIP1 distribution; ligner celler inkuberet med 10% FBS mens p27KIP1 fandtes hovedsagelig i kernen i ubehandlede FBS udsultede celler (figur 5C og 5D). Den subcellulære lokalisering af dette protein i celler behandlet med 0,01 uM H

2 var sammenlignelig med den observeret i FBS sultede celler mønster og tilsætning af 1-10 uM H

2 at A375 FBS sultede celler resulterede i en lignende procentdel af nuklear og cytoplasmatisk p27KIP1 (figur 5C og 5D). Western blots viste reducerede niveauer af p27KIP1 i celler behandlet med 0,01 uM H

2 sammenlignet med FBS sultede celler og celler behandlet med 0,1-10 uM af H

2 (figur 5E og 5F). Niveauerne af p27pS10 og p27pT198 i celler behandlet med 0,1 uM H

2 forøget som i celler inkuberet med 10% FBS mens FBS sultede celler viste lave niveauer af p27pS10 og p27pT198 (figurerne 5E og 5F). Tværtimod blev ingen signifikante forskelle fundet i niveauerne af p27pT187 i celler behandlet med exogen H

2 (0,1 og 10 uM) sammenlignet med både FBS sultede og 10% FBS inkuberet kontrolceller (figur S5 ). Disse resultater antyder, at H

2 ved en mitogen niveau på 0,1 uM for vores cellulær model regulerer p27KIP1 phosphorylering fører til cytoplasmisk lokalisering af dette protein og begunstige celleproliferation.

melanom (A375) -celler dyrket i komplet medium med 10% FBS blev arresteret af FBS sult (0% FBS) i en periode på 24 timer og derefter celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af H

2 (0,01-10 uM) eller 10% FBS. (A) Intracellulær ROS-niveauer målt ved DCFH-DA-analysen. (B) Cell proliferationshastighed evalueret af MTT-assayet. (C) Repræsentative billeder af p27KIP1 immunocytofluorescence viser den subcellulære lokalisering af proteinet. DAPI: farvning af nuklear DNA; p27KIP1: FITC farvning af p27KIP1 protein. (D) procentdelen af positive (□) cytoplasmaer og positive (■) kerner til p27KIP1 forhold til det totale antal optalte celler. (E) Ekspressionen af p27KIP1, p27pS10 og p27pT198 analyseret ved western blot. (F) Relative densitometriske værdier af () p27KIP1 niveauer, (□) p27pS10 og (■) p27pT198. Actin densitometriske værdier blev anvendt til at standardisere for protein loading. Resultater er omtalt styrer inkuberet med 10% FBS. (A, B, D og F) Data er udtrykt som middelværdi ± SD. * P 0,05, ** p 0,01 og *** p 0,001 vs. celler inkuberet med 10% FBS;

# p 0,05,

## p 0,01 og

### p 0,001 vs. FBS-sultede celler ikke-eksponeret for H

således viste vi, at H

2 ville være underforstået i modulering af vigtige regulatoriske post-translationelle modifikationer af p27KIP1 protein i melanom celler.

Katalase modulerer også de Cell Proliferation og subcellulære lokalisering af p27KIP1 i kolorektal karcinom og neuroblastomceller

for at udvide de observerede for melanom celler behandlet med katalase til andre humane cancer celletyper resultater, vi evalueret celleproliferation, cellecyklus og p27KIP1 intracellulær fordeling i kolorektal carcinom (LoVo) og neuroblastom (Paju) celler. Karakteriseringen af vores cellulære modeller på ROS-niveau viste, at LoVo celler udviste lavere intracellulære ROS niveauer end Paju og A375-celler (Figur S6). Interessant, observerede vi en lav proliferationshastighed (p 0,01) for både LoVo og Paju celler (figur 6) som reaktion på de reducerede niveauer af ROS induceret ved tilsætning af katalase til celle kulturer (figur 6). LoVo og Paju celler behandlet med katalase i 24 timer udviste et signifikant G1 cellecyklusstandsnings (figur 6) forbundet med et fald i cyclin D1 niveauer (fig S7). Efter aftale med disse resultater, signalet for cyclin D1 detekteret ved immunfluorescens var ekstremt lav i kernen af celler behandlet med katalase og et væsentligt fald i procentdelen af positive kerner blev fundet i disse celler i sammenligning med kontrolceller (fig S8). Ingen signifikante forskelle i cyclin E, blev observeret CDK2 og CDK4 niveauer mellem katalase-behandlede og ikke-behandlede celler (fig S7).

LoVo og Paju celler blev behandlet med 0-1000 U /ml catalase (CAT) i 24 timer. (A-B) Intracellulær ROS-niveauer bestemt ved DCFH-DA-assay. (A) Repræsentative histogrammer af DCF fluorescens af celler behandlet med 500 (blå linie) og 1000 (orange linje) U /ml catalase eller venstre ubehandlet (grøn linje) i 24 timer. Kontrol celler ikke er udsat for DCFH-DA (sort linje) og kontrol celler behandlet med katalase lige før DCFH-DA inkubation (rød linje). (B) DCF betyde fluorescens (arbitrære enheder) versus katalase dosis. (C) Cell proliferationshastighed af LoVo og Paju celler behandlet med katalase i 24 timer i forhold til kontrol-celler, bedømt ved MTT-assayet. (D-E) Cellecyklusanalyse vurderet ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid. (D) Repræsentative histogrammer af DNA-indholdet celler behandlet med katalase (CAT). (E) Procentdel af celler i de forskellige faser af cellecyklussen som respons på CAT behandling. FBS udsultede celler blev anvendt som kontrol af G1 arrest. (□) Ubehandlede kontrolceller, () 500 U /ml og (■) 1.000 U /ml CAT og () FBS udsultede celler. (B, C og E) Data er udtrykt som middelværdi ± SD. * P 0,05 og ** p. 0,01 over for kontrol

(A og B) Nuklear lokalisering af p27KIP1 med katalase (CAT) blev påvist ved immunocytofluorescence. (A) Repræsentative billeder af p27KIP1 immunocytofluorescence viser den subcellulære lokalisering af proteinet. DAPI: farvning af nuklear DNA; p27KIP1: FITC farvning af p27KIP1 protein. (B) Procentdel af positive cytoplasmaer (□) og positive kerner (■) for p27KIP1 forhold til det totale antal optalte celler. (C og D) Forhøjelse af p27KIP1 niveauer og fald i p27KIP1 fosforyleret på S10 (p27pS10) og T198 (p27pT198) som svar på H

2 latrintømning, analyseret ved western blot. (C) Repræsentative immunoblot billeder. (D) Relative densitometriske værdier af () p27KIP1 niveauer, (□) p27pS10 og (■) p27pT198. Actin densitometriske værdier blev anvendt til at standardisere for protein loading. Resultater er henvist til at styre uden behandling. (B og D) Data er udtrykt som middelværdi ± SD. * P 0,05 og ** p 0,01 vs. ubehandlet kontrol. (A-D) FBS udsultede celler blev anvendt som kontrol af G1 arrest.

colorektalt carcinom og neuroblastomceller behandlet med katalase også viste p27KIP1 lokaliseret primært i kernen i sammenligning med kontroller, hvori p27KIP1 fordeling var overvejende cytoplasmatisk (figur 7A og 7B viser behandlinger i 24 timer og fig S9A og S9B viser behandlinger i 6 timer). Desuden har vi påvist ved western blot en betydelig stigning i niveauerne af p27KIP1 som reaktion på katalase behandling for både LoVo og Paju celler (figur 7C og 7D behandlinger for 24 timer og figur S9C og S9D behandlinger i 6 timer). Endelig har vi gengivet et signifikant fald i niveauerne af p27pS10 og p27pT198 i colorectalt carcinom og neuroblastomceller behandlet med katalase i sammenligning med kontroller (figur 7C og 7D behandlinger for 24 timer og figur S9C og S9D behandlinger i 6 timer).

Disse resultater bekræftet og udvidet vores tidligere fund. Vi foreslår, at ROS falde i forskellige humane cancerceller ved katalase regulerer den subcellulære lokalisering af p27KIP1 undgå phosphorylering af proteinet på centrale sites (S10 og T198), der fører til akkumulering af p27KIP1 i kernen som favoriserer cellecyklusstandsning.

diskussion

i denne undersøgelse demonstrerede vi en modifikation i den subcellulære lokalisering af p27KIP1 medieret af ændringer i phosphorylering af specifikke rester af dette protein som respons på H

2-niveau variationer . Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Data er udtrykt som middelværdi ± SD.

Kronisk sygdom

PLoS ONE: Phosphorylering og Subcellulær Lokalisering af p27KIP1 Reguleret af Hydrogenperoxid Modulation i Cancer Cells

Be the first to comment

Leave a Reply Annuller svar