PLoS ONE: caveolin-1 Regulerer Endotel Adhæsion af Lung Cancer Cells via Reaktive Oxygen Species-Dependent Mechanism

Abstrakt

viden om den rolle, caveolin-1 (Cav-1) protein på endotel vedhæftning af kræft celler er uklar. Den foreliggende undersøgelse viste, at Cav-1 spiller en negativ regulerende rolle på kræft-endotel interaktion. Endogen Cav-1 viste sig at nedregulere under Cellefrigørelse og niveauet af et sådant protein blev omvendt associeret med tumor-endothelial adhæsion. Endvidere ektopisk overekspression af KAV-1 svækket evne cancercellerne at overholde endotel mens shRNA-medieret Cav-1 knock-down udviste den modsatte virkning. Vi fandt, at Cellefrigørelse forøget cellulær hydrogenperoxid og hydroxylradikal generation og sådanne reaktive oxygenarter (ROS) var ansvarlige for den stigende interaktion mellem cancerceller og endotelceller gennem vaskulær endotelcelle-adhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1). Vigtigere, blev Cav-1 vist at undertrykke hydrogenperoxid og hydroxylradikal dannelse ved at opretholde niveauet af aktiveret Akt, som var kritisk for den rolle, Cav-1 i svækkelse af celleadhæsion. Sammen nærværende undersøgelse afslørede romanen rolle Cav-1 og underliggende mekanisme på tumor vedhæftning som forklarer og fremhæve en vigtig rolle i Cav-1 på lungekræft celle metastase

Henvisning:. Chanvorachote P, Chunhacha P ( 2013) caveolin-1 Regulerer Endotel Adhæsion af Lung Cancer Cells via reaktiv ilt arter-afhængig mekanisme. PLoS ONE 8 (2): e57466. doi: 10,1371 /journal.pone.0057466

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

Modtaget: 18 oktober, 2012; Accepteret: 21 januar 2013; Publiceret: 27 februar, 2013 |

Copyright: © 2013 Chanvorachote, Chunhacha. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud fra forskningsfonden Thailand (P. Chanvorachote) og postdoc stipendium (Ratchadaphiseksompot Endowment Fund, Chulalongkorn). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for nylig har roller caveolin-1 (Cav-1) i reguleringen af ​​kræft progression og metastase i forskellige former for kræft blevet afsløret [1] – [4] og sådan en protein måske fået mest opmærksomhed i kræftforskning. Selv om nogle undersøgelser antydet, at KAV-1 kan spille en rolle ved inhibering af udviklingen af ​​kræft i visse cancere [5], i lungekræft, Cav-1 potenserer cancer aggressivitet samt metastase [6]. Sammen med den kendsgerning, at KAV-1-ekspression i lungecancer blev vist at relatere til dårlig prognose [2], og det meste af cancer-relaterede dødsfald i denne kræft blev vist at linke med metastase, er det af stor interesse at undersøge hele regulerende rolle af dette protein på cancermetastase [7]. Metastase er en multi-trins proces af kræftceller spreder fra deres oprindelige placeringer til de fjerne sekundære sites. Startende med kræftcellen løsrivelse fra deres primære tumor, cellerne invadere karvæggen, rejser i kredsløbet, og holde sig til endotel at danne de sekundære tumorer. Selvom roller Cav-1 på lungekræft celle adfærd er blevet intensivt undersøgt, hvilken rolle sådant protein på lungekræft celleadhæsion til endotel overflade er stort set ukendt. Vi og andre har foreslået den vigtige rolle, Cav-1 i rendering cancerceller resistente over for anoikis efter Cellefrigørelse [6], [8], [9], [10], styrkelse invasion og migration [11] og lette vækst i forankring-uafhængig måde [12]. Endogen Cav-1-niveauet blev vist i tidligere undersøgelser, der skal styres af de reaktive oxygenarter (ROS). I fritliggende celle tilstand, blev hydrogenperoxid vist sig at øge den cellulære niveau af KAV-1 ved at hæmme dets nedbrydning [6]. Mens der i de vedhæftende celler, hydroxyl radikal viste sig at være en nøglespiller i opregulering Cav-1-ekspression og øget celle migration [11]. Disse resultater fremhævede regulerende rolle af ROS om Cav-1-ekspression og deres ledsager roller på kræft metastaser.

I biologi findes negativ feedback regler for at forhindre alt for store stimulationer. Ligeledes blev Cav-1-proteinet vist sig at undertrykke oxidativ stress forårsaget af hydrogenperoxid eksponeringer [13]. Men det er stadig uvist, om Cav-1 regulerer ROS niveau i løsrevne celler og en sådan regulering er afgørende for kræft klæbende egenskab. Brug af farmakologiske og genetiske fremgangsmåder, den foreliggende undersøgelse viste, at KAV-1 spiller en central rolle i inhibering af cancer-endotel-adhæsion ved at dæmpe hydrogenperoxid og hydroxylradikalscavengers generationer efter Cellefrigørelse. Den foreliggende undersøgelse viste også, at KAV-1 undertrykte sådan ROS-dannelse gennem Akt-afhængig mekanisme. Sammen med den observation, at KAV-1 faldt i en tidsafhængig måde efter Cellefrigørelse, fandt vi, at på senere-tidspunkt point, cancer-endotel-adhæsion signifikant forøgede samtidig af at KAV-1 udtynding. Således er vores undersøgelse viste, at der findes en ny mekanisme for kræft celleadhæsion om Cav-1, som kan udnyttes i metastase og drug design.

Materialer og metoder

Celler og reagenser

Ikke lille lungecancer celle (NSCLC) -H460 og vaskulære endotel human (HUV-EC-C) -celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). H460 celler blev dyrket i RPMI 1640, mens HUV-EC-C-celler blev dyrket i M199-medium. RPMI 1640 blev suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin. M199 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 10 mM L-glutamin og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin, 0,1 mg /ml heparin, 0,05 mg /ml endotelcellevækst-supplement (ECGS). Alle af kulturen blev inkuberet i en COZ 5%

2 miljø ved 37 ° C. 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH

2-DA), dimethylsulfoxid (DMSO), caveolae isolation kit, Calcein AM, Heparin sodium blev opnået fra Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO); Rabbit caveolin-1-antistof og peroxidase-konjugeret sekundært antistof fra Abcam (Cambridge, MA); Hydrophenyl fluorescein (HPF), LY294002, Amplex Red, Lipofectamine 2000 var fra Invitrogen (Carlsbad, CA); Antistof til β-actin fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); Antistof for pan-Akt, p473-Akt, PTEN, EGFR, Phospho-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) var fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA); Endotelcellevækst supplement var fra Millipore Corporation (Billerica, MA)

Plasmid og transfektion

Cav-1 ekspressionsplasmid pEX_Cav-1 og dens kontrol vektor.; pDS_XB-YFP blev erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og Cav-1 knockdown plasmid shRNA-Cav-1 og dens kontrol vektor; kontrol shRNA plasmid A blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Stabile transfektioner af KAV-1 ekspressionsplasmid eller KAV-1 knockdown plasmid blev genereret ved dyrkning H460 celler i en 6-brønds plade, indtil de nåede 60% konfluens. 15 pi Lipofectamine reagens og 2 ug Cav-1 og shRNA-Cav-1 plasmid blev anvendt til at transficere celler i fravær af serum. Efter 12 timer blev mediet erstattet med dyrkningsmedium indeholdende 5% føtalt bovint serum. Ca. 36 timer efter begyndelsen af ​​transfektion blev cellerne fordøjet med 0,03% trypsin, og cellesuspensionerne blev udpladet på 75-ml dyrkningskolber og dyrket i 24 til 28 dage med G418 eller puromycin til selektion af Hcav-1 og shCav- 1 hhv. De stabile transfektanter blev samlet og ekspressionen af ​​KAV-1-protein i transfektanterne blev bekræftet ved Western blotting. Cellerne blev dyrket i antibiotikum frit RPMI 1640 medium i mindst to passager før anvendt i hvert eksperiment.

ROS Detection

Intracellulær ROS blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse DCFH

2-DA som en fluorescerende probe. Kort fortalt blev celler inkuberet med 10 pM DCFH-DA, HPF i 30 minutter ved 37 ° C, hvorefter de blev vasket, trypsiniseret, resuspenderes i phosphatbufret saltvand, og straks analyseret for fluorescensintensitet af FACScan flowcytometer (Beckton Dickinson, Rutherford, NJ) med en 488-nm excitation stråle og en 538-nm båndpasfilter. Median fluorescensintensitet blev kvantificeret ved CellQuest software (Becton Dickinson) analyse af de optagede histogrammer.

H

2O

2 blev bestemt ved Amplex Red-reagens (Invitrogen). Kort beskrevet blev reaktionsblandingen indeholdende 50 uM Amplex Red reagens og 0,1 U /ml HRP i Krebs-Ringer phosphat (KRPG) tilsat til hver mikropladebrønd. Efterfølgende 20 pi 1,5 × 10

4 H460 celler suspenderet i KRPG blev tilsat til reaktionsblandingen. Efter 30 minutters inkubation, fluorescenssignalet opnået fra fluorescensmikropladelæser udstyret til excitation i området fra 530 til 560 nm og detektion emission ved 590 nm blev overvåget og målt over 3 timer efter løsrivelse.

Monolayer celleadhæsionsassayet

HUV-EF-C blev stimuleret med 10 ng /ml IL-1

β

for 0-4 timer. H460-celler (2,5 x 10

4 celler /ml) blev farvet med 15 uM i 45 min calcein AM (Sigma) ved 37 ° C og 5% CO

2, derefter tilsat på en semi-konfluent monolag kultur af HUV-EC-C, inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C med rotation ved 120 rpm og vasket omfattende at udelukke ikke-specifik cellebinding. Antallet af vedhæftede celler blev talt direkte under et fluorescensmikroskop som tidligere [14] rapporterede. For antistofmedieret blokering af celleadhæsion, blev IL-1β stimuleret HUV-EC-C inkuberet med antistof mod VCAM-1, ICAM-1 og E-selektin (i en endelig fortynding på 1:400 for hver antistoffer) i 3 timer ved 37 ° C i befugtet CO2 inkubator, og derefter H460 celler blev tilsat.

caveolae isolation

caveolae blev isoleret fra shCav-1, H460 og Hcav-1-celler ved anvendelse af en caveolae isolation kit (Sigma). ShCav-1, H460 og Hcav-1-celler blev opsamlet og lyseret med lysepuffer indeholdende 1% Triton X-100. Lysaterne blev centrifugeret ved 10.000

g

i 15 min. Detergent-resistente membranfraktioner blev isoleret på OptiPrep Density Gradient Medium (0, 20, 25, 30, og 35%). Caveolae blev indsamlet fra caveolin-1-berigede fraktioner, som er blevet anvendt til undersøgelse af Cav-1 og PTEN udtryk.

Western Blotting

Efter specifikke behandlinger blev celler inkuberet i lysisbuffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1% Triton X-100, 150 mM natriumchlorid, 10% glycerol, 1 mM natriumorthovanadat, 50 mM natriumfluorid, 100 mM phenylmethylsulfonylfluorid, og en kommerciel protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals) i 30 min på is. Cellelysater blev opsamlet og bestemt for proteinindhold ved anvendelse af Bradford-metoden (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lige så stor mængde af proteiner af hver prøve (40 ug) blev denatureret ved opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter med Laemmli loading buffer, og efterfølgende fyldt på 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Efter separation blev proteiner overført til 0,45 um nitrocellulose membraner (Bio-Rad). De overførte membraner blev blokeret i 1 time i 5% fedtfri tørmælk i TBST (25 mM Tris-HCI (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% Tween 20) og inkuberet med de passende primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Membraner blev vasket to gange med TBST i 10 minutter og inkuberet med peberrodsperoxidase- koblede isotypespecifikke sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. De immunkomplekser blev detekteret ved forbedret med kemoluminescens substrat. (Supersignal West Pico, Pierce) og kvantificeres ved hjælp af analytiker /PC densitometri software (Bio-Rad)

Statistisk analyse

Mean data fra uafhængige forsøg blev normaliseret at skyldes celler i kontrollen. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. En statistisk analyse mellem to grupper blev verificeret ved Students t-test, sammenlignet med flere grupper blev en analyse af variant (ANOVA) med post hoc test udført. Styrken af ​​relationer, korrelationskoefficienten (

r

), mellem hvert protein niveau efter løsrivelse blev bestemt med SPSS-version 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En P-værdi på mindre end 0,05 ville blive betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

caveolin-1 Udtømning efter Cell Detachment Forbedrer Tumor-endotelcelleadhæsion

Cav-1 blev vist at associere med metastatiske potentialer lungecancerceller [6], [12], mens stadig er uklar sin rolle på kræft celleadhæsion. For at undersøge rollen af ​​KAV-1 protein på kræft celleadhæsion, vi først fritliggende cancercellerne at efterligne den tidlige trin af metastase, og evalueret ekspressionsprofilen af ​​KAV-1 efter Cellefrigørelse over tid. Lungekræft H460 celler dyrket i ultralav fastgørelsesplader blev analyseret for KAV-1-proteinekspression ved western blotting ved angivne tidspunkter. Figur 1A viser, at efter celle detachement, Cav-1 faldt gradvist i en tidsafhængig måde og det betydelige fald blev opdaget så tidligt som 6 timer efter celle løsrivelse. Derefter blev de suspenderede celler ved samtidige tidspunkter underkastes monolag celleadhæsionsassay som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. 1A og B viser, at efter celle detachement, Cav-1-ekspression gradvist faldt over tid samtidig med stigningen i kræftcellen vedhæftning på endotel overflader, hvilket tyder på den potentielle rolle for Cav-1 i kræft klæbende regulering. Vi støttede yderligere sådan en sammenhæng, ved at generere en sammenhæng plot mellem Cav-1-ekspression og kræft celleadhæsion (fig. 1 C). Ikke kun gjorde reduktionen af ​​disse proteiner korrelerer godt med den forbedrede evne kræftceller til at klæbe på endotel overflader, men plottet afslørede også en højt korreleret profil med korrelationskoefficient på 0,922

A.:

H460 celler blev suspenderet i poly-HEMA-overtrukne plader i forskellige tidsrum (0-12 h) og KAV-1-ekspression blev analyseret ved Western blotting. Kolonner er middel ± SD (

n =

5). *

P

0,05 vs.

tid 0. B:

Villa H460 celler blev udsat for et monolag kultur af HUV-EF-C. Interaktionen mellem H460 og HUV-EC-C-celler blev undersøgt i nærvær af IL-1

β

(10 ng /ml). Fase kontrast mikroskopiske billeder af repræsentative eksperimenter er vist.

C:

Korrelation analyse af cellulære Cav-1 niveau over H460-HUV-EF-C vedhæftning (

n

= 5).

D:

Cav-1 overudtrykt Hcav-1 eller kort hårnål Cav-1-transficerede shCav-1-celler blev konstrueret og analyseret for KAV-1-ekspression ved Western blotting. Blots blev igen probet med β-actin-antistof for at bekræfte ens ladning af prøver. Immunblottet signaler blev kvantificeret ved densitometri, og: data fra uafhængige forsøg blev normaliseret til resultaterne. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. H460 celler.

E:

Hcav-1, H460, og shCav-1 celler blev løsrevet i 3 timer og tilføjet på en kultur af HUV-EF-C. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

. 0,05 vs. H460 celler

For at bekræfte, at Cav-1 dæmper kræft celleadhæsion til endotelceller, vi undersøgt virkningen af ​​forskellige ektopiske Cav-1-ekspressionsniveauer på H460 celler adhæsion til endotel. Vi etablerede Cav-1 overekspression (Hcav-1) celler, short-hårnål (sh) -medieret Cav-1 knockdown (shCav-1) celler ved stabil transfektion. Transfektanten kloner blev analyseret for KAV-1-ekspression i forhold til deres parentale H460 celler ved Western blotting (Fig. 1D). Det er bemærkelsesværdigt, at kontrol- transficerede celler genereret fra kontrolprøver plasmider, pDS_XB-YFP og kontrol shRNA plasmid A, også blev bedømt for KAV-1-ekspression, men; niveauet af proteinet var sammenlignelig med H460 celler (data ikke vist). KAV-1 overudtrykkes, Cav-1 knockdown, og H460-celler blev løsnet og underkastet endothelial adhæsion assay og cancercellerne hæfter til de HUV-EC-C-endotelceller blev observeret. Som forventet, analyse af celleadhæsion viste, at Cav-1 overudtrykte celler udviste den laveste evne til at overholde de HUV-EF-C celler, mens shCav-1 celler havde den højeste evne. Også blev vektor transficerede celler ligeledes vurderet for klæbende evne og vi fandt ingen signifikant ændring i sammenligning med den for parentale celler (data ikke vist). Dette indikerer, at KAV-1 negativt regulerer cancer celleadhæsion til vaskulært endotel.

caveolin-1 Undertrykker Hydrogenperoxid og hydroxylradikal Generation efter Cellefrigørelse

Vores tidligere undersøgelse har vist, at i den vedhæftede tilstand , Cav-1 funktion i svækkende oxidativ stress forårsaget af hydrogenperoxid behandling [13]. Derfor er det muligt, at KAV-1 protein kan fungere til at regulere redox status kræftcellerne under metastase. For at undersøge virkningen af ​​KAV-1 protein på løsgørelse-induceret ROS-generering, Cav-1 overudtrykkes (Hcav-1), blev KAV-1 knock-down (shCav-1), og kontrolceller (H460) fritliggende og inkuberet i adhæsion resistente plader indtil bestemte tidspunkter. De suspenderede celler blev derefter analyseret for intracellulære ROS-niveauer ved flowcytometri under anvendelse DCFH

2-DA som en fluorescerende probe. Figur 2A viser, at celle detachement inducerede en stigning i cellulære ROS i en tidsafhængig måde, der på linje med vores tidligere rapport [6]. Nærværende undersøgelse viste for første gang, at Cav-1 fungerede i formildende udstationering inducerede ROS i disse celler. ShCav-1 celler besidder den laveste Cav-1-ekspression blev vist at udvise den højeste ROS induktion og en sådan induktion kunne påvises så tidligt som 1 time efter løsrivelse (Fig. 2A), mens cellulære ROS i Cav-1 overudtrykt (Hcav- 1) celler blev ikke ændret som reaktion på celle løsrivelse

A:.

Cellular ROS niveau af fritliggende H460, shCav-1, og Hcav-1-celler blev bestemt ved flowcytometri bruge H

2DCF-dA som fluorescens-probe. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs.

tid 0. B:

H460, shCav-1, og Hcav- 1-celler blev behandlet med Mn (III) tetrakis (4-benzoesyre) porphyrin chlorid (MnTBAP, 50 uM), catalase (Kat, 7.500 U /ml), Natriumformiat (NaF, 2,5 mM), eller Deferoxamin (DFO, 1 mM). Den intracellulære ROS niveauet af disse celler blev bestemt ved H

2DCF-DA-sonde. Kolonner er middel ± SD (

n =

5), *

P

0,05 vs. vedhæftet kontrol (

tid 0

), og #

P

0,05 vs. ikke-behandlet kontrol ved tilsvarende tidspunkt.

C:

Hydrogenperoxid niveau af cellerne blev bestemt ved mikropladelæser hjælp Amplex Red. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. kontrol celler på

tid 0. D:

hydroxylradikal induktion blev bestemt ved HPF. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. kontrol celler ved

tid 0.

Desuden blev de specifikke ROS-inhibitorer anvendt til at evaluere specifik ROS som var opreguleret i disse celler. KAV-1 overudtrykkes, Cav-1 vælte, og H460-celler blev forbehandlet med specifikke ROS-inhibitorer, som var MnTBAP (a superoxid anion inhibitor), katalase (et hydrogenperoxid-inhibitor), deferoxamin (et hydroxylradikal inhibitor), og natriumformiat ( en hydroxyl radikaler), og ROS niveauer efter frigørelse for 0-3 timer blev bestemt. Figur 2B viser, at behandling med katalase, natriumformiat, og deferoxamin kunne blokere induktion af ROS i disse celler, hvilket antyder, at hydrogenperoxid og hydroxylradikal var primær specifik ROS opreguleret efter Cellefrigørelse.

Virkningen af CAV-1 på hydrogenperoxid og hydroxylradikal produceret af disse celler blev derefter evalueret. Amplex rød, en specifik påvisning probe til hydrogenperoxid og HPF, en specifik påvisning probe for hydroxyl radikal, blev anvendt til at bestemme sådanne specifikke ROS i de løsrevne celler. Figurerne 2C og D viser, at Cellefrigørelse øgede signaler af hydrogenperoxid og hydroxylradikalscavengers specifikke prober i en tidsafhængig måde. Vigtigt er det, at signalet af enten hydrogenperoxid eller hydroxyl radikal var knap påviselig i KAV-1 overudtrykte celler, hvorimod sådanne ROS signaler blev forstærket i de celler, der udtrykker et lavt niveau af KAV-1. Disse resultater viste, at KAV-1 svækkede hydrogenperoxid og hydroxylradikalscavengers generationer i suspenderede lungecancerceller.

Hydrogenperoxid og hydroxylradikal Reguler Cancer celleadhæsion til endotelceller via VCAM-1-afhængig mekanisme

ROS blev vist i mange undersøgelser til at spille en central rolle i reguleringen af ​​kræft celle adfærd [11]. Sammen med ovenstående resultater indikerer, at KAV-1 svækket hydrogenperoxid og hydroxylradikalscavengers formationer under Cellefrigørelse, undersøgte vi, om hydrogenperoxid og hydroxylradikal spille en rolle i reguleringen af ​​kræft celleadhæsion. Lungecancerceller blev inkuberet med forskellige kendte specifik ROS modulerende midler som beskrevet, og cellerne blev udsat for de adhæsionsassays. Figur 3A viser, at behandling af cellerne med en superoxid-inhibitor MnTBAP havde kun en minimal og ubetydelig virkning på cancercelle adhæsiv aktivitet, hvorimod tilsætning af katalase, deferoxamin, og natriumformiat signifikant inhiberede adhæsion af H460-celler til endotel overflade. Disse resultater antydede, at hydrogenperoxid og hydroxyl radikal, men ikke superoxid anion er ROS der potenserer klæbende evne af disse kræftceller til vaskulære endotelceller

A:.

H460 celler blev efterladt ubehandlet eller forbehandlet med Mn (III) tetrakis (4-benzoesyre) porphyrin chlorid (MnTBAP, 50 uM), catalase (Kat, 7.500 U /ml), Natriumformiat (NaF, 2,5 mM), eller Deferoxamin (DFO, 1 mM), derefter fritliggende i 3 timer før adhæsion assay. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. ubehandlet kontrol.

B:

H460 celler blev behandlet med 100 uM H

2O

2 eller 100 uM H

2O

2 og 50 uM FeSO

4 og underkastes den HUV- EF-C overflade, der blev blokeret af VCAM-1, ICAM-1 eller E-selectin antistoffer. Fase kontrast mikroskopiske billeder af repræsentative eksperimenter er vist. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

. 0,05 vs. ubehandlet kontrol

Beviser har foreslået, at endotelceller adhæsionsmolekyler (ECAMs) spiller en vigtig rolle på cancer-endotelcelle interaktion [15]. Aktivering af endotelceller med IL-1

β

inducerede ekspression af ECAMs nemlig VCAM-1, ICAM-1 og E-selectin på endotelceller celleoverflader, og disse proteiner lettes bindingen af ​​cancerceller [15]. For at bekræfte den rolle, hydrogenperoxid og hydroxylradikal på cancer-endotelcelle interaktion og definere de berørte adhæsionsmolekyler, vi blokeret endotelcellerne overflader med specifikke antistoffer mod VCAM-1, ICAM-1 og E-selectin, før cancer celleadhæsion . Også blev kræftcellerne behandlet med exogen hydrogenperoxid i fravær eller nærvær af ferrosulfat at bekræfte den rolle, hydrogenperoxid og hydroxylradikal, henholdsvis.

Figur 3B viser, at hydrogenperoxid og hydroxylradikal signifikant forøget kræft celleadhæsion til endotelceller, hvilket bekræfter betydningen af ​​nævnte ROS om kræft celleadhæsion. Interessant nok kunne blokere endotel med VCAM-1-antistoffer ophæve virkningen af ​​hydrogenperoxid og ferrosulfat på den klæbende egenskab af disse cancerceller, mens antistoffer mod ICAM-1 og E-selectin havde nogen signifikante virkninger. Disse resultater indikerede, at hydrogenperoxid og hydroxylradikal maj, i det mindste delvis, regulere interaktionen af ​​cancercellerne, endotheloverflade gennem VCAM-1-afhængig mekanisme. Desuden kan Cav-1 mindske klæbende egenskab af kræftceller ved at dæmpe hydrogenperoxid og hydroxyl radikal.

Cav-1 blænder ROS Generation efter Cell Detachment gennem PI3K /Akt Pathway

Efter at have vist at Cav-1 svækket kræft evne til at holde sig til en endotel ved at nedsætte cellulære hydrogenperoxid og hydroxyl radikale op-regler, og beviser viste, at Cav-1 regulerer flere celle adfærd under celle løsrivelse gennem PI3K /Akt vej [11]. For yderligere at bekræfte rolle Cav-1 på Akt signalering, monitorerede vi den Akt aktivering i form af phosphoryleret (serin 473) Akt. Efter aftale med tidligere fund [16], fandt vi det øgede niveau af Akt aktivering i Hcav-1 celler i forhold til den i H460 og shCav-1 celler (fig. 4A). Vi fandt også, at Cellefrigørelse formindskede signifikant niveau af aktiveret Akt i næsten alle celler. Mens fosforyleret (serin 473) Akt i shCav-1 celler sig at være mest berørt af en sådan celle detachement, niveauet af aktiverede Akt i Hcav-1 var knap ændret (fig. 4A).

A:

H460, shCav-1, og Hcav-1-celler blev løsnet og ophængt i poly-HEMA-overtrukne plader i 0-3 timer. p473-Akt og pan-Akt niveau i disse celler blev bestemt ved antistoffer specifikke for p473-Akt og pan-Akt. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. H460 celler på

tid 0

,

#P

0,05 vs. tilsvarende kontrol celler ved

tid 0

.

B:

lysat af H460, shCav-1, og Hcav-1 celler blev anvendt til undersøgelse af PTEN, phospho-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) udtryk. Caveolae mikrosomale fraktion (M) blev fremstillet som beskrevet i materialer og metoder og anvendes til undersøgelse af PTEN (M). EGFR blev anvendt som en markør for caveolae fraktion. Kolonner er middel ± SD (n = 3), *

P

0,05 vs. H460 celler.

C:

H460 celler blev efterladt ubehandlet eller forbehandlet i 2 timer med 10 og 50 uM LY294002 så cellerne blev frigjort i 3 timer og analyseret for p473-Akt og Akt niveauer. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

0,05 vs. ubehandlet kontrol.

D:

H460-celler blev behandlet med LY294002 og bestemmes for ROS, hydroxylradikal, og hydrogenperoxid produktion af DCFH

2-DA, HPF, Amplex Red hhv. Kolonner er middel ± SD (

n =

4), *

P

0,05 vs. ubehandlet kontrol på

tid 0

, #

P

0,05 vs. ubehandlet kontrol på

3 timer. E:

ShCav-1 og Hcav-1 celler blev behandlet med LY294002 og analyser for cellulær ROS hjælp DCFH

2-DA. Kolonner er middel ± SD (

n =

3), *

P

. 0,05 vs. ubehandlet kontrol

Da fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti (PTEN) er en væsentlig negativ regulator af PI3K /Akt signalvejen, vi udførte også forsøget på at belyse den rolle, Cav-1 på PTEN. Vores resultater indikerede, at PTEN var opreguleret i cytoplasmatiske del (C), men nedreguleret i caveolae mikrosomale fraktion (M) i KAV-1 overudtrykkes (Hcav-1) celler i sammenligning med dem af H460-celler (Fig. 4B ). I modsætning hertil Cav-1-banke ned celler udviste de modsatte profiler, hvilket tyder på, at Cav-1 reguleret opdeling af PTEN. For at vurdere aktiviteten af ​​PTEN, western blot-analyse af den C-terminale phosphoryleret PTEN ved Ser380, Thr382, og Thr383 der fremmer PTEN stabilitet, men falde PTEN aktiviteter [17], blev udført. Figur 4b viser, at aktiverede PTEN var signifikant reduceret i Hcav-1 celler med observationerne at det phosphorylerede PTEN (ved Ser380, Thr382 og Thr383) blev signifikant forøget. Sammen med konstateringen indikerer, at phosphorylering af et sådant protein i ShCav-1-celler blev reduceret, blev Cav-1 påvist i nærvær undersøgelse, reguleres negativt aktiveret status PTEN og en sådan regulering kan i det mindste delvis, vedvarende niveauet for phosphoryleret Akt.

for at teste, om ændringen i phosphoryleret Akt påvirker cellulære oxidativ stress, en PI3K-inhibitor LY294002 blev brugt til at undertrykke Akt aktivering. H460-celler blev inkuberet med PI3K-inhibitoren LY294002 ved koncentrationerne på 10 og 50 pM, og Akt og phosphoryleret-Akt-niveauer blev bestemt ved western blotting (fig. 4C). LY294002 på 10 og 50 uM var i stand til at reducere p473-Akt (fig. 4C). Effekten af ​​LY294002 på ROS induceret af celle løsrivelse blev overvåget ved DCFH

2-DA, HPF og Amplex rød. Tilsyneladende, PI3K-inhibitor var i stand til at øge cellulær oxidativ stress som vist ved den betydelige stigning i DCF fluorescenssignal. Endvidere er den specifikke ROS, nemlig hydroxylradikal og hydrogenperoxid, fandtes at øges betydeligt i afhængighed af behandling af PI3K inhibitor i H460 celler (Fig. 4D).

Interessant behandling af LY294002 på 10 og 50 uM kunne ændre til virkningen af ​​KAV-1 til undertrykkelse ROS reduktion i Hcav-1-celler. Figur 4E viser, at ROS signal i Hcav-1 celler behandlet med LY294002 bemærkelsesværdigt blev forøget, sammenlignet med ikke-behandlede Hcav-1-celler. I modsætning hertil blev ROS niveau i shCav-1-celler næppe påvirket af behandlingen af ​​LY294002. Tilsammen disse resultater antydede, at Cav-1 regulerer ROS dannelse efter celle løsrivelse ved at opretholde aktiveringen af ​​PI3K /Akt pathway.

Diskussion

Indtil videre en række kræftrelaterede proteiner har blevet identificeret og anvendt til specifikke applikationer, herunder biomarkører for tidlig påvisning, prognose, og molekylære mål for anti-cancer design [18]. Ifølge den almindeligt accepterede hypotese, at ikke alle primære tumorer kan klæbe på endotele overflader, men visse cancerceller besidder en medfødt eller adaptiv evne er i stand til at klæbe på overfladen af ​​vaskulære endotelceller og til at danne metastaser [19]. Mange regulerende proteiner blev identificeret som tumorsuppressor eller tumorpromotoren proteiner; Men i tilfælde af KAV-1, blev rapporteret begge funktioner. KAV-1 blev først beskrevet som et tumorsuppressorprotein siden nedregulering af KAV-1 blev fundet under celletransformation [7]. I modsætning hertil blev Cav-1 vist sig at forstærke kræft progression og stigende beviser har tilkendegivet sin rolle som en kræft-promotor [20]. KAV-1 viste sig at fungere som en vigtig mediator for flere pro-overlevelse signalveje [21] – [23]. Derudover blev Cav-1-ekspression er vist at stige i flere typer af humane cancere, herunder lunge-, bryst-, prostata- og bugspytkirtel kræft, og dette opregulering blev forbundet med en høj grad af metastase [20], [24] – [28]. Selvom Cav-1 vist sig at forstærke lungekræft metastase ved at øge anoikis modstand [9] og invasion og migration [11] Den foreliggende undersøgelse forudsat den hæmmende effekt af Cav-1 på kræft-endotel vedhæftning, der ikke er påvist. <