Abstrakte
kemoresistens i cancer terapi er en ugunstig prognostisk faktor i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Elevation af intracellulært calcium i multiresistent (MDR) underlinjer fører til sensibilisering af MDR underlinjer til celledød. Vi viste, at en svampeinfektion protein fra
Ganoderma microsporum
, GMI, hæver det intracellulære calcium og reducerer væksten af MDR sublinie via autophagy og apoptose, uanset p-glycoprotein (P-gp) overekspression, hos mus xenograft tumorer. Derudover undersøgte vi roller autophagy i død MDR A549 lungekræft underlinjer af GMI, thapsigargin (TG) og tunicamycin (TM)
in vitro
. Cytotoksicitet af TG blev inhiberet af overudtrykt P-gp. Imidlertid TM-induceret død MDR underlinjer var uafhængig af P-gp-niveau. Kombinationer af TG og TM med enten docetaxel eller vincristin viste ingen yderligere cytotoksiske virkninger på MDR underlinjer. TG- og TM-medieret apoptose af MDR underlinjer blev demonstreret på Annexin-V-assay og Western blot og undertrykt af pan-caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK). Behandling af MDR underlinjer med TG og TM også augmented autophagy med ophobning af LC3-II proteiner, nedbrydning af P62 og dannelse af sure vesikulær organeller (AVOS). Hæmning af ATG5 af shRNA lyddæmpning væsentligt reduceret autofagi og celledød, men ikke apoptose efter TG eller TM behandling. GMI behandling inhiberede phosphorylering af Akt /S473 og p70S6K /T389. Interessant nok blev phosphoryleringen af ERK ikke forbundet med GMI-induceret autofagi. Vi konkluderer, at autofagi spiller en pro-død rolle i erhvervet MDR og opregulering af autophagy af GMI via Akt /mTOR hæmning giver en potentiel strategi for at overvinde MDR i behandlingen af lungekræft
Henvisning:. Chiu LY, Hu ME, Yang TY, Hsin IL, Ko JL, Tsai KJ, et al. (2015) Immunmodulatorisk Protein fra
Ganoderma microsporum
inducerer Pro-Død Autophagy gennem Akt-mTOR-p70S6K Pathway Hæmning i multiresistent Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (5): e0125774. doi: 10,1371 /journal.pone.0125774
Academic Redaktør: Vladimir Trajkovic, School of Medicine, University of Beograd, Serbien
Modtaget: 18 juni 2014 Accepteret: 26 marts 2015; Udgivet: 6. maj 2015
Copyright: © 2015 Chiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Rådet, Taiwan (NSC-100-2320-B-040-005) og Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (MOST-103-2320-B-040-015). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Lungekræft er den mest almindelige malignitet blandt mænd og kvinder. Selvom kemoterapi er den foreslåede behandling for avanceret ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), de fleste patienter udvikler krydsresistens over for en mangfoldighed af kemoterapeutiske stoffer (blandingsmisbrug resistens, MDR) [1]. P-glycoprotein (P-gp), produktet af den humane
MDR-1
genet, er medlem af den store ATP-bindende kassette-familien af membranproteiner [2]. P-gp, hvis overudtrykt i cancerceller, kan pumpe anticancerlægemidler ud af cellerne. MDR er et kritisk problem i kemoterapi. Nye lægemidler og strategier er nødvendige for at overvinde MDR at opnå bedre prognoser. For at forbedre effektiviteten af kemoterapi, brug af kinesiske plantelægemidler som MDR vende midler [3], MDR modulatorer af ATP-bindende kassette transportører [4] og nanomedical løsninger til at omgå MDR er blevet drøftet indgående [5].
Både docetaxel (DOC) [6] og vincristin (VCR) [7] er tubulin bindemidler (TBA), der er blevet anvendt klinisk til forskellige cancer kemoterapi. Men de er stand til at inducere MDR. Vi brugte DOC og VCR som valg midler til behandling af A549 NSCLC celler. Under kontinuerlig eksponering blev flere DOC og VCR lægemiddelresistente underlinjer opnået for yderligere undersøgelser. I en tidligere undersøgelse, vi rapporterede, at når de kombineres med DOC eller VCR, tre L-type calciumkanalblokkere, verapamil (VER), nifedipin og diltiazem, omvendt MDR med forskellige effektiviteter i doku- og VCR-resistente underlinjer uanset ekspressionsniveauerne af effluxtransportører [8]. Derfor er det logisk at antage, at calciumkanalblokker aktivitet er forbundet med tilbageførsel af MDR evne. Akkumulerede data har indikeret, at TBA behandling fører til en afbrydelse af calcium homeostase [9]. Således kan lave intracellulært calcium pool tillade MDR-positive celler til at opretholde fri radikal-induceret skade i forbindelse med andre uidentificerede faktorer. Tilsammen ændring af intracellulært calcium niveau ([Ca
2 +]
cyt) i TBA-resistent lungekræft underlinjer kan modulere kemoresistens og ([Ca
2 +]
cyt) medierede veje er potentielle mål for at overvinde MDR.
endoplasmatiske reticulum (eR) er et intracellulært calcium opbevaring partition, der spiller en rolle i bevarelsen af cellulær calciumhomeostase [10]. Forstyrrelser i ER homeostase påvirker proteinfoldning at generere udfolde proteinet respons (UPR), også kaldet ER stress [11]. ER stress kan sikres ved farmakologiske midler, herunder thapsigargin (TG) [12] og tunicamycin (TM) [13]. Når celler behandles med TG, [Ca
2 +]
cyt stigninger [14] for at generere autofagi [15] og apoptose [16]. Behandling med TM fører til induktion af ER stress med øget [Ca
2 +]
cyt og er også forbundet med apoptose [17] og autofagi [15,16]. Tre ER stressfaktorer, TM, dithiothreitol (DTT) og proteasominhibitor MG132, er blevet testet i mus fibroblaster (MEF) og fundet at inducere autofagi ved negativt at regulere Akt /mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway [18]. Imidlertid er klare beviser for en mekanisme, hvormed autofagi regulerer celledød i MDR kræftformer stadig mangler.
Programmeret celledød er klassificeret som apoptose, nekrose eller autofagi [19,20]. Apoptotiske veje indbefatter dem, der er extrinsiske og dem, der er iboende. Hver vej konvergerer på aspartat-specifikke cysteinproteaser kaldet caspaser (initierende 8, 9, 10 og bøddel 3, 6, 7) [20]. Disse caspaser spalter og aktiverer nedstrøms apoptotiske proteiner for derved at regulere celledød. Apoptose er en stor effekt af anti-cancer stof behandling. Autophagy er også blevet omfattende undersøgt i cancerterapi. Autophagy kontrolleres af en gruppe af evolutionært konserverede autofagi gen-relaterede proteiner (ATG proteiner) i en proces, der omfatter: (i) induktion eller initiering, der korrelerer med dannelse af phagophore; (Ii) nukleation; (Iii) forlængelse, Atg12-Atg5 og LC3 /Atg8 kontrolleret kritiske trin i dannelse af autophagosomes; og (iv) modning og nedbrydning, hvor autophagosomes fuse med endosomer-lysosomer at danne autolysosomes med nedbrydning af luminale indhold [21]. Den passende autofagi der tilskynder tumorcelleoverlevelse har været diskuteret som en del af den pro-overlevelse rolle autophagy i etablerede tumorer [22,23]. Autophagy er blevet foreslået som et mål for at inducere celledød [24,25] og inhibering af autofagi har vist sig at forbedre resultaterne i cancerterapi [26]. Imidlertid kan vedvarende stress fremme omfattende autofagi, hvilket fører til celledød. Derfor har både autophagic hæmning [27] og induktion været overvejet i terapeutiske strategier [24] og er blevet anvendt på anti-cancer behandlinger. Hvorvidt autophagy spiller en pro-dødsfald eller pro-overlevelse rolle efter kemoterapi-induceret resistens er fortsat uklart. Foretages yderligere undersøgelser for at løse dette problem og for bedre at styre erhvervet kemoresistens.
Rekombinant svampe immunmodulerende protein, GMI, klonet fra
Ganoderma microsporum
og renset, har vist sig at udvise en hæmmende effekt på migration EGF-induceret og invasion [28]. Dette protein nedregulerer tumornekrosefaktor-alfa-induceret ekspression af matrixmetalloproteinase 9 via NF-kappaB pathway [29] og inducerer autophagy gennem en calcium-medieret signalvej i humane lungecancer A549-celler [30]. Oral administration af GMI er påvist signifikant at hæmme tumorvækst og inducere autofagi i nøgne mus med xenotransplanterede tumor i A549-celler [30]. Desuden har autophagosome akkumulering blevet vist at inducere autophagic celledød via Akt /mTOR pathway i en GMI-behandlet lungekræft celle model [31]. For yderligere at teste antitumor funktion af GMI i kemoresistens blev xenotransplanterede animalske tumorer af docetaxel-resistente A549 sublinie behandlet med GMI og analyseret. Vi yderligere kendetegnet roller apoptose og autofagi i MDR ved at sammenligne effekten af to klassiske ER stress-induktorer, TG og TM, med GMI i docetaxel- og vincristin valgt A549 lungecancer underlinjer.
I denne undersøgelse, vi demonstrerede effekten og begrænsninger autophagy på død MDR underlinjer med ER stressfaktorer, TG og TM, samt en ny stressfaktor, GMI, for bedre at forstå de roller apoptose og autophagy i anti-MDR kræftbehandling. GMI-induceret Akt /mTOR pathway hæmning i autofagi-associeret celledød foreslås som en metode til at omgå MDR.
Materialer og metoder
Narkotika og kemikalier
DOC blev opnået fra Aventis Pharmaceuticals Inc. (Bridgewater, NJ). VCR, VER, chloroquin og TM blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Z-VAD-FMK blev indkøbt fra Bachem (Torrance, CA). TG blev købt fra Tocris Bioscience (Bristol, Storbritannien) og U0126 blev købt fra Cell Signaling (Danvers, MA). GMI, fremstillet af Mycomagic Biotechnology Co., Ltd (Taipei, Taiwan), blev genereret og lindres fra
Ganoderma microsporum
[28].
Flow-03:00 assay
ca. 2 × 10
4 celler per brønd podedes på plader med 24 brønde. Efter 24 timers inkubation blev cellerne eksponeret for VER i frisk medium i 2 timer. Herefter blev cellerne udsat for DOC, videobåndoptager eller GMI. Ved slutningen af perioden eksponering blev cellerne trypsiniseret og inkuberet i 30 min i Hanks bufferet saltopløsning (HBSS) med 3 uM Flow-03:00 (Invitrogen). Efter farvning blev cellerne vasket med HBSS to gange, som er tilføjet i HBSS indeholdende 5% FBS, og analyseret ved flowcytometri.
cellelinier og cytotoksicitet assay (MTT assay)
Humant adenocarcinom A549-celler var opretholdt som tidligere beskrevet [8]. DOC og VCR resistente underlinjer blev etableret fra forældrenes celler på en trinvis måde ved udsættelse for stigende koncentrationer af DOC eller VCR. Kort fortalt, for DOC underlinie, A549-celler i lavt cellulær densitet podedes på 10 cm petriskål og behandlet med 0,5 nM DOC indtil de overlevende celler voksede til et indlysende koloni. Den valgte koloni blev amplificeret i nærværelse af 0,5 nM DOC indtil sammenflydning før lægemidlet dosis blev øget i multipla af to for den næste runde af selektion. DOC resistente sublinie holdt ved 16 nM DOC blev betegnet A549 /D16. En lignende betegnelse, A549 /V16, blev givet til en videobåndoptager stabilt resistent sublinje. Cellerne blev eksponeret for forskellige koncentrationer af DOC, VCR eller GMI i frisk medium i 48 timer. Drug følsomheder til DOC, video og GMI blev bestemt på MTT kolorimetrisk assay. De detaljerede trin for MTT-assay er tidligere blevet beskrevet [8]. Middelværdier blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg.
Western blot-analyse
De relevante procedurer er beskrevet i en tidligere rapport [8]. Proteiner blev omsat med et af følgende: anti-LC3A (# 4599), anti-LC3B (# 3868), anti-PARP (# 5625), anti-GADD153 (# 2895), anti-GRP78 (# 3177), anti -t-Akt (# 9272), anti-p-Akt Ser473 (# 9271), anti-p-ERK (# 4370), anti-p-p70S6K Thr389 (# 9234) købt fra Cell Signaling (Danvers, MA), anti-P62 (GTX100685) opnået fra GeneTex (Irvine, CA) eller monoklonalt anti-β-actin (Sigma, AC-40). Immunhistokemi (IHC) blev udført med polyklonalt anti P-gp, efterfulgt af anti-gede-IgG (Santa Cruz Biotechnology) konjugeret til peberrodsperoxidase. Hematoxylin blev anvendt til kontrastfarvning.
Annexin V assay
Celler blev trypsiniseret og inkuberet i 30 minutter i bindingsbuffer med propidiumiodid (PI) og Annexin V (FITC Annexin V Apoptose Detection Kit 1, BD Biosciences, San Jose, CA), efterfulgt af analyse med flowcytometri.
Måling af mitochondriemembranpotential af JC-1 assay
Vi bruges JC-1 (5 ‘, 6,6 ‘-tetrachloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid) og en mitokondrie membranpotentiale disrupter, CCCP (carbonyl cyanid 3-chlorphenylhydrazon), til undersøgelse af mitokondrielle membranpotentiale (JC-1; Molecular Probes, Eugene, ELLER). Polariserede mitokondrier fremtræder som røde og depolariserede mitochondrier som grøn. Apoptose blev indikeret ved en stigning i grøn /rød fluorescens intensitetsforhold. For hver prøve celler (5 x 10
5 celler /ml) blev suspenderet i 1 ml PBS-buffer og JC-1 (slutkoncentration, 2,5 ug /ml) blev sat til prøven, der blev inkuberet i 10 min ved 37 ° C. De farvede celler blev derefter centrifugeret ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernedes forsigtigt. Pelleten blev derefter vasket med 1-2 ml PBS. Cellerne blev analyseret straks med flowcytometer (BD FACSCalibur).
Detection og kvantificering af sure vesikulær organeller (AVOS)
De detaljerede trin i AVO-analyse er tidligere blevet beskrevet [30]. Kort fortalt, efter behandling blev cellerne vasket med HBSS to gange, efterfulgt af farvning med 1 g /ml acridinorange (Sigma, A 6014) og fortynding i HBSS indeholdende 5% FBS i 15 min. Efter farvning blev cellerne vasket med HBSS og suspenderet i HBSS indeholdende 5% FBS. Cellerne blev observeret under et rødt filter fluorescensmikroskop. For at kvantificere AVO dannelse, blev acridinorange farvede celler høstet og vasket to gange med HBSS, resuspenderet i HBSS indeholdende 5% FBS og analyseret med flowcytometri og CellQuest software.
ATG5 silencing af shRNA udtrykker lentivirus
Lentiviral infektion af A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer blev udført for at stabilt integrere og udtrykke kort hårnål RNA (shRNA) rettet mod ATG5 mRNA sekvenser. De detaljerede trin lentivirus produktion er tidligere blevet beskrevet [30].
Animal model af xenotransplantattumorer
For
in vivo
tumorvækst assay, 4 uger gammel mand immunsvækkede mus (NOD.CB17-Prkdcscid /IcrCrlBltw) blev købt fra BioLASCO Taiwan Co, Ltd (Taipei, Taiwan). Eksperimentelle procedurer og håndtering blev gennemført i overensstemmelse med internationale retningslinjer til laboratorie dyreforsøg. Den aktuelle undersøgelse blev godkendt af Chung Shan Medical University Animal Care udvalg (Permit nummer: 1238) og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. At etablere A549 tumorxenoplantater blev mus injiceret subkutant med 5 x 10
6 A549 /D16 celler (100 pi) plus 100 pi Matrigel (BD Biosciences, 354.234). Seks dyr blev derefter tilfældigt opdelt i to grupper bestående af tre dyr hver. Syv dage efter celleimplantation blev mus i PBS-gruppen behandlet med 100 pi PBS ved tvangsfodring en gang dagligt og tjente som kontroller. GMI gruppe blev administreret GMI (160 ug pr mus fortyndet i 100 pi PBS) ved gavage én gang dagligt. Tumorstørrelser blev målt hver 3. dag begyndende på den 16. dag efter celleinjektion og tumorvolumen blev beregnet ved formlen: 0,5 x større diameter (mm) x lille diameter
2 (mm). På grund af tumorstørrelse variabilitet og lille størrelse af grupper blev en ikke-parametrisk Mann-Whitney U test anvendes med p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Efter dyrene blev aflivet, blev tumorvægte målt på mikrovægt og tumorlysater (10-50 ug) blev analyseret på Western blots ved anvendelse af vævsprotein Extraction Buffer (FIVEphoton Biochemicals, San Diego, CA) til fremstilling protein.
Statistisk analyse
Alle værdier er vist som middelværdi ± SD. Data blev sammenlignet mellem grupper ved hjælp af t-test og * p. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Resultater
Lav intracellulære calcium niveauer ([Ca
2 +]
cyt) af kemoresistent A549-celler opreguleres ved kombination TBA og verapamil behandling eller GMI
vi har tidligere vist, at MDR af A549 /D16 sublinie formidles af ABC transportører (typisk MDR) og MDR af A549 /V16 sublinie medieres af ikke-ABC-transportørprotein-associerede faktorer (atypisk MDR) [8]. P-gp opreguleres i A549 /D16 sublinie og nedreguleret i A549 /V16 delområde. Begge underlinjer er krydsresistente over for DOC og VCR. Vores hypotese at mekanismen af L-type calciumkanalblokkere vende TBA følsomhed lægemiddelresistente celler er associeret med ændringen af intracellulært calcium homeostase. For yderligere at bestemme de intracellulære calcium ([Ca
2 +]
cyt) af forældrenes kræftceller og multiresistente underlinjer, Fluo-03:00 tjente som den fluorescerende indikator for intracellulær calcium på flowcytometri. Desuden ændring af [Ca
2 +]
cyt efter kombineret VER og TBA behandling blev bestemt. Resultaterne viste, at [Ca
2 +]
cyt af multiresistent, P-gp overudtrykker, A549 /D16 sublinie (Fig 1A) holdes som påvist ved et lavere fluorescens niveau end parentale A549-celler. Interessant nok i kemoterapi og P-gp nedreguleret A549 /V16 delområde lavere [Ca
2 +]
cyt blev også opretholdt (Fig 1B). Dataene viste, at [Ca
2 +]
cyt i kemoresistent underlinjer er lavere end i parentale A549-celler. Når A549 /D16 (Fig 1C) og A549 /V16 (Fig 1D) celler blev forbehandlet med VER efterfulgt af TBA, niveauet af detekteret fluorescens signifikant øget, hvilket indebærer, at [Ca
2 +]
cyt af kemoresistent underlinjer er forhøjet når VER re-sensibiliserende kemoresistent celler udsættes for TBA cytotoksicitet. Opregulering af [Ca
2 +]
CYT af kombineret VER og TBA behandlinger var uafhængig af niveauet af P-gp udtryk. For at teste virkningen af GMI på [Ca
2 +]
cyt blev begge underlinjer behandlet med GMI (1,2 uM) i 24 timer eller 48 timer efterfulgt af analyse på Fluo-03:00 assay. Fluorescenssignalet i GMI-behandlede A549 /D16 sublinie forøget efter 24 timer (Fig 1E), hvilket yderligere forøget efter 48 timers GMI behandling (fig 1G) Lignende resultater blev observeret i A549 /V16 sublinie behandlet med GMI i 24 timer (Fig 1F ) og 48 timer (fig 1H). Dataene støttede vores hypotese, at forhøjede [Ca
2 +]
cyt spiller en væsentlig rolle i kemoterapi lungekræft cellesensibilisering til døden. Desuden GMI er i stand til at fremkalde [Ca
2 +]
cyt elevation i MDR underlinjer.
For at undersøge [Ca
2 +]
cyt, det fluorescerende farvestof Fluo -3AM blev inkuberet med (A) parental A549 og A549 /D16 celler, (B) parental A549 og A549 /V16-celler i 30 minutter. Tynd linje repræsenterer fluorescens baggrund uden Fluo-03:00 inkubation. Tykke linie betegner fluorescens målt ved flowcytometri. Til måling VER modulering af [Ca
2 +]
cyt, (C) A549 /D16 celler og (D) A549 /V16-celler blev forbehandlet med VER (10 uM) i 2 timer efterfulgt af DOC ( 16 nM) og VCR (16 nM) behandling i 48 t. Den [Ca
2 +]
cyt af A549 /D16 celler behandlet med GMI (1,2 uM) i 24 timer (E) eller 48 timer (G) blev opreguleret. Den [Ca
2 +]
cyt af A549 /V16 celler behandlet med GMI (1,2 uM) i 24 timer (F) eller 48 h (H) blev også opreguleret. Efter fluo-03:00 inkubation blev celler visualiseret ved anvendelse af flowcytometri. Celleantallet count (Count) er angivet ved Y-aksen og Fluo-03:00 intensitet (FL1-H) er angivet med X-aksen.
GMI inhiberer P-gp overudtrykker tumorvækst i mus xenograft model
Tidligere er det blevet påvist, at efter forbehandling med calciumchelator BAPTA-AM, er GMI-induceret celledød blokeres. Tilsyneladende GMI inducerer lungecancer celledød gennem en calcium-afhængig signaleringsvej [30]. Derfor testede vi følsomheden af kemoresistent cancerceller til GMI behandling på MTT-assayet (fig 2A). Resultaterne viste, at både A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer svare GMI (0,3 til 1,2 uM) på en dosis-afhængig måde. GMI følsomheder af A549, A549 /D16 og A549 /V16 celler med beregnet IC
50, er anført i tabel 1. Endvidere blev mus inokuleret subkutant med A549 /D16 sublinie udtrykker høje P-gp. Tumor byrder i mus behandlet med PBS eller GMI er vist i fig 2B. Sammenlignet med gruppen af mus, som fik PBS, væksten af tumorer i GMI-gruppen var signifikant inhiberet. Selvom beregnet tumorvolumen var sammenlignelig med P1 og P3, signifikant nekrose af P2 tumor resulterede i den mindste størrelse af det hentede P2 tumoren. At sikre spredning af implanterede cancerceller, testede vi GMI effektivt, når tumorerne nåede et volumen på 200 mm
3 på den 40. dag efter implantation (figur 2C). Den anti-tumor effekt af GMI var ikke begrænset i store tumorer.
(A) Analyse af virkningerne af GMI (0,3, 0,6, 0,9 og 1,2 uM) på cellernes levedygtighed i A549, A549 /D16 og A549 /V16 celler på MTT-assay. (B) Syv dage efter A549 /D16 celleimplantation blev mus i PBS gruppen behandlet med PBS eller GMI ved tvangsfodring en gang dagligt. Tumorstørrelserne PBS gruppe og GMI gruppe blev målt efter mus blev aflivet på dag 64. (C) Mus blev injiceret subkutant til A549 /D16 celleimplantation. Når tumorvolumenet nåede 200 mm
3 på dag 40, mus i PBS-gruppen blev behandlet med PBS eller GMI ved tvangsfodring en gang dagligt. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SD. en ikke-parametrisk Mann-Whitney U test blev anvendt med p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. (E) Niveauerne af c-PARP, LC3A og LC3B i seks xenotransplantattumorer blev bestemt ved Western blotting med statistisk analyse af LC3A-II og LC3B-II-udtryk. (D) Repræsentative Immunofarvning resultaterne af P-gp i lungetumorer af A549, A549 /D16 behandlet med PBS (P1) og A549 /D16 behandles med GMI (G1) blev opnået ved IHC.
Apoptose-medieret spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP-1) ved Capase-3 frembragte en 89 kDa C-terminale fragment (c-PARP, som indeholder det katalytiske domæne), der tjente som det molekylære markør på immunblots. At belyse ER stress-reguleret autophagy blev mikrotubulus-associerede protein let kæde (LC3) protein analyseres. LC3 har tre isoformer (LC3A, LC3B, og LC3C) [32], hvoraf LC3A og LC3B blev undersøgt. GMI-behandlede tumorer udtrykte høje niveauer af c-PARP, LC3A-II og LC3B-II-proteiner, hvilket indikerer højere autophagic og apoptotiske aktiviteter end i PBS-behandlet kontrol tumorer (Fig 2D). For at demonstrere høje P-gp-ekspression i de xenotransplantattumorer blev IHC af P-gp anvendes på de repræsentative tumorer i P1, G1 og parentale A549-celler (fig 2E). P1 og G1 tumorer udviste kraftig P-gp-ekspression i modsætning til tumorer i A549-celler. Dataene fra disse mus xenograft tumor forsøg viste, at GMI hæmmer væksten af P-gp overudtrykker kemoresistent celler og inducerer apoptose og autofagi.
Apoptose og autofagi differentielt forstærket af GMI, TG og TM i MDR lungekræft underlinjer
for at afgøre, om virkningerne af GMI, TG og TM på apoptose og autofagi er dosisafhængig, vi behandlede MDR underlinjer med forskellige koncentrationer af GMI, TG og TM efterfulgt af karakterisering af de molekylære markører på immunblots. En af komponenterne i ER stress-medieret apoptose pathway er C /EBP homologt protein (CHOP), også kendt som vækst arrest- og DNA-skader-inducerbart gen 153 (GADD153). En anden ER stress-medieret protein er GRP78, også kendt som Bip [11]. ER stressrelaterede GADD153 og GRP78 proteiner blev påvist i A549 /D16 (fig 3A) og A549 /V16 (Fig 3B) underlinjer efter GMI behandling. Den apoptose-medieret protein c-PARP blev opreguleret efter GMI behandling som var de autophagic markører LC3A-II og LC3B-II-proteiner.
(A) A549 /D16-celler (2 × 10
5 celler) blev behandlet med forskellige koncentrationer af GMI i 48 timer. Niveauer af GADD153, GRP78, c-PARP, LC3A-I, LC3B-I, LC3A-II, LC3B-II og P62 blev detekteret ved Western blotting. Tilsvarende forhold blev anvendt til (B) A549 /V16 celler behandlet med GMI. (C) Western blot-analyse af protein-niveauer i A549 /D16 sublinie og (D) A549 /V16 sublinie induceret af TG. (E) A549 /D16 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af TM i 48 timer. Tilsvarende forhold blev anvendt til (F) A549 /V16 celler. (G og H) Begge underlinjer blev behandlet med angivet GMI koncentrationen med fraværende eller til stede for chloroquin. Ekspressionen af β-actin tjente som en loading kontrol.
GADD153 protein blev ikke påvist i A549 /D16 sublinie (fig 3C), men blev induceret ved TG i A549 /V16 sublinie (Fig 3D). Proteinerne i GRP78 kunne svagt detekteres med længere eksponeringstid (Fig 3C). De blev fundet i signifikant højere mængder i A549 /V16 delområde (Fig 3D) på immunoblot. Der var en dosisafhængig induktion af GADD153 af TM i A549 /D16 (fig 3E) og A549 /V16 (fig 3F) underlinjer. Niveauerne af c-PARP proteiner koordineret godt med GADD153 protein niveauer i begge underlinjer (fig 3D, 3E, og 3F). Vores data viste også, at LC3A-II udtrykkes i A549 /D16 sublinie og stiger efter 200 nM TG behandling, mens niveauet for LC3B-II ikke stiger, selv under høj dosis (200 nM) TG behandling (Fig 3C) og en længere eksponeringstid på immunoblot. Interessant, under TBA udvælgelse, både A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer viste lave niveauer af LC3B-II-ekspression (fig 3A, 3C, 3E, 3B, 3D og 3F, 0 nM). TG og TM forbedret akkumulering af LC3-II proteiner på en dosisafhængig måde i A549 /V16 MDR sublinje, men ikke i A549 /D16 underlinie, som udtrykte høje P-gp efter TG behandling (fig 3C). Interessant, når P62, den autofagi flux indikator, nedbrydes i autolysosomes [33], blev monitoreret i MDR underlinjer følgende GMI behandling, dets ekspression blev ikke reduceret, når LC3-II forøget (fig 3A og 3B). I modsætning hertil protein niveauer af P62 formindsket i TG (fig 3D) og TM-behandlede underlinjer (fig 3E og 3F). Dannelsen af LC3-II og betydelig nedbrydning af P62 angiver initiering og afslutning af autophagic flux efter TG og TM behandling i MDR underlinjer (fig 3D, 3E og 3F). I vores tidligere rapport, vi viste, at GMI-induceret autophagosome ophobning resulterer i autophagic død i A549 celler [31]. Dette kan forklare den stabilt niveau af P62 i GMI-behandlede underlinjer (Fig 3A og 3B). Vi yderligere testet, om der kan observeres GMI-induceret autophagic flux med en lysosomal inhibitor, chloroquin som hæmmede den endogene LC3-II omsætning [24]. Sammenlignet med GMI behandling, signifikant akkumulering af LC3A-II-proteiner i underlinjer at samtidig behandling med chloroquin blev påvist (Fig 3G og 3H). Disse data viste, at GMI inducerede autophagic flux i MDR cancerceller. Ud fra disse resultater augmented ER stress fremmer udtrykkene for autofagi og apoptose reguleret proteiner i MDR underlinjer. Dataene viste, at grader af apoptose og autofagi er afhængige af GMI, TG og TM-koncentrationer. GMI inducerer ER stress, apoptose og autophagy i MDR underlinjer ligner TG og TM aktiviteter, men med forskellig effekt.
TM og TG fremkalde død MDR lungekræft underlinjer men TG effekt er begrænset af P-gp overekspression
Vi undersøgte yderligere regulering af væksten af både MDR underlinjer ved TG og TM på MTT assay. For forældrenes A549 celler, der var ca. 32% celleoverlevelse efter behandling med 200 nM TG. Cytotoksiciteten blev forstærket, når A549-celler blev cotreated med TG og DOC (16 nM), hvilket resulterer i 19% overlevelse celle ved 200 nM TG. Den levedygtighed A549 /D16 sublinie blev ikke påvirket af TG eller TG samtidig behandling med DOC (Fig 4A). I modsætning hertil, når de A549 /V16-celler blev behandlet med TG (200 nM), 41% af cellerne overlevede (Fig 4B). Kombination af VCR (16 nM) og TG havde ingen yderligere cytotoksisk virkning på A549 /V16 sublinie. Det er blevet rapporteret, at TG er et substrat for P-gp [29]. Derfor har vi anvendt P-gp-hæmmer, VER, at afgøre, om cytotoksicitet TG kan inddrives i A549 /D16 delområde. Resultaterne viste, at når 4 pM VER blev tilsat, blev levedygtigheden af A549 /D16 sublinie reduceret til 42% ved 200 nM TG (Fig 4E).
(A) Parental A549 og A549 /D16-celler (2 × 10
4 celler /brønd) blev behandlet med forskellige koncentrationer af TG med DOC (16 nM) eller uden DOC i 48 timer for lægemiddelfølsomhed målinger. Tilsvarende forhold blev anvendt til (B) A549 og A549 /V16 celler med VCR (16 nM). (C) Forældrekontrol A549 og A549 /D16 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af TM med DOC eller uden DOC i 48 timer for narkotika følsomhed målinger. Tilsvarende forhold blev anvendt til (D) A549 og A549 /V16 celler. (E) A549 /D16 celler blev forbehandlet med VER (0, 0,5, 1, 2 og 4 uM) i 2 timer efterfulgt af forskellige koncentrationer af TG i 48 timer. Cellelevedygtighed blev analyseret på MTT-assayet.
parentale A549-celler var også følsomme over TM cytotoksicitet på en dosis-afhængig måde. Når A549-celler blev behandlet med TM (2,5 uM), ca. 33% overlevede. Når DOC blev kombineret med TM, 18% af de parentale A549 celler forblev. Den A549 /D16 delområde også reageret på TM cytotoksicitet, men med lavere følsomhed end forældrenes celler. DOC samtidig behandling med TM viste ingen yderligere cytotoksicitet i A549 /D16 celler (Fig 4C). Den A549 /V16 sublinie var mindre følsom over for TM end A549 /D16 sublinie med 70% overlevende celler ved 2,5 uM TM. Samtidig behandling med VCR haft nogen større effekt på levedygtighed A549 /V16-celler (Fig 4D). Disse data viste, at forældrenes A549 celler sensibiliserede til TG /TM med yderligere cytotoksiciteter når DOC eller VCR er kombineret med TG eller TM. Imidlertid A549 /D16 og A549 /V16 underlinjer er mindre følsomme over for TM end parentale celler. Det stof følsomheder af A549, A549 /D16 og A549 /V16 celler til TG og TM med beregnet IC
50 er anført i tabel 1. Fra analyse af data, er det kun A549 /V16 celler var mere følsomme over for TG end forældrenes A549-celler (fig 4b). MDR underlinjer var ufølsomme for TG (Fig 4A) og mindre følsom over for TM sammenlignet med parentale A549-celler (fig 4C og 4D).
Kvantificering af TG- og TM-induceret apoptose og autofagi
Ud over at undersøge protein-markører for apoptose, anvendte vi JC-1 og Annexin-V-assay til kvantificering af apoptose i TG og TM-behandlede underlinjer.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.