PLoS ONE: reduceret ekspression af fumarat hydratase i Clear celle nyrekræft medierer HIF-2α Ophobning og Fremmer Migration og Invasion

abstrakt

kimcellelinje mutationer af

FH

, det gen, der koder for det tricarboxylsyre TCA (TCA) cyklussen enzym fumarat hydratase, er forbundet med en arvelig form for kræft benævnt Hereditært Leiomyomatosis og renalcellecarcinom (HLRCC). Personer med HLRCC er disponerede for udvikling af meget malign og dødbringende nyrecellecancer (RCC). Mekanismerne i tumorigenese foreslåede har i vid udstrækning fokuseret på de biokemiske konsekvenser af tab af FH enzymatisk aktivitet. Mens tab af tumorsuppressorgen

von Hippel Lindau Hotel (

VHL

) menes at være en initierende begivenhed for størstedelen af ​​RCCS, en rolle for

FH

i sporadisk renal cancer er ikke blevet undersøgt. Her rapporterer vi, at FH mRNA og proteinekspression er reduceret i clear cell renal cancer, den mest almindelige histologiske variant af nyrekræft. Endvidere viser vi, at reduceret

FH

fører til akkumulering af hypoxi inducerbar factor-2α (HIF-2α), en transskriptionsfaktor kendt for at fremme nyre. Endelig viser vi, at overekspression af FH i renale cancerceller hæmmer den cellulære migration og invasion. Disse data giver nye indsigter i tumor suppressor funktioner FH i sporadisk nyrekræft

Henvisning:. Sudarshan S, Shanmugasundaram K, Naylor SL, Lin S, Livi CB, O’Neill CF, et al. (2011) reduceret ekspression af fumarat hydratase i Clear celle nyrekræft medierer HIF-2α Ophobning og Fremmer migration og invasion. PLoS ONE 6 (6): e21037. doi: 10,1371 /journal.pone.0021037

Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Januar 18, 2011; Accepteret: 17. maj 2011; Udgivet 14. juni, 2011

Copyright: © 2011 Sudarshan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Cancer Therapy and Research center (ctrc) ved University of Texas Health Science center (National Institutes of Health P30 CA054174-17). SS er støttet af NIH K08 CA138774, Voelcker Fund Young Investigator Award, AUA Foundation /Astellas Rising Star Award, og en særlig gave fra Mr. Charles Butt og medarbejderne i HEB. SLN er støttet af ctrc og NIH U01 CA86402. LZS er støttet af NIH R01 CA079683. KB er støttet af Veterans Administration Karriereudvikling Award (CDA-2) og NIH R01 NCI CA131272. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i 2010 vil mere end 57.000 mænd og kvinder blive diagnosticeret med renalcellecarcinom (RCC) og 13.000 personer vil dø af denne sygdom [1]. Selvom overlevelse for patienter med lokaliseret sygdom er høj, patienter med fremskreden sygdom står over for en dårlig prognose trods nyligt indførte målrettede agenter. Selvom tab af

von Hippel Lindau

(

VHL

) tumorsuppressorgen menes at være en initierende begivenhed for størstedelen af ​​RCCS [2], er lidt kendt om efterfølgende genetiske begivenheder og deres respektive indvirkning på tumorigenese. Belysning af disse veje vil identificere nye terapeutiske mål samt lette biomarkør udvikling, der kan have både diagnostisk og prognostisk betydning.

kønscellelinie mutationer af

FH

er forbundet med en arvelig form for nyrekræft, der er nævnt til som Arvelig Leiomyomatosis og renalcellecarcinom (HLRCC) [3], [4].

FH

koder tricarboxylsyrecyklen enzym fumarat hydratase (også omtalt som fumarase), som katalyserer hydratiseringen af ​​fumarat til dannelse malat. Personer med HLRCC er disponerede for udvikling af leiomyomas i huden og livmoderen udover stærkt malign og dødbringende RCC. Mekanismerne i tumorigenese foreslåede har i vid udstrækning fokuseret på de biokemiske konsekvenser af tab af FH enzymatisk aktivitet. Det er blevet foreslået, at tabet af FH fører til fumarat ophobning og fremmer en pseudohypoxic tilstand, hvor hypoxi respons veje er afvigende aktiveret trods normoxiske [5] betingelser. Fumarat er blevet vist at inhibere prolin hydroxylering af hypoxi inducerbare faktorer HIF-1α og HIF-2α som katalyseres af en familie af enzymer benævnt HIF prolyl hydroxylaser (PHD’ere) [5]. I deres unhydroxylated form HIFαs undgå anerkendelse fra E3 ubiquitinligase VHL (som er rettet mod disse proteiner for proteosomal nedbrydning) og er således stabiliseret [6], [7], [8], [9]. Under disse betingelser enten HIF-1α eller HIF-2α er i stand til at heterodimerisere med konstitutivt udtrykte protein HIF-1β, også omtalt som ARNT (for nylig revideret [10]). Denne heterokompleks er i stand til transkriptionelt at aktivere adskillige gener, herunder

VEGF

andre vækstfaktorer, som kan være pro-tumorigen når dysreguleret. Pseudohypoxia har også været impliceret i den mest almindelige variant af RCC, clear cell carcinoma (ccRCC), hvori tab af

VHL

er en almindelig genetisk begivenhed [11]. Som forventet er forhøjede niveauer af HIF-1α og /eller HIF-2α bemærket i clear cell renal cancere [12], [13]. Interessant, flere linjer af beviser tyder på, at HIF-2α i modsætning til HIF-1α, er afgørende for RCC dannelse og /eller progression [14], [15], [16].

Mens

VHL

tab er klart afgørende for HIF-2α stabilisering, alternative mekanismer, foruden forebyggelse af nedbrydning, kan spille en rolle i opretholdelsen af ​​HIF-2α i nyrekræft. Tidligere arbejde af Block

et al.

Etableret en rolle for reaktive ilt arter (ROS) genereret af NADPH oxidaser i at opretholde HIF-2α proteinekspression gennem en AKT-afhængig mRNA translationel mekanisme i VHL-mangelfulde celler [17] . Desuden mTOR signalering kompleks 2 (mTORC2), en kendt aktivator for AKT signalering, er blevet vist at fremme HIF-2α akkumulering i

VHL

null renale carcinomaceller [18]. For nylig behandling af RCC-celler med en dobbelt PI3K /mTOR inhibitor undertrykt ekspression af HIF-2α [19]. Disse data understøtter den opfattelse, at igangværende HIF-2α syntese er afgørende for bevarelse af denne onkogen transkriptionsfaktor i renale cancerceller.

FH

mutationer er primært knyttet til papillære type II nyrecancer , en histologisk variant, der tegner sig for mindre end 10% af alle nyre kræft [20].

FH

mutationer er ikke blevet identificeret i sporadisk klar celle nyrekræft. Imidlertid har en nylig rapport knyttet

FH

til udviklingen af ​​klare celle nyrekræft i en patient med en kimlinie mutation af

FH

[21]. Til dato, udtryk og funktion af

FH

i ccRCC har ikke undersøgt. Derfor undersøgte vi rolle FH i sporadisk klar celle nyrekræft.

Resultater

Reduceret udtryk for FH i klar celle renal karcinom

FH udtryk i ccRCC har endnu ikke blive udforsket. Derfor vi først undersøgte protein udtryk for FH i et panel af humane klar celle renale tumorer og patient-matchede normal renal parenkym. Immunoblotanalyse af væv lysater viste en markant reduktion af FH proteinniveauer i tumorerne sammenlignet med normalt tilstødende væv (figur 1A). For at bekræfte vores resultater, vi udførte immunhistokemisk farvning for FH om patienters matchede tumor /normal par. Disse resultater korrelerede med vores immunoblotting resultater i denne farvning for FH var mindre i tumorer i forhold til kontrol nyrevæv (figur 1B). Vi undersøgte næste FH proteinniveauer i et panel af etablerede ccRCC cellelinier (786-O, A498, RCC4, og ACHN). Alle dyrkede cellelinier demonstrerede reducerede FH protein niveauer i forhold til normal nyre (figur 1C). Vi undersøgte derefter mRNA ekspressionsniveauer af

FH

i tumorvæv sammenlignet med patient-matchet normal nyrevæv i prøver fra Cooperative humant væv Network (NCI). Kvantitativ real time RT-PCR demonstrerede reduceret

FH

mRNA-niveauer i tumorvæv sammenlignet med normalt væv (figur 2). Analyse af mRNA-niveauer viser, at over 70% af tumorprøverne demonstreret reduceret

FH

mRNA niveauer i forhold til normal matchet nyreparenkym. Desuden 15/32 patientprøver (47%) udviste større end dobbelt reduktion i

FH

mRNA-niveauer i tumorprøver forhold til normal kontrol. Generelt var de gennemsnitlige reduktion i

FH

mRNA niveauer var 2,9 gange. Denne forskel blev bestemt til at være statistisk signifikant. Disse resultater viser reduceret ekspression af

FH

på mRNA og protein niveauer i ccRCC.

A) Protein blev isoleret fra klare celle (CC) tumor prøver (T) ud over matchet normal renal parenchym (N). Proteiner blev immunblottet for FH proteinniveauer. GAPDH immunoblot indgår som en belastning kontrol. B) immunhistokemisk farvning for FH blev udført på patient-matchede tumor /normal par. Billeder blev opnået med et 40 x objektiv linse. C) FH protein niveauer i RCC linjer i forhold til normal nyre. Actin indgår som en belastning kontrol.

mRNA niveauer af

FH

blev bestemt i et separat sæt tumorprøver forhold til patient matchet normal renal parenkym med realtids RT-PCR ( p = 0,004). Ekspressionsniveauer blev normaliseret til 18 s rRNA niveauer forud for sammenlignende analyse.

FH modulerer HIF-2α niveauer

Høje niveauer af fumarat i FH-mangel RCC spille en rolle i stabiliseringen HIF -2α proteinekspression gennem hæmning af prolin hydroxylase aktivitet og derved forhindre VHL anerkendelse. Baseret på disse data, vi hypotese, at tab af FH bør ikke have indflydelse på HIF protein niveauer i

VHL

null cellelinjer. Vi fandt imidlertid, at siRNA-medieret knockdown af FH resulterede i en yderligere stigning af HIF-2α protein niveauer i to ccRCC linier, som er

VHL

null (786-O og A498) (figur 3A). Til støtte for disse resultater, forbigående overekspression af FLAG-mærket FH (FH-FLAG) reducerede HIF-2α niveauer 786-O-celler (figur 3B). Sammen Dette tyder på, at FH modulerer HIF-2α proteinekspression i fravær af VHL.

A)

VHL

null 786-O og A498 celler blev gennemskæres med siRNA til FH og scramble kontrol ( sinc). Otteogfyrre timer efter transfektion blev proteinlysater analyseret ved immunoblotting for de angivne proteiner. B) 786-O-celler blev transient transficeret med kontrolvektor (CV) og vektor indeholdende FLAG tagged FH. Otteogfyrre timer efter transfektion blev proteinlysater analyseret ved immunoblotting for de angivne proteiner. FLAG immunoblot indikerer vellykket ekspression af transgenet. C) (venstre) 786-O-celler blev stabilt transficeret med CV og FH-FLAG. Efter selektion i puromycin blev enkelt celle kloner høstet og screenet for FLAG udtryk. HIF-2a-niveauer blev målt i FH-FLAG udtrykkende kloner i forhold til CV transficerede celler. Densitometri af de bands der kvantitativt vises til højre. Mean relative værdier +/- standardafvigelse blev opnået med ImageJ software fra uafhængige forsøg.

For yderligere at belyse den mekanisme, hvormed FH regulere HIF-2α proteinekspression, vi skabt stabile cellelinjer overekspression FH-FLAG i VHL-deficient 786-O-celler. Vi identificerede 3 kloner der stabilt udtrykte FH-FLAG-konstruktion. Alle 3 kloner påvist reducerede HIF-2α niveauer sammenlignet med kontrol-vektor transficerede celler (figur 3C). Vi oprindeligt overvejede, om virkningerne på HIF-2α transkriptionelt blev formidlet, men vi ikke registrerer reduktioner i HIF-2α mRNA-niveauer med FH overekspression (data ikke vist).

FH tab aktiverer AKT signalering

De seneste rapporter har impliceret PI3K /AKT-signalering i at opretholde HIF-2α proteinekspression i

VHL

nul-celler gennem en translationel mekanisme [17], [18], [19], [22] _ENREF_17. Baseret på disse rapporter, vi undersøgte AKT signalering med FH modulation. Vi fandt, at siRNA-medieret knockdown af

FH

i både 786-O og A498 celler resulterer i forøget AKT phosphorylering på serin 473 af AKT (figur 4A). Tilsvarende overekspression af FH sænkede phospho-AKT-niveauer i 786-O-celler (figur 4B) angiver, at FH niveauer omvendt forhold med AKT signalering. Vi næste undersøgt virkningerne af PI3K inhibering på FH-afhængig HIF-2α proteinekspression. I overensstemmelse med vores tidligere fund, FH knockdown aktiveret AKT signalering og øget HIF-2α niveauer i forhold til scramble transfekterede celler (sinc) (figur 4C). Men samtidig behandling af transficerede celler med PI3K-inhibitoren LY-294002 blokerede forøgelsen af ​​HIF-2α forbundet med FH knockdown (figur 4C). Sammen Dette tyder på, at FH fastholder HIF-2α proteinekspression gennem mekanismer, der er afhængige af PI3K og AKT signalering.

A)

VHL

null 786-O og A498 celler blev transficeret med siRNA til FH og scramble kontrol (sinc). Otteogfyrre timer efter transfektion blev proteinlysater analyseret ved immunoblotting for total AKT og Ser473 phospho-AKT. B) 786-O-celler blev transient transficeret med kontrolvektor (CV) og vektor indeholdende FLAG tagged FH. Otteogfyrre timer efter transfektion blev proteinlysater analyseret ved immunoblotting for de angivne proteiner. C) 786-O-celler blev transficeret med det anførte siRNA. Fireogtyve timer efter transfektion blev medier cellerne udskiftet med medium indeholdende PI3K inhibitor LY-294002 (6,25 uM). Celler blev derefter høstet 24 timer senere og proteinlysater blev udsat for immunoblotanalyse for de angivne proteiner.

FH udtryk medierer celle migration og invasion

De biologiske konsekvenser af FH overekspression i RCC celler blev næste undersøgt.

FH

null tumorer er stærkt invasive og ofte metastatiske tumorer [20], og HIF-2α har tidligere været impliceret i denne cellulær proces [23]. Derfor undersøgte vi rolle FH i cellulær migration og invasion i ccRCC. Vi finder, at knockdown af HIF-2α med siRNA i 786-O RCC-celler formindskes cellulære motilitet som bestemt ved sårheling assay sammenlignet med scramble transficerede celler (figur 5A og 5B). Kvantificering af disse resultater er tilvejebragt i figur 5C. Mens næsten 80% af såret hul blev lukket i kontrolceller transficerede celler ved 12 timer, 50% af såret hul forblev i HIF-2α knockdown-celler. På baggrund af disse data, undersøgte vi sårheling i FH overekspression 786-O subkloner sammenlignet med kontrol vektor transfekterede celler. Begge FH overudtrykker kloner havde signifikant reduceret sårlukning sammenlignet med kontrol vektor transficerede celler, hvilket antyder, at tabet af FH bidrager til migration i RCC (figur 6A). I styrevektor transficerede celler, blev kampen såret bredde næsten helt lukket af 10 timer. I modsætning hertil FH overekspression celler lukkede sår hullet ved kun halvdelen af ​​10 timer til angivelse af nedsat cellulær migration blev et resultat af FH overekspression. Disse resultater er vist grafisk (figur 6B). For yderligere at underbygge disse data, undersøgte vi den cellulære migration udnytte et kammer assay med 10% kalvefosterserum som chemotractant. 786-O vektor kontrolceller var signifikant mere migrerende end FH overudtrykker kloner (figur 6C). Endelig overekspression af FH i RCC-celler reduceret deres invasive evne som bestemt ved matrigel invasion assay (figur 6D). Tilsammen viser disse data, at tabet af FH udtryk øger vandrende og invasive evne RCC celler.

786-O RCC celler blev transficeret med scramble kontrol siRNA (sinc) eller siRNA til HIF-2α. Western blotting-resultater af helcelleekstrakter er påvist i panel A. B) Sårheling assay blev udført i transficerede celler. Billeder blev serielt taget på det angivne tidspunkt efter “sår” induktion. Resultaterne vises grafisk i panel C. stjerner (*) angiver statistisk signifikans med p 0,05 i forhold til scramble kontrol transfekterede celler

A) sårheling assay billeder på de angivne tidspunkter.. B) Sår bredde afstand på angivne tidspunkter. C) Chamber cellemigrationsassay af de angivne kloner. Celler blev podet i serumfrit medium med 10% FBS anvendes som chemotractant. Migreret celletal af kloner på 48 timer fra første såning. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans med p 0,05 i forhold til kontrol vektor transficerede celler. D) Matrigel invasion assay med 10% FBS medier som chemotractant. Stjerner (*) angiver statistisk signifikans med p. 0,05 i forhold til at styre vektor transficerede celler

Diskussion

I denne rapport viser vi for første gang reduceret FH udtryk på mRNA og proteinniveauer i klar celle renal carcinoma, den mest almindelige histologiske variant, der tegner sig for hovedparten af ​​nyre kræft. Disse resultater er væsentlige som tidligere undersøgelser ikke identificere

FH

mutationer i RCC linjer samt primære RCC prøver [24]. De mekanismer, som mRNA niveauerne af

FH

reduceres er under undersøgelse. Hypermethylering kan være en mekanisme, hvorved

FH

udtryk undertrykkes. Dulaimi

et al.

Ikke identificere hypermethylering i en CpG ø i

FH

promotor i et panel af papillære RCCS [25]. Imidlertid har ingen undersøgelser til dato undersøgt

FH

methylering status i ccRCC. Mens hypermethylering er et middel til tumorsuppressorgen inaktivering, kan alternative mekanismer også forklare den reducerede ekspression af

FH

vi har identificeret. Seneste interesse har fokuseret på rollen som microRNA (miRNA) i genregulering hvor rapporter tyder på, at gener involveret i oxidative fosforylering kan være genstand for regulering af miRNA [26]. Det er klart, disse muligheder garanterer yderligere undersøgelse i betragtning af den biologiske betydning af vores resultater.

Vi har tidligere vist, at genindførelse af vildtype

FH

ind i en

FH

mangelfuld tumorcellelinie resulterer i en markant reduktion i nukleare HIF-1α niveauer [27]. Desuden har siRNA-medieret knockdown af FH vist sig at øge HIF-1α niveauer i A549-lunge- carcinomceller, som udtrykker VHL [5]. Resultaterne fra disse studier, såvel som andre biokemiske undersøgelser, tyder på, at det princip mekanisme, hvormed dette sker, er gennem protein stabilisering HIF via hæmning af prolyl hydroxylase-aktivitet som følge af FH tab. Disse resultater vil derfor antage, at effekten af ​​FH på HIF kun ville være indlysende i overværelse af VHL. Men vores resultater er ganske roman i, at de viser, at FH kan modulere HIF-2α uafhængigt af VHL. VHL-uafhængige veje, der medierer HIF nedbrydning er blevet rapporteret. Især har Hsp90 og RACK1 tidligere vist sig at modulere HIF-1α nedbrydning [28]. Derfor er det muligt, at en lignende mekanisme medierer HIF-2α nedbrydning samt. Trods stabilisering via hæmning af protein nedbrydning, er der voksende tegn på, at alternative veje spiller en rolle i bevarelsen HIF-2α protein niveauer i fravær af VHL. Block

et al.

Påvist, at forhøjede cellulære reaktive oxygenarter, medieret af p22-phOx baserede NOx oxidaser, vedligeholde HIF-2α proteinniveauer i RCC-celler gennem en AKT /4E-BP1 mRNA translationel afhængig mekanisme [17] , [22]. Tilsvarende er phosphorylering af AKT og 4E-BP1 forstærket i human RCC væv i forhold til normale parenchymvæv [22]. For nylig Toschi

et al.

Fandt, at AKT aktivering via signalering gennem mTOR signalering kompleks 2 (mTORC2), var forpligtet til at opretholde HIF-2α i VHL nul-celler [18]. AKT aktivering er en almindelig signalering node i kræft og alternative mekanismer kan føre til AKT aktivering i RCC herunder tab af FH.

Den mekanisme, hvorved AKT signalering aktiveres af FH tab er under undersøgelse. Vi har tidligere demonstreret, at tabet af FH i renale epiteliale celler resulterer i forhøjet cellulær oxidativ stress [27]. Derfor kan ROS være en bidragyder til de forhøjede HIF-2a niveauer upon FH knockdown. Alternativt kan virkningen af ​​FH tab være relateret til dens rolle i TCA cyklus. Det er velkendt, at FH eksisterer også i en extramitochondrial, cytosolisk formular. På dette tidspunkt, er meget lidt kendt om funktionen af ​​denne form for FH. nylige beviser, som O’Flaherty

et al.

indikerer imidlertid, at tab af extramitochondrial FH kan bidrage til HIF stabilisering [29]. Desuden har cytosolisk FH blevet impliceret i DNA beskadigelse respons [30]. Ved DNA-skade, er cytosolisk FH blevet vist at translokere ind i kernen. Den mekanisme, ved hvilken FH deltager i DNA beskadigelse respons stadig uklar. Men der er helt sikkert den mulighed, at FH og metabolitterne den interagerer med kan regulere funktionen af ​​andre proteiner, potentielt i kernen. Interessant, AKT har også vist sig at fungere i kernen [31]. I betragtning af vores data, samt disse seneste rapporter, målrettet AKT medieret signalveje, enten på niveau med AKT eller opstrøms, kan vise sig at være af terapeutisk fordel for nyrekræft. Dette er i konkordans med de seneste data viser den

in vitro

in vivo

effekten af ​​en dobbelt PI3K /mTOR-hæmmer i RCC [19].

Interessant, der er præcedens for ændringer af TCA cyklus enzym i kræft. Flere andre gener, som koder enzymer af tricarboxylsyre (TCA) cyklussen betragtes tumorsuppressorgener herunder

SDHB

,

SDHC

, og

SDHD

(succinatdehydrogenase subunits B, C, D) [32], [33], [34].

SDH

subunit mutationer er blevet forbundet med fæokromocytom og paragangliom og senere til gastrointestinal stromal tumor (GIST) [35]. Foruden mutationer, har ændringer af ekspression af disse gener blevet forbundet med malignitet. Dahia

et al.

Demonstreret reduceret udtryk for succinatdehydrogenase underenhed B (SDHB) i en delmængde af fæokromocytom [36]. For nylig blev reduceret ekspression af SDHB identificeret i stor del af GIST’er uden mutationer i

SDHB

eller andre gener almindeligvis muteret i GIST’er herunder

KIT

PDGFRA

[35] . Baseret på disse data kan en potentiel samlende tema være at defekter i oxidativ phosphorylering, enten gennem mutation eller ekspressionsværter ændringer, har en rolle i onkogenese. For nylig, Chen

et al.

Foreslået, at iltforbruget via mitokondrie metabolisme kan regulere tumorvækst ved at begrænse tilgængeligheden af ​​ilt til ikke-mitokondrie aktiviteter, der er medvirkende til tumorvækst [37].

af betydelig interesse er vores fund, at FH overekspression resulterer i reduceret migration og invasion af RCC celler. Vores data er i konkordans med en nylig rapport fra Costa

et al. Hoteller, som viste, at

fh

knockdown i udødeliggjort muse embryonale fibroblaster (iMEFS) medførte øget motilitet i forhold til utransducerede iMEFS [38 ]. Desuden stigningen i motilitet var HIF-1α afhængig. Rolle HIF-2α i deres studier kunne ikke bestemmes, da de ikke var i stand til at opdage HIF-2α udtryk i fh mangelfulde iMEFS. Vores undersøgelser fokuseret på HIF-2a givet tidligere undersøgelser, der implicerer sin rolle i nyre. Eftersom HIF-2α knockdown i RCC-celler inhiberer migration, indikerer vore data, at virkningerne af FH overekspression om migration og invasion er delvist medieret af virkninger på HIF-2α. HIF-2α har tidligere været impliceret i den invasive opførsel af RCC-celler. Desuden de invasive fremme egenskaber af HIF-2α er blevet studeret i 786-O-celler, de samme celler anvendes i denne undersøgelse. Hughes

et al.

Viste, at HIF-2α knockdown i 786-O-celler reducerede ekspressionen af ​​multiple integriner, der kan mediere cellemotilitet og invasion [39]. Petrella

et al.

Undersøgt rolle VHL tab i celle invasion [40]. De fandt, at genindførelse af vildtype

VHL

i VHL-mangelfuld 786-O celler reducerede HIF-2α niveauer og celle invasion. Omvendt, re-ekspressionen af ​​HIF-2α i

VHL

rekonstitueret 786-O celler, der restitueres invasiv potentiale. Disse data indikerer en rolle for HIF-2α i RCC migration og invasion. Endvidere blev HIF-2α overekspression sig at forøge væksten af ​​RCC xenotransplantater henviser blev fundet overekspression af HIF-1α til at inhibere xenograft vækst [41]. Tilsvarende separate undersøgelser viser, at HIF-2α, men ikke HIF-1α, bidrager til væksten i

VHL

null tumorxenoplantater [16], [42]. Derfor vores data føje til den voksende mængde af beviser demonstrere tumorfremmende virkninger af HIF-2α udtryk i RCC.

På trods af den nylige godkendelse af flere midler til avanceret nyrekræft, de fleste patienter med fremskreden nyrekræft vil til sidst bukke under for deres sygdom. Derfor vil identifikation af nye signalveje være kritisk for udviklingen af ​​effektive terapeutiske midler. Der er nu stærke beviser for, at renal cancer er blandt de tumorer, der er repræsentative for den nye model i cancer biologi af metaboliske forbindelser til malignitet. Vores resultater med FH foreslå en metabolisk omprogrammering i klar celle nyrekræft, der fremmer ekspression af tumorigene faktorer, herunder HIF-2α via flere mekanismer. Unraveling de mekanismer, hvormed tumor stofskifte er ændret, og de nedstrøms cellulære konsekvenser bør give dyb indsigt i nyrekræft biologi samt nye terapeutiske strategier.

Materialer og metoder

Celler

A498, 786-O, og ACHN-celler blev opnået fra American Type Culture Collection og opretholdt i DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. RCC4 celler blev venligst stillet til rådighed af P. Ratcliffe (Oxford).

Kemikalier

LY294002 blev købt fra Sigma.

Konstruktioner

FH-FLAG konstruktion er tidligere blevet beskrevet [27].

immunblotting

Alle immunoblot analyser blev udført som tidligere beskrevet [27] på helcelle-lysater fremstillet med brug af radioimmunudfældning assaypuffer (50 mM Tris- HCI, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat og 0,1% natriumdodecylsulfat) suppleret med proteasehæmmer cocktail (Roche). Antistoffer blev fremstillet af følgende kommercielle kilder: GeneTex (FH-immunoblotting), Santa Cruz Biotechnology (FH-immunhistokemi), Novus (GAPDH, HIF-2α), Sigma (tubulin, β-Actin), Cell Signaling (total AKT og Ser473 phospho AKT).

Vævsprøve kvantitativ real-time PCR

Biospecimens for RNA-analyse blev opnået fra Cooperative humant væv Netværk af NCI /NIH. Total RNA blev revers transkriberet ved hjælp af High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems). cDNA blev derefter anvendt som skabelon med Applied Biosystems ‘assays-on-demand 20 × assay mix af primere og Taqman sonder. Fyrre amplifikationscykler blev udført på Applied Biosystems Prism 7900 sekvens detektor. Fold ændre værdier mellem tumor og normale prøver blev beregnet ved anvendelse af Δ

C

t metode med normalisering til 18S rRNA niveauer. Som en statistisk test, vi brugte Mann-Whitney parret ikke-parametrisk test til at sammenligne FH udtryk i tumor versus normal tilstødende væv (implementeret i GeneSpring, Agilent).

Immunoblotting og immunhistokemi af humane tumor prøver

Tumor prøver og normal tilsvarende væv fra patienter med RCC blev opnået fra Urologisk afdeling på University of Texas Health Science center på San Antonio. Tumorerne for denne undersøgelse blev histologisk klassificeret som clear cell renal carcinoma af en urogenital patolog. Indsamling og håndtering af humane prøver blev udført i overensstemmelse med en protokol godkendt af Institutional Review Board fra University of Texas Health Science Center på San Antonio. Baseret på den protokol, blev prøver opnået i en deidentified mode fra patienter, der gennemgår kirurgisk resektion for nyrekræft. Som prøver blev indhentet og analyseret i en anonym måde, var patient samtykke ikke påkrævet.

sårheling assay

Celler fik lov til at vokse til nær sammenløb i 60 mm skåle. En ensartet ridse blev derefter gjort ned i midten af ​​pladen under anvendelse af en 200 mikroliter mikropipettespids, efterfulgt af vask to gange med PBS. Det samme markerede område af bunden såret blev fotograferet under anvendelse af et Olympus lysmikroskop (4 × mål) i de angivne tidspunkter. Bredden af ​​bunden såret blev målt ved tre forskellige områder med Q-Capture Pro-softwaren. Kvantificerede data repræsenterer middelværdien +/- S.D. fra mindst to uafhængige forsøg.

Migration assay

786-O subkloner celler (1 x 10

4) blev podet på en 8 uM porestørrelse Thin-cert i 24 brønds plader (Greiner Bio-One) i serum frie medier. Syv hundrede halvtreds mikroliter 10% FBS-medium blev tilsat til den nederste kammer som chemotractant. Efter 48 timer blev celler på toppen af ​​membranen fjernes med en vatpind. De migrerede celler på undersiden blev vasket med PBS, fikseret med 70% ethanol og farvet under anvendelse af 0,1% Crystal violet at visualisere de migrerede celler. Migrerede celler fastgjort til den nedre side af membranen blev optalt ved anvendelse af et lysmikroskop ved 10 ganges forstørrelse. Tællinger repræsenterer gennemsnittet celle antal ti mikroskopiske felter.

Invasion assay

Cell invasion blev bestemt ved invasion assay (membran belagt med et lag af Matrigel ekstracellulære matrixproteiner) ifølge producentens instruktioner. Celler blev podet i serumfrit medium i det øverste kammer og invaderede mod bunden kammer indeholdende en 10% FBS-medium som chemotractant. Membraner blev behandlet på lignende måde som migration assay.

RNA-interferens

I FH og HIF-2α knockdown blev celler transficeret med poolet siRNA reagens (Thermo Fisher) med Amaxa Nucleofector systemet ifølge fabrikantens protokol. Celler blev høstet ved 48-72 timer efter transfektion. En ikke-targeting scramble siRNA pulje blev anvendt som en negativ kontrol (Thermo Fisher).

Tak

Vi takker Cynthia Galindo og Dawn Garcia til teknisk bistand. Vi takker Computational Biology Initiative (UTHSCSA /UTSA) for at give adgang og uddannelse til analysen software, der bruges.