PLoS ONE: Potentiale krydstale mellem Alternativ og klassisk NF-KB veje i prostatakræft væv som målt ved en Multi-Farvning Immunofluorescens Co-Lokalisering Assay

Abstrakt

Baggrund

Mens den klassiske NF-KB /p65 vej er kendt for at være involveret i prostatakræft progression og er forbundet med dårlig patient resultat, rolle NF-KB /RelB alternative protein er ikke veldefineret. Her analyserede vi aktiveringen af ​​både NF-KB veje i prostata cancer væv og korrelere denne aktivering med kliniske symptomer på sygdommen.

Metoder

En multipel immunfluorescens teknik blev anvendt til at samtidigt og kvantitativt visualisere den nukleare lokalisering af p65 og RelB i 200 paraffinindlejrede prøver. Epitel blev defineret ved anvendelse af passende fluorochrom markører og de resulterende immunfluorescerende signaler blev kvantificeret med en automatiseret pointsystem.

Resultater

nukleare hyppighed af p65 viste sig at være steget betydeligt i tumorvæv i forhold til normal tilstødende væv, mens frekvensen for RelB faldt (p 0,001, Wilcoxon test). Som tidligere rapporteret, var p65 nuklear frekvens forbundet med en risiko for biokemisk tilbagefald. Selv RelB nukleare frekvens alene ikke forudsige tilbagefald, tilstedeværelsen af ​​aktiverede RelB reducerede risikoen for tilbagefald i forbindelse med aktiveringen af ​​p65.

Konklusion

For første gang p65 /RelB samarbejde fordeling blev vurderet i prostata cancer væv og foreslog en negativ krydstale mellem de to NF-KB veje i prostatakræft progression

Henvisning:. Labouba i, Le Page C, Fælles L, Kristessen T, Du X, Péant B et al. (2015) Potentiel krydstale mellem Alternativ og klassisk NF-KB Pathways i prostatakræft væv som målt ved en Multi-Farvning Immunofluorescens Co-Lokalisering analysen. PLoS ONE 10 (7): e0131024. doi: 10,1371 /journal.pone.0131024

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 9. februar 2015; Accepteret: 26 maj 2015; Udgivet: 17 Jul 2015

Copyright: © 2015 Labouba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dets understøttende filer

Finansiering:. Stol da Cancer de la prostata (Université de Montréal, https://www.recherche.umontreal.ca/en/research-at-udem/our- forskning-enheder /profil /forene /449 /pid /15 /) CUOG award (https://www.cuog.ca) Réseau de recheche en kræft (https://www.rrcancer.ca/fr/scientifique/biobanques/lister /2). Visiopharm »forudsat støtte i form af en løn for forfatter TK, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Specifikke rolle denne forfatter artikuleres i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Tilknytningen af ​​forfatter TK til selskabet Visiopharm ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om deling af data og materialer .

Introduktion

Prostatakræft er den hyppigst diagnosticerede kræft i nordamerikanske mænd og er den næststørste årsag til kræft dødsfald hos mænd efter lunge- og tyktarmskræft [1]. Typisk forbliver prostatacancer lokaliseret i prostata. Men det kan også vokser aggressivt over prostata kapsel og fører til metastase-dannelse [2]. Mens nogle prostata cancer patienter kræver kun aktiv overvågning af sygdommen, mens andre har brug for mere radikale behandlinger [3, 4]. På nuværende tidspunkt de fleste patienter med lokaliseret prostatacancer blive opereret, strålebehandling eller androgen deprivation terapi som første linie behandling [5]. Men på trods af de høje succesrater opnået med disse behandlinger, 25% af patienterne udvikler biokemisk recidiv (BCR) efter hormon-terapi behandling og fremskridt til en mere aggressiv sygdom, [6, 7]. Således er en stor udfordring i prostatakræft er den korrekte diskrimination af patienter med en latent eller langsomt skrider sygdom fra dem med en mere aggressiv form for kræft. En sådan forskelsbehandling vil hjælpe skræddersy behandling passende for enkelte patienter. For bedre at stratificere prostata kræftpatienter prognose, vil identifikationen af ​​specifikke molekylære biomarkører stand til at forudsige udfaldet udgør et vigtigt fremskridt i forhold til eksisterende kliniske værktøjer. I den forbindelse har vores gruppe været den første til at tage fat på prognostiske potentiale p65-underenheden af ​​Nuclear Factor (NF) -κB i prostatakræft [8] og fremhæve en potentiel rolle Nuclear Factor (NF) -κB i prostatakræft progression [9, 10].

NF-KB-familien omfatter fem transskription faktor proteiner karakteriseret ved deres Rel-homologi domæne. Der er opdelt i to hovedgrupper: Klasse I (NFκB1 og NFκB2) og klasse II (RELA /p65, RelB, og c-Rel). Den NFκB1 og NF-κB2 oversættes i P100 og P105 proteiner, der behandles i deres respektive P50 og P52 underenheder [11]. To større veje styre NF-KB-signalering: den klassiske forløb, hvori heterodimeren p65 /p50 er den vigtigste aktive dimer, og den alternative vej, hvor RelB /p52 er den aktive dimer. Under normale forhold er NF-KB bevaret inaktiv i cytosolen af ​​IKB eller p100-proteiner. Under aktiveringen, i klassiske forløb (IKKβ-afhængige), IKK-komplekset phosphorylerer IKB, inducere dets ubiquitinering og nedbrydning af proteasomet. Dette fører til den nukleare translokation af p65 /p50 eller p50 /c-rel dimerer. I den alternative vej (IKKα-afhængige), IKK-komplekset regulerer behandlingen af ​​p100 precursor, i modsætning til IKB [12-15], som frembringer P52 og den nukleare translokation af p52 /RelB dimer.

Talrige molekylære og biologiske funktioner, såsom inflammation [16, 17], angiogenese [18], overlevelse, migration og invasion [19] har vist sig at være forbundet med aktiviteten af ​​de klassiske NF-KB nukleare faktorer i cancer progression ( revideret i [20]). Mens betydelige arbejde har fokuseret på studiet af den klassiske NF-KB-vejen, for nylig, opmærksomhed har været rettet mod den alternative NF-KB-vejen, og især i forhold til dens indflydelse på inflammation. De biologiske funktioner af NF-KB indebærer også krydstale mellem de klassiske og alternative veje på forskellige niveauer, fra opstrøms signalering til nukleare interaktioner via dannelsen af ​​forskellige NF-KB dimerer. Afhængigt af kontekst og stimuli, kan de to veje samarbejder, eller forstyrre negativt, i reguleringen af ​​genekspression. Desuden forbliver de biologiske funktioner instrueret af krydstale begge veje dårligt forstået og er aldrig blevet undersøgt i prostata kræftceller.

I prostatakræft, har flere undersøgelser rapporteret, at både RelB og p65 kan være formodede prognostiske biomarkører forbundet med sygdomsprogression. Vi, og andre, der tidligere har observeret ved immunhistokemi (IHC) i prostatakræft væv, at forhøjede mængder af nukleart p65 var forbundet med en mere aggressiv sygdom [8, 21]. Efterfølgende blev det vist, at den nukleare lokalisering af p65 er yderst prædiktive af lymfeknude invasion [9] og var forbundet med biokemisk tilbagefald (BCR), enten alene eller i kombination med aktiveret ErbB /Akt signalering [21-25]. For nylig observerede vi en øget forekomst af nukleare RelB i prostatakræft væv sammenlignet med ikke-neoplastiske væv, hvilket antyder, at den alternative NF-KB-vejen også aktiveres i løbet af sygdomsprogression [10]. Derudover blev det vist i en

in vitro

model, inhiberingen af ​​RelB ekspression øger proliferation af 22Rv1 kastreringsniveauer-resistente prostatacancerceller og stimulerer cellulær autofagi [26]. Andre undersøgelser fandt, at RelB øger radiosensitivitet af kastreringsområdet-resistente celler [27-30] tilsyneladende ved opregulering af IL-8 [31]. I overensstemmelse med disse første observationer, blev det også vist, at RelB er overudtrykt i prostata kirtler som reaktion på androgen deprivation [32] og strålebehandling [33], og også inducerer udtryk for af β-galactosid α2,3-sialyltransferase, et gen involveret i gangliosider udtryk og cancer progression [34]. For nylig blev en negativ krydstale vist mellem RelB og AR, og sammen med overlevelse og metastatisk kræft [35].

For at estimere rolle RelB og krydstale mellem den klassiske og den alternative NF-KB veje, vi implementeret en multi-farvning fluorescens teknik, således at kvantitativt analysere den samtidige tilstedeværelse af nuklear p65 og RelB i de samme prostata cancer væv kerner. Kvantificering af det fluorescerende signal blev støttet af et automatiseret system. For at evaluere den biologiske rolle af både NF-KB pathway aktiviteter, vi korreleret den nukleare lokalisering af p65 eller RelB med kliniske parametre og risiko for biokemisk tilbagefald til bedre undrstand den potentielle rolle af NF-KB-vejen krydstale i prostatakræft progression.

Materialer og metoder

kohorte af patienter

Den aktuelle undersøgelse var baseret på en retrospektiv kohorte af 200 patienter med prostatacancer, hvis Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE) primær prostatakræft prøver, var anvendes til at konstruere vævet Microarrays (TMAS). Alle patienter blev opereret mellem 1992 og 2006, og forudsat informeret skriftligt samtykke. Alle tilladelser blev forsvarligt indgivet i en låst sted og scannes samtykker i en password beskyttet elektronisk mappe. Kriteriet om integration for denne retrospektive kohortestudie var der ikke foreligger nogen behandling før Radikal prostatektomi (RP). Efter en screening gennemgang af de kliniske data, blev 11 patienter udelukket fra undersøgelsen, da de ikke opfyldte kriteriet om integration. Den gennemsnitlige patient opfølgning var 96 måneder. BCR (Biokemisk Gentagelse) blev defineret på grundlag af en PSA (Prostata Specifikt Antigen) tilbagefald over 0,3 ng.ml

-1 efter datoen for kirurgi (RP). Gentagelse interval blev defineret som tiden mellem RP og datoen for den første PSA stigning over 0,3 ng.ml

-1. Den endelige iscenesættelse, sortering og histologisk diagnose var baseret på den kliniske patologi rapport fra Hôpital Notre-Dame, (KAMMERAT, Montreal, QC, Canada). Etik godkendelse blev opnået fra det passende Review Board (Comité d’éthique de la recherche du KAMMERAT). Skriftlige samtykke blev forsvarligt indgivet i en låst sted, og elektronisk scannede samtykker blev gemt i en password-beskyttet elektronisk mappe. Etik godkendelse blev opnået fra det passende Review Board (Comité d’éthique de la recherche du KAMMERAT). De vigtigste kliniske parametre for de 189 sager i den kohorte er: Mean opfølgning, 95 måneder; 49% Gleason score 7; 44% Gleason score = 7; 7% Gleason score 7; 18 tilfælde med skelsættende vesikler engagement mod 170 uden; 26% med extraprostatic forlængelse, 32% med positiv kirurgisk margin; 3% med lymfeknude invasion; 142 med patologisk trin 2 og 47 med patologisk stadie 3; kræft specifikke sats er 3%, og den biokemiske gentagelse er 28%

væv microarrays

Fra FFPE menneskelige vævsprøver, tumor områder blev udvalgt på grundlag af Hematoxylin /Eosin (H . E ) -stained lysbilleder af en patolog. FFPE tumorblokke blev derefter biopsi ved hjælp af en 0,6 mm væv diameter arrayer nål og de resulterende kerner blev klædt på et gitter i en modtager paraffin blok. Hver TMA sæt indeholdt én kerne af en tumorprøve og en kerne af en normal tilstødende prostatisk kirtelvæv for i alt 100 patienter. Disse TMA’er blev bygget i to eksemplarer til analyse to uafhængige kerner af hver vævstype pr sager. TMA prøver blev sektioneret farvet med både H . E-og immunhistokemi (IHC) for højmolekylære Cytokeratin (HMCK), og så efterfølgende gennemgik en uafhængig patologi gennemgang at bekræfte og anmærke det histologi af hver kerne

immunhistokemi (IHC)

IHC blev udført under anvendelse af en Benchmark XT automatiseret farvningsværktøjet (Ventana Medical System Inc. VMSI), Tucson, USA). Antigen genfinding blev udført med Ventana Cell Conditioning 1 reagens (VMSI # 950-124). De primære anvendte antistoffer var: anti-p65 (sc-8008), anti-RelB (sc-226), anti-cytokeratin (CK) 18 (sc-6259) og anti-PSA (sc-7638), alle opnået fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) og anti-CK19 (ms-198-P0) fra Thermo Scientific Lab Vision (Ottawa, ON, Canada). Specificiteten af ​​de ovennævnte antistoffer mod p65 og RelB tidligere verificeret ved western-blot [26, 36]. Antistoffer blev fortyndet fra 1:25 til 1: 1000 i et antistof fortyndingspuffer (VMSI # ADB250), bortset fra anti-PSA, som blev fortyndet i phosphatbufret saltvand (PBS). Fortyndede antistoffer blev manuelt dispenseret på objektglassene og inkuberes ved 37 ° C i 60 min. Reaktioner blev udført under anvendelse af UltraView DAB detektion kit (VMSI # 760-500), og objektglas blev derefter modfarvet med hematoxylin og blånelse reagens (VMSI # 760-2021 og # 760-2037). Alle snit blev scannet med en 20x 0.75NA objektiv med en opløsning på 0,3225 mm, ved hjælp af VS-110 slide scanner (Olympus, Richmond Hill, ON, Canada) og analyseret offside om side med HW cytokeratin farvning at tage højde for benigne kirtler.

Immunofluorescens (IF)

Vi producerede en epitelial maske ved hjælp af flere specifikke epitel antigener til at skelne stromale og epiteliale komponenter inden væv. For at dække alle prostatacancerceller, selv i deres mest udifferentieret tilstand, anvendte vi en cocktail af CK18, CK19 og PSA, som alle blev mærket til at udsende i den orange kanal. Objektglas blev også farvet med DAPI (blå) for at identificere kerner. Sekundære antistoffer mod p65 og RelB blev mærket til at udsende i de røde og grønne kanaler, henholdsvis. Dette tillod os at skelne specifik farvning af p65 og RelB i kernen og cytoplasmaet af epitelceller

Specifikt antigen-genvinding blev først udført med Cell Conditioning 1 (VMSI; # 950-124). Hjælp af Bench Mark XT automatiseret farvningsværktøjet (Ventana Medical System Inc.). De primære antistoffer mod p65 og RelB blev fortyndet 1: 125 i PBS, manuelt påført objektglas og inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter. De følgende trin blev manuelt udført på bænken under betingelser for at beskytte lysbilleder fra lys. Begge sekundære fluorescerende antistoffer blev inkuberet samtidigt i 45 minutter ved stuetemperatur (RT): anti-muse Cy5 (# A10524, Life Technologies Inc., ON, Canada) for p65 og anti-kanin Alexa Fluor 488 (A488) (# A11008, Life Technologies Inc.) for RelB, blev begge fortyndet 1: 250 i 1X PBS. Efter to successive vaske med 1X PBS blev TMA lysbilleder blokeret i 60 minutter med muse-On-Mouse blokerende reagens (1 dråbe i 250 pi PBS, MKB-2213 Vector Laboratories, CA, USA) og derefter inkuberet i 90 min ved stuetemperatur med anti-PSA (1: 100 i PBS). TMA Objektglassene blev vasket to gange og inkuberet i 45 minutter ved stuetemperatur med et sekundært fluorescerende anti-gede-Cy3 (# 705-165-003, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., PA, USA) fortyndet til 1: 250 i 1X PBS. Objektglas blev derefter blokeret igen med mus-On-Mouse blokerende reagens natten over ved 4 ° C. Efterfølgende blev de inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur med en blanding af anti-CK18 og anti-CK19 (både ved 1: 100 i 1X PBS) og derefter 45 minutter ved stuetemperatur med sekundær fluorescerende anti-muse Alexa Fluor 546 (A546 antistof) (# A10036, Life Technologies Inc.). Endelig blev objektglas inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur med en 0,1% (w /v) opløsning af Sudan Black i 70% ethanol for at standse vævet autofluorescens. Glassene blev monteret med forlænge Guld antifade Mountant med DAPI (P-36931, Life Technologies Inc.) for kerner farvning. Mellem hvert trin blev TMA objektglassene vasket to gange med 1X PBS. Objektglas blev opbevaret ved 4 ° C og scannet den følgende dag. En negativ kontrol TMA slide blev også gjort parallelt og inkuberes med 1X PBS i stedet for alle primære antistoffer.

Farvning kvantificering

farvning og scoring blev udført blindet til studiet end-point. Sektionerne væv blev scannet med et Olympus mikroskop og VS110 slide scanner koblet til et OlyVia billedfremviser software (xvViewer.exe). Fluorescerende farvning blev derefter kvantificeret med VisiomorphDP software (Visiopharm, Danmark) giver mulighed for en automatiseret billedanalyse. Farvningen via CK18 /CK19 /PSA markører blev anvendt til at begrænse analysen til epitel områder som interesseområdet # 1 (ROI # 1), mens DAPI tjente til at vurdere fluorescensen kun i kerner (ROI # 2) (S1 Fig) . Kerner med definerede ROI # 1 og # 2 blev manuelt revideret for at sikre korrekt valg af epitelceller og til at fjerne omgivende væv med nekrose eller inflammatoriske zoner fra investeringsafkast. Kontinuerlige værdier af fluorescensintensitet for både ROI # 1 og # 2 blev derefter opsamlet ved VisiomorphDP software og overført til Excel at definere epitel- og nukleare NF-KB scores. De positive og negative signaler var baseret på bestemte tærskelværdier (middelværdi intensiteter + standardafvigelse) og anvendt til at beregne frekvensen af ​​positive kerner pr kerne. Gennemsnittet af tumor kerner fra den samme patient blev anvendt til analyse. Den intra klasse korrelation (ICC) mellem de dobbelte kerner var 0,68 og 0,70 (

s

0,001, Spearman). For nuklear p65 og nuklear RelB henholdsvis

statistiske analyser

statistiske analyser blev udført med SPSS-software 16.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). En sammenligning mellem normale hosliggende og matchede tumor kerner blev vurderet ved anvendelse af en ikke-parametrisk Wilcoxon test. Korrelationen med klinisk-patologiske variabler blev estimeret med en ikke-parametrisk Spearman korrelation test. På grund af den iboende natur af immunofluorescens blev kernerne betragtet som positive for nuklear NF-KB, når værdierne var mindst 5% i forhold baggrundsfarvning. Vi anvendte Receiver operative Karakteristisk (ROC) kurver beregning ud fra frekvensen af ​​alle kerner for at bestemme tærskelværdien for hver NF-KB-underenhed i Kaplan-Meier-analyse. BCR-free overlevelseskurver blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier estimator og log-rank testen blev anvendt til at evaluere signifikante forskelle. Forholdet mellem p65 /RelB blev beregnet ud fra frekvensen af ​​nukleare p65 sammenlignet med nuklear RelB. De univariate og multivariate proportionale hazard-modeller (Cox regression) blev anvendt til at estimere hazard ratio for hver NF-KB som kategorisk variabel, mens manglende værdier ikke blev overvejet. Multivariat analyse blev udført ved hjælp af en Enter trinvis fare model på univariat analyse, der var nødvendige for indrejse i modellen. En stikprøve på n = 10k blev anset før anvendelse af multivariate model (n = antal hændelser, k = antal variabler). De covariables blev ikke tidsafhængig. Yderligere klinisk-patologiske variabler inkluderet pre-operatory PSA, Gleason score, status kirurgisk margen, ekstra-prostata udvidelse og sædblæren involvering.

Etik Statement

En etisk godkendelse til undersøgelsen blev opnået fra den relevante review board (Comité d’éthique de la recherche du KAMMERAT). Et skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

Resultater

Immunfluorescerende multi-farvning analyse af p65 og RelB

Formålet med undersøgelsen er at analysere p65 og RelB i normale tilstødende eller maligne epitel prostatakræft væv på samme TMA slide ved hjælp af en kvantitativ og semi-automatiseret proces. En kvantitativ analyse giver løbende data, der giver mulighed for en bredere vifte af påvisning og mere nøjagtig bestemmelse af lav og høj intensitet farvning. For at lette denne proces og opnå maksimal specificitet, valgte vi at implementere en multi-immunfluorescensfarvning teknik (IF).

Først valgte vi epitel områder, der skal analyseres. På grund af dets kendte konstitutiv ekspression i prostataepitelceller blev cytokeratin 18 (CK18) valgt til at identificere epitelceller i vores prøver [37]. observerede dog, at vævsprøver farves ved IHC produceret variable CK18 ekspressionsniveauerne og at farvningen var svagere i dårligt differentierede tumorer (data ikke vist), og dermed reducere nøjagtigheden af ​​identifikation tumor celle i fremskreden prostatacancer væv. For at overvinde dette, valgte vi CK19 og PSA som epiteliale antigener, da de er kendt for at være højt udtrykt i prostataepitelceller [37, 38]. Visuel kontrol af samtidige farvning af CK18, CK19 og PSA med orange fluorescerende farvestoffer (A546 for CK18 og CK19, og Cy3 for PSA) bekræftede fuld epitelial dækning af denne tri-antigen farvning cocktail, der giver følsomhed og specificitet kræves for at identificere prostata epitelial celler uanset niveauet af vævsdifferentiering (S1 fig).

den orange epitel maske blev anvendt med DAPI kernefarvning at begrænse kvantificering af p65 og RelB til epitel kerner. Den underenheder p65 og RelB blev farvet med Cy5 (rød) og A488 (grøn) farvestoffer, henholdsvis (Fig1). Efter denne firedobbelt IF farvning, vi foretaget en kvantitativ analyse af p65 og RelB fra scannede billeder ved hjælp af immunofluorescens billedanalyse program VisiomorphDP. En tærskelværdi på fluorescensintensitet blev defineret til at diskriminere positive og negative fluorescerende signaler, som blev anvendt til at bestemme den specifikke frekvens (%) af p65- eller RelB- positive kerner i hvert væv kerne (herunder dobbelt positive kerner) (Fig 1).

A. Epithelial farvning med CK18, CK19 og PSA definerer epitel maske under anvendelse appelsin fluorochromer (A546, Cy3). B. Identifikation af epitelial område (forelagt i gråt for optimal kontrast i efterfølgende analyser) som ROI # 1 (region af interesse # 1). Identifikation af kerner (grå omgivet af røde sporing) som ROI # 2 fra foruddefinerede ROI # 1. P65 og RelB fluorescens blev efterfølgende evalueret separat i ROI # 1 og # 2. C. RelB farvning med grønt fluorescerende farvestof (A488) og p65 farvning med rødt fluorescerende farvestof (Cy5). Trin 1, 2 og 3 svarer til fluorescens analyseprocessen fulgte hjælp Visiomorph DP-software.

Sammenligning af p65-ekspression ved hjælp af immunhistokemi og kvantitativ automatiseret immunofluorescensanalyse

TMAs, indeholder patient-matchede kerner fra 200 prostata tumorvæv og normalt tilstødende epitel blev farves, scannet og evalueret for p65 og RelB positivt signal. Efter en revision af kliniske data blev kun 11 sager udelukket, da de ikke opfyldte inklusionskriterierne længere. Tilstedeværelse af p65 og RelB var hovedsagelig observeret i epitel, med både cytoplasmiske og nukleare rum udviser positiv farvning (Fig 2A). Brug den automatiske scoring program, var vi i stand til at identificere negative, single p65 (Cy5) eller RelB (A488), og dobbelt (Cy5 /A488) farvede kerner (Fig 2A).

A. Forstørrelse (40X) fremhæve glandulær strukturer i prostatakræft væv. Flet: overlejrede billeder af RelB (A488) i grøn, p65 (Cy5) i rødt og kerner (DAPI) i blå, i normal tilstødende (øverst) eller kræft væv (nederst). Pile viser farvede kerner. B. Sammenlignende kvantificering fra IHC (til venstre) og IF (til højre) farvning af p65. Grafer viser frekvensfordelingen af ​​nukleare p65 som bedømmes visuelt (IHC) eller automatisk (IF). C. Hyppigheden af ​​nukleare p65 (til venstre), RelB (midten) og dobbelt farvede kerner (til højre) i normale tilstødende og tumorvæv. Sammenligningen mellem tilstødende normale og tumor kerner blev udført ved hjælp af en Wilcoxon test.

For at evaluere resultaterne af denne IF teknik, implementeret for kvantificering af nukleare markører i prostatakræft væv, vi sammenlignede kvantificering resultater fra den automatiske analyse med resultater opnået ved hjælp af traditionel IHC farvning. I begge tilfælde blev hyppigheden af ​​p65 farvede kerner evalueret. Vi opnåede en signifikant sammenhæng mellem de to datasæt (r = 0,410,

s

0,001 Spearman), som er i samme område som sammenhængen mellem dublerede kerner inden for den givne teknik. Den traditionelle IHC-metoden, baseret på visuel scoring, var ude af stand til at skelne mellem lav (eller ingen) farvning, hvilket fører til en overvurdering af negative p65 udtryk kerner (Fig 2B). Brug af Kaplan-Meier estimering kurver sammenlignede vi også overlevelsen associering mellem nuklear p65 frekvens og risiko for BCR, som tidligere analyseret i utallige andre prostatakræft kohorter [21, 22, 25, 39]. Nuklear p65 blev fundet at være tilsvarende og signifikant associeret med risiko for BCR i både den traditionelle IHC og software-analyseret IF prøver (Log rang = 4,38,

s

= 0,036 og Log rang = 4,83,

s

= 0,0028, henholdsvis). Tilsammen disse resultater validere brugen af ​​automatiserede analyse fra IF til evaluering af NF-KB-underenhed lokalisering og kvantificering i prostatakræft væv.

Analyse af nukleare fordeling af p65 og RelB i prostatakræft væv

Mens p65 nukleare lokalisering blev øget i prostata tumorer sammenlignet med normale tilstødende væv (fig 2C,

s

0,000, Wilcoxon test), RelB udviste et højere udtryk i normalt tilstødende væv vs. tumorvæv (p = 0,001, Wilcoxon test, fig 2C). Procentdelen af ​​dobbelt farvede p65 /RelB kerner viste ingen signifikant variation mellem normale og tumorvæv (figur 2C).

tumor kerner, aktiveringen af ​​klassiske forløb, som det ses ved nukleær p65, var signifikant korreleret med aktiveringen af ​​det alternative forløb, som repræsenteret ved nuklear RelB lokalisering (r = 0,522, p 0,001 Spearman). For at estimere mængden af ​​interaktion mellem de to NF-KB veje, sammenlignede vi nukleare hyppigheden af ​​hver underenhed i nærvær eller fravær af den anden underenhed. Når nukleart RelB blev udtrykt, var der en samtidig stigning i p65 kernelokalisering frekvens sammenlignet med kerner uden nuklear RelB (27% og 19%, henholdsvis). Tilsvarende blev tilstedeværelsen af ​​nukleare p65 forbundet med en stigning i den nukleare lokalisering af RelB (18% og 10%, henholdsvis).

Korrelation af NF-KB variabler med klinisk-patologiske parametre

Næste vi evaluerede korrelationen mellem nuklear p65 (der repræsenterer aktivering af den klassiske pathway) eller RelB (der repræsenterer aktivering af det alternative forløb) og klinisk-patologiske parametre. Selv nuklear ekspression af disse to proteiner ikke var signifikant korreleret med de fleste prostatakræft aggressivitet parametre, var der en signifikant korrelation mellem nuklear p65 og sædblæren involvering (r = 0,121, p = 0,048, Spearman, tabel 1) .Furthermore, var der en tendens mellem nukleare RelB og patient Gleason score (r = -0,105, p = 0,081, Spearman, tabel 1).

Analyse af co-ekspression af p65 og RelB

til vurdere hvilken rolle hver NF-KB-vejen i prostatakræft progression og den potentielle krydstale mellem begge veje, anvendte vi biokemisk tilbagefald (BCR) som en funktionel indikator for disse aktiviteter. Det nukleare hyppighed af p65 var forbundet med den samlede BCR (

s

= 0,028, Log rang = 4,843, Fig 3A). En Cox regressionsanalyser bekræftet sammenhængen mellem p65 og BCR i univariate (HR = 1,93,

s

= 0,017) og multivariate modeller (HR = 3,15,

s

= 0,003), herunder klinisk-patologiske parametre såsom Gleason score, ekstra-prostata-forlængelse, lymfeknude invasion, sædblæren involvering, og kirurgiske margener (tabel 2). I modsætning til p65, Kaplan-Meier estimering og univariate Cox regression analyser viste, at RelB status alene ikke var forbundet med BCR (

s

= 0,301, Fig 3B og tabel 2). Overraskende, hyppigheden af ​​p65 /RelB dobbelt positive kerner var ikke signifikant prædiktiv for BCR men blev observeret en tendens til en dårligere prognose (

s

= 0,078, Fig 3C).

Kaplan-Meier biokemiske gentagelse-fri overlevelse kurver A. høj ( 20%) og lav ( 20%) hyppigheden af ​​nukleare p65 i epitel af kræft væv. B. High ( 5%) og lav ( 5%) hyppigheden af ​​nukleart RelB i epiteler af cancervæv. Betydning (

s

) er angivet med log rank. C. Double nukleare epithelial farvning af p65 og RelB. D. Epiteliale og nuklear farvning af p65 og RelB. Den KB negative variabel repræsenterer patienter uden positive væv borekerner til p65 og RelB. Variablen p65 alene eller alene RelB betegner patienter positive for kun nukleare p65 eller nuklear RelB. Den variable p65 + RelB, er patienter med tilstedeværelse af både nukleare underenheder i den samme kerne. E. Analyse af epitelial andel af nuklear p65 til RelB i væv kerner inden både p65 og RelB farvning. Forholdet p65 /RelB repræsenterer frekvensen af ​​p65 til frekvensen af ​​RelB. Variablen p65 RelB betegner et forhold på mindst 2 gange mere p65 end RelB; p65-RelB repræsenterer et forhold mellem 0,50 og 2 gange, og RelB p65 repræsenterer et forhold på mindst 2 gange mere RelB end p65

aktivitet og interaktion mellem p65 og RelB. veje kan variere meget inden for en enkelt væv, der kan indeholder en blandet mønster af udtryk med celler viser kun p65 eller kun RelB mens andre er dobbelt positive. For at bestemme de enkelte roller p65 og RelB, vi sammenlignet patient væv med aktivering af en enkelt vej, repræsenteret ved nuklear hyppighed af enten p65 eller RelB, og patienter uden NF-KB-aktivitet (figur 3D). Patienter med kun p65-aktivitet viste en signifikant kortere tid for tilbagefald i sammenligning med patienter uden NF-KB-aktivitet (138 måneder og 98 måneder henholdsvis Log rank = 8,8,

s

= 0,002,) eller sammenlignet med patienter med RelB kun (

s

= 0,021, Log Rank = 5,4, fig 3D). Dette bekræfter, at den klassiske NF-KB-vejen kraftigt fremmer progression af prostatacancer. Omvendt i vores patient kohorte, RelB aktivitet alene blev ikke fundet at påvirke tilbagefald sammenlignet med patienter uden NF-KB-aktivering

(p

= 0,741, Fig 3D). Interessant nok blev den nukleare tilstedeværelse af både p65 og RelB i den samme kerne ikke signifikant associeret med BCR (

s

= 0,252), hvilket tyder på, at RelB kan modvirke den biologiske effekt af p65.

Til definere potentialet af den rolle, RelB på p65 aktivitet, undersøgte vi effekten af ​​hver vej på den anden i forskellige forhold. Forholdet mellem nukleare p65 og RelB blev brugt til at adskille patientens væv med dobbelt farvning af p65 og RelB (fig 3E). Tre kategorier blev foretaget: patienter med en højere andel af nuklear p65 end RelB (større end 2 gange), patienter med en højere andel af nuklear RelB end p65, og patienter med relativt lige mange p65- og RelB-positive kerner (op til 2 ganges forskel). Som forventet blev et højt nukleart p65 forbundet med en betydelig risiko for BCR (Log rang = 6,8,

s

= 0,026 Fig 3E) i forhold til sager tilsvarende niveau for p65 og RelB.