PLoS ONE: Tre-Dimensional Collagen I Fremmer Gemcitabin Resistance in vitro i bugspytkirtelkræftceller gennem HMGA2-Dependent histonacetyltransferase Expression

Abstrakt

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er forbundet med en udtalt collagen-rige stromale reaktion som har vist sig at bidrage til kemo-resistens. Vi har tidligere vist, at PDAC celler er resistente over for gemcitabin kemoterapi i kollagen mikromiljø grund af forøget ekspression af kromatin remodeling protein høj mobilitet gruppe A2 (HMGA2). Det har nu vist sig, at humane PDAC tumorer viser højere niveauer af histon H3K9 og H3K27 acetylering i fibrotiske regioner. Vi viser, at i forhold til celler dyrket på vævskultur plast, PDAC celler dyrket i tredimensionale kollagengeler udvise øgede histon H3K9 og H3K27 acetylering, sammen med øget ekspression af p300, PCAF og GCN5 histonacetyltransferaser (hat). Banker ned HMGA2 dæmper effekten af ​​collagen på histon H3K9 og H3K27 acetylering og kollagen-induceret p300, PCAF og GCN5 udtryk. Vi viser også, at humane PDAC tumorer med HMGA2 demonstrere øget histon H3K9 og H3K27 acetylering. Derudover viser vi, at celler i tredimensionale kollagengeler udviser øget beskyttelse mod gemcitabin. Betydeligt, nedregulering af HMGA2 eller p300, PCAF og GCN5 hatte sensibiliserer cellerne til gemcitabin i tre-dimensionelle kollagen. Samlet set vores resultater øge vores forståelse af, hvordan kollagen mikromiljø bidrager til kemo-resistens in vitro og identificere Hatte som potentielle terapeutiske mål mod denne dødelige kræft

Henvisning:. Dangi-Garimella S, Sahai V, Ebine K, Kumar K, Munshi HG (2013) Tre-Dimensional Collagen i Fremmer Gemcitabin Resistance in vitro i bugspytkirtelkræftceller gennem HMGA2-Dependent histonacetyltransferase Expression. PLoS ONE 8 (5): e64566. doi: 10,1371 /journal.pone.0064566

Redaktør: Edna Cukierman, Fox Chase Cancer Center, USA

Modtaget: Januar 21, 2013; Accepteret: 16. april, 2013; Udgivet: 16 maj, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. National Cancer Institute Grant # R01CA126888 Department of Veterans Affairs Merit Grant # I01BX001363. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af enorme anstrengelser, fremskridt i behandlingen af ​​pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) har været frustrerende ringe [1], [2]. PDAC er fortsat den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, med en -80% etårig dødelighed for de fleste patienter [3]. Denne mangel på fremskridt er til dels på grund af den udtalte kollagen-rige fibrøs reaktion forbundet med PDAC tumorer [4], [5], som efterfølgende begrænser levering og effekt af kemoterapi [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. For nylig offentliggjorde vi, at PDAC celler i det tredimensionale collagen mikromiljø inducere høj mobilitet gruppe A2 (HMGA2), en arkitektonisk protein, der regulerer chromatin struktur og også medierer kemo-resistens i kollagen-rige mikromiljø [6], [10], [11]. Betydeligt, er HMGA2 opreguleret i humane PDAC tumorer, især i high-grade tumorer med lymfeknudemetastaser [12], [13].

PDAC er også forbundet med epigenetiske ændringer, som har været knyttet til patient prognose [ ,,,0],14], [15]. Post-translationelle histon modifikation mønstre detekteret ved immunhistokemi viste sig at være prædiktiv for prognose i to store grupper af PDAC patienter behandlet med kemoterapi [14], [15]. PDAC patienter, hvis tumorer viste en lav udtryk for histon H3 lysin 27 tri-methylering (H3K27Me

3) eller histon H3 lysin 9 di-methylering (H3K9Me

2), som er tilhørende lukket kromatin (heterochromatin «) og gen undertrykkelse [16], [17], [18], havde signifikant kortere samlet overlevelse end PDAC patienter, hvis kræft viste høj histon H3K27Me

3 eller histon H3K9Me

2 udtryk [14], [15]. Men PDAC patienter med lav histon H3K4Me

2, hvilket er et tegn på en mere åben kromatin (euchromatin «) tilstand, viste også kortere samlet overlevelse end PDAC patienter, hvis kræft viste høj H3K4Me

2 udtryk [15] . I modsætning til histon methylering, som er forbundet med både genaktivering og undertrykkelse, har histonacetylering kun været forbundet med genaktivering associeret med euchromatin tilstand [16], [17], [18]. På trods af den klare forbindelse mellem histonacetylering og kræft udvikling [19], [20], bidrag hatte til PDAC progression er ikke blevet godt undersøgt.

Udtrykket og aktivitet af HAT proteiner ændret på en række forskellige kræft [21], [22]. For eksempel er p300 HAT involveret i aktivering af c-myc-promotoren i PDAC celler [23]. P300 HAT er også påkrævet for G1 /S cellecyklus overgang, som nedregulering af p300 HAT forårsager væksthæmning af melanomaceller [24]. HATTE også modulere kromatin tilstand i celler, med GCN5 og PCAF hatte bliver normalt kræves til global histon H3K9 acetylering og p300 HAT bliver normalt involveret i global histon H3K27 acetylering [22], [25]. Interessant, GCN5 HAT bidrager til udbredt vedligeholdelse af aktiv kromatin fremkaldt af den myc onkoprotein [26].

I denne rapport undersøger vi, hvilken rolle og regulering af p300, PCAF og GCN5 hatte i PDAC celler. Vi viser, at den tredimensionale collagen mikromiljø gennem HMGA2 udtryk fremmer histon H3K9 og H3K27 acetylering sammen med p300, PCAF og GCN5 HAT udtryk i PDAC celler. Derudover viser vi, at humane PDAC tumorer med forøget fibrose display højere histon H3K9 og H3K27 acetylering, og har øget HMGA2 udtryk. Endvidere udviser PDAC celler i tredimensionale kollagengeler øget beskyttelse mod gemcitabin. Betydeligt, nedregulere HMGA2 eller p300, PCAF og GCN5 hatte sensibiliserer cellerne til gemcitabin i tre-dimensionelle kollagen. Samlet set vores resultater øge vores forståelse af, hvordan den tredimensionelle collagen mikromiljø bidrager til kemo-resistens in vitro, og etablere hatte som potentielle terapeutiske mål mod denne dødelige kræft.

Resultater

Collagen stiger histon H3K9 og H3K27 acetylering

for nylig offentliggjorde vi, at PDAC celler, der vokser i kollagen-rige mikromiljø var beskyttet mod virkningerne af kemoterapi [6]. Vi viste, at kemo-beskyttelse skyldes øget ekspression af HMGA2 [6], en arkitektonisk protein involveret i reguleringen af ​​kromatin tilstand [10]. Da hatte har været forbundet med ændringer i kromatin tilstand og også mægle respons på DNA skader [19], [20], [21], [22], [27], [28], vi undersøgte, om fibrose i human PDAC tumorer blev associeret med ændringer i histonacetylering. Eftersom p300 og GCN5 hatte er involveret i kromatin afslapning ved at fremme acetylering på steder af DNA-skader og lette reparation [27], [28], undersøgte vi ændringer i acetylering af histon H3 lysin-rester medieret af disse to hatte. Som p300 HAT normalt er involveret i globale histon H3K27 acetyleringsniveauer og GCN5 HAT funktioner til at regulere den globale histon H3K9 acetylering [22], [25], blev humane PDAC tumorprøver farvet for histon H3K9 og H3K27 acetylering ved IHC og trichrom farvet for at vurdere for fibrose . Som vist i fig. 1A og 1B, er der øget histon H3K9 og H3K27 acetylering i områder af fibrose i forhold til de ikke-fibrotiske områder. Kvantificering af den relative farvning viste, at der var ca. 2 gange stigning i nukleær farvning af histon H3K9 og H3K27 acetylering på områder af fibrose sammenlignet med ikke-fibrotiske områder (fig. 1C). For at afgøre, om kollagen mikromiljø blev kausalt forbundet med histon H3K9 og H3K27 acetylering, PDAC celler (Panc1 og CD18 celler) belagt på vævskultur plast eller i tredimensionelle kollagengeler og vurderet for histon H3K9 og H3K27 acetylering ved Western blotting. PDAC celler dyrket i tre-dimensionelle kollagengeler påviste øget histon H3K9 og H3K27 acetylering (fig. 1D).

A, B

. Humane pancreasvæv microarrays (TMAS) indeholdende 24 prøver blev immunfarvet med IgG kontrol antistof eller histon H3K9 og histon H3K27 acetylering (Ac). Den TMA’er blev også Trichrome farvet for at vurdere for fibrose.

mellemværker

viser højere forstørrelse billeder af farvning med kontrol IgG, og for histon H3K9Ac og histon H3K27Ac.

C

. Kvantificering af histon H3K9Ac- og histon H3K27Ac-positive celler blev udført ved hjælp af Adobe Photoshop CS3-softwaren. *, P 0,01 i forhold til sektioner med lav fibrose.

D

. Panc1 og CD18-celler blev dyrket på vævskultur plast eller i tredimensionale kollagengeler i 24 timer. Celler blev lyseret og immunoblottedes for histon H3K9Ac og H3K27Ac hjælp α-tubulin som lastning kontrol. Resultaterne er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

Vi undersøgte også effekten af ​​kollagen I-belagte overflader ( “to-dimensionelle kollagen«) på histon H3K9 og H3K27 acetylering. Som vist i Supplemental Fig. S1, collagen-coatede overflader havde variable virkninger på histon H3K9 og H3K27 acetylering. Histon H3K9 acetylering blev øget på todimensional kollagen i Panc1 celler, men ikke i CD18-celler. I modsætning hertil blev histon H3K27 acetylering øges på todimensional collagen i CD18-celler, men ikke i Panc1 celler. Disse resultater antyder, at todimensionale kollagen overflader kan inducere i et vist omfang, histon H3K9 og H3K27 acetylering. Men eftersom tumorcellerne in vivo er omgivet af kollagen [4], [5], plettering celler i tredimensionale collagen er en mere repræsentativ model til at undersøge effekten af ​​collagen på pankreatisk cancercellelinie adfærd.

HMGA2 regulerer collageninduceret H3K9 og H3K27 acetylering

Vi har tidligere vist, at kollagen mikromiljø forøget HMGA2 ekspression i PDAC celler [[6] og fig. 2A]. For at bestemme om HMGA2 medieret kollagen-induceret histon H3K9 og H3K27 acetylering blev HMGA2 udtryk nedreguleres med 2 forskellige siRNAs i Panc1 og CD18-celler (fig. 2B) og påvirkningen af ​​histon H3K9 og H3K27 acetylering blev bestemt. Som vist i fig. 2C og 2D, HMGA2 siRNA nedsat kollagen-induceret histon H3K9 og H3K27 acetylering i både Panc1 og CD18 celler. Siden vores in vitro kulturer etablere HMGA2 regulering af histon H3K9 og H3K27 acetylering, vi næste undersøgt, i hvilket omfang de menneskelige PDAC tumorprøver der overudtrykker HMGA2 show tegn på øget histon H3K9 og H3K27 acetylering. Som vist i fig. 2E, humane PDAC tumorer med HMGA2 udtryk også vist øget histon H3K9 og H3K27 acetylering. Sammenhængen mellem HMGA2 og H3K9 acetylering i vores TMA’er var statistisk signifikant (p = 0,03), mens sammenhængen mellem HMGA2 og H3K27 acetylering trended mod signifikans (p = 0,10).

A

. Panc1 og CD18-celler blev dyrket på vævskultur plast eller i tredimensionale kollagengeler i 24 timer og immunoblottedes for HMGA2. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

B

–

D

. Panc1 og CD18-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller med 2 forskellige HMGA2 siRNAs, lov til at komme natten over og derefter indlejret i tredimensionale collagen i 24 timer. Lysater blev derefter immunoblottedes for HMGA2 (

B

), histon H3K9Ac (

C

) og histon H3K27Ac (

D

) ved hjælp af α-tubulin som lastning kontrol. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

E

. Menneskelig pancreas TMA’er blev immunfarvet for HMGA2 (

venstre

), histon H3K9Ac (

midterste

) og histon H3K27Ac (

rigtige

).

F

. Forholdet mellem HMGA2 og histon H3K9Ac eller H3K27Ac blev vurderet ved Fishers eksakte test.

HMGA2 regulerer kollagen-induceret p300, PCAF og GCN5 HAT udtryk

Vi næste undersøgte effekten af ​​tre dimensional kollagengeler på p300, PCAF og GCN5 hatte i Panc1 og CD18 celler. Som beskrevet ovenfor er p300 HAT normalt involveret i global H3K27 acetylering og GCN5 og PCAF hatte fungerer til at regulere den globale H3K9 acetylering [22], [25]. PDAC celler i tredimensionale kollagengeler demonstrerer øget ekspression af p300, PCAF og GCN5 hatte (fig. 3A). For at demonstrere, at disse hatte i virkeligheden mægle kollagen-induceret H3K9 og H3K27 acetylering i PDAC celler, p300, blev PCAF og GCN5 udtryk nedreguleret ved hjælp kombination af tre forskellige siRNAs i Panc1 og CD18-celler (fig. 3B), og effekten på H3K9 og H3K27 acetylering blev bestemt. Kombinationen af ​​siRNA’er mod p300, PCAF og GCN5 faldt collagen-induceret histon H3K9 og H3K27 acetylering i både Panc1 og CD18-celler (fig. 3C og 3D).

A

. Panc1 og CD18-celler blev dyrket på vævskultur plast eller i tredimensionale kollagengeler i 24 timer. Celler blev lyseret og immunoblottedes for p300, PCAF og GCN5 histon acetyltrasferases (HATS) ved hjælp af α-tubulin som lastning kontrol. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg

B

–

D

. Panc1 og CD18-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller med kombination af siRNA’er mod p300, PCAF og GCN5 (HAT siRNA); lov til at restituere natten over og derefter indlejret i tredimensionale kollagengeler i 24 timer. Lysaterne blev immunoblottedes for de tilsvarende HAT proteiner (

B

), og histon H3K9Ac (

C

) og H3K27Ac (

D

). Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

E, F

. Panc1 og CD18-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller med individuelle siRNA’er mod p300, PCAF og GCN5; lov til at restituere natten over og derefter indlejret i tredimensionale kollagengeler i 24 timer. Lysaterne blev immunoblottedes for histon H3K9Ac (

E

) og H3K27Ac (

F

). Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Vi har desuden undersøgt det relative bidrag af p300, GCN5 og PCAF på histonacetylering hjælp individuelle siRNA’er stedet at kombinere alle tre siRNAs. Som vist i fig. 3E, transfektion af individuelle siRNA’er mod p300, PCAF eller GCN5 faldt histon H3K9 acetylering i Panc1 celler. Imidlertid transfektion af de individuelle HAT siRNA’er i CD18-celler havde minimal virkning eller paradoksalt forøget histon H3K9 acetylering i CD18-celler. Transfektion af GCN5 siRNA eller PCAF siRNA i CD18-celler forøget histon H3K9 acetylering. Interessant nok blev det for nylig vist, at der er forøget histon H3K9 acetylering i PCAF-nul og GCN5-null mus embryonale fibroblaster [25]. Tilsvarende virkning på histon H3K27 acetylering var enten minimale eller øget efter transfektion af enten GCN5 siRNA eller PCAF siRNA (Fig. 3F). Men transfektion med p300 siRNA reducerede histon H3K27 acetylering i både CD18 og Panc1 celler.

Da vi vise, at HMGA2 regulerer kollagen-induceret histon H3K9 og H3K27 acetylering (fig. 2), vi undersøgte, i hvilket omfang HMGA2 også medieret kollagen-induceret p300, PCAF og GCN5 udtryk. Som vist i fig. 4, HMGA2 siRNA faldt p300, PCAF og GCN5 niveauer i både Panc1 og CD18 celler dyrket i 3D collagen.

Panc1 og CD18-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller med 2 forskellige HMGA2 siRNAs, lov til at komme natten over og derefter udpladet i tredimensionale kollagengeler for yderligere 24 timer. Lysaterne blev derefter analyseret for p300 (

A

), PCAF (

B

) og GCN5 (

C

) Hatte bruger α-tubulin som lastning kontrol. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

PDAC celler i tredimensionelle kollagengeler er beskyttet mod gemcitabin

Vi havde tidligere vist, at PDAC celler i tre-dimensionelle kollagen geler blev beskyttet mod virkningerne af gemcitabin og fortsætter med at formere [6]. Således har vi undersøgt virkningen af ​​collagen på CD18 celler efter gemcitabin. CD18 celler på plast eller i tredimensionale kollagengeler blev behandlet med gemcitabin i 24 timer og derefter trypsiniseret eller underkastes collagenase ekstraktion. Cellerne blev derefter genudpladet på plast eller i tredimensionale kollagengeler, og cellernes evne til at danne kolonier blev bedømt efter 5 dage. Ca. 5% af CD18 celler på plast behandlet med gemcitabin danner flercellede kolonier i forhold til ubehandlede celler (fig. 5A). I modsætning hertil er større end 50% af CD18 celler i tredimensionale kollagengeler behandlet med gemcitabin danne kolonier (fig. 5A).

A

. CD18 celler dyrket på plast eller i tredimensionale kollagengeler blev efterladt ubehandlet eller behandlet med gemcitabin i 24 timer. Cellerne blev derefter trypsiniseret eller ekstraheret ud af kollagen ved collagenase-behandling. Cellerne blev genudpladet på vævskultur plast eller i tredimensionale kollagengeler ved lav densitet (

venstre

). Cellerne blev fotograferet 5 dage senere og talt (

højre

). **, P 0,001. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

B, C

. CD18-celler blev transficeret med kontrol siRNA, HMGA2 siRNA (

B

) eller en kombination af siRNA’er mod PCAF, GCN5 og p300 (

C

), fik lov at komme sig natten over og derefter udpladet i kollagengeler for 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med gemcitabin i 24 timer, udvundet af collagen ved kollagenase behandling og derefter genudpladet i tredimensionale kollagengeler ved lav densitet. Cellerne blev fotograferet 5 dage senere og talt. *, P 0,05. Resultaterne er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg.

HMGA2 og hatte mægle beskyttelse mod gemcitabin i tredimensionelle kollagengeler

Som vi tidligere havde vist, at HMGA2 siRNA faldt spredning af PDAC celler i tredimensionale kollagengeler følgende gemcitabin [6], undersøgte vi virkningen af ​​HMGA2 siRNA på PDAC celler i collagen følgende gemcitabin. CD18-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller HMGA2 siRNA, og behandlet med gemcitabin i 24 timer, og stadig i tredimensionale kollagengeler. Cellerne blev derefter ekstraheret ud af kollagen og genudpladet i kollagen ved en lav massefylde i yderligere 5 dage. CD18-celler transficeret med HMGA2 siRNA viser reduceret antal kolonier sammenlignet med CD18-celler transficeret med kontrol siRNA (Fig. 5B). Ligeledes undersøgte vi effekten af ​​siRNA’er mod p300, PCAF og GCN5 hatte på PDAC celler i tredimensionelle kollagengeler efter gemcitabin behandling. Som vist i fig. 5C, CD18-celler transficeret med p300, PCAF og GCN5 HAT siRNA’er også vise reduceret antal kolonier i forhold til CD18-celler transficeret med kontrol siRNA.

Diskussion

kollagen-rige tumor mikromiljø spiller en væsentlig rolle i PDAC progression af begge fremmer både tumorinvasion og metastase og beskytter kræftceller mod kemoterapi [4], [29]. Det ikke kun begrænser leveringen af ​​kemoterapi for cancerceller [7], men det aktiverer også signalveje, der begrænser virkningen af ​​kemoterapi [6], [7], [8], [9]. Tidligere havde vi offentliggjort, at induktion af HMGA2 ekspression i tredimensionale collagen tilladt PDAC celler til at overvinde virkningen af ​​kemoterapi og fortsætter med at formere [6]. Interessant nok blev HMGA proteiner nylig vist at forøge ekspression af ataksi-telangiectasia muteret (ATM), den vigtigste cellulære sensor af genotoksisk stress, og derved øge modstanden mod DNA-beskadigende midler [30]. I denne rapport, viser vi, at HMGA2 også kan regulere ekspressionen af ​​p300, PCAF og GCN5 hatte i tredimensionelle kollagengeler at begrænse effekten af ​​gemcitabin.

Selvom vi ikke undersøge, om HMGA2 direkte binder til HAT promotorer til at regulere ekspression, HMGA2, ved at virke som en global kromatin switch, er blevet vist at regulere 1.000 gener [31]. Nogle af disse gener reguleres af HMGA2 ved direkte binding til promotorsekvenserne. F.eks HMGA2 regulerer hTERT-ekspression ved binding til hTERT-promotoren og forårsager nedsat belægning af HDAC2 på hTERT-promotoren [32]. Dette fører til en lokaliseret stigning i histon H3K9 acetylering og transkription modulation af hTERT [32]. Imidlertid har andre undersøgelser vist, at HMGA2 kan indirekte påvirke genekspression gennem aktivering af signalveje, såsom induktionen af ​​PI3K /Akt /mTOR /p70S6K signaleringskaskade efter overekspression af HMGA2 i stromaceller [33]. Vi har tidligere vist, at HMGA2 fremmer ERK1 /2 signalering i bugspytkirtelkræftceller i 3D kollagen [6]. Vi har endvidere fundet, at ERK1 /2 signalering også kan mediere collagen-induceret HAT ekspression (Dangi-Garimella S. og Munshi H.G., upubliceret observation). Således er det muligt, at HMGA2 regulering af hatte i tredimensionelle collagen medieres gennem ERK1 /2 signalering.

Vi viser, at de øgede p300, GCN5 og PCAF HAT udtryk i 3D kollagen fremmer histon H3K9 og H3K27 acetylering . Vigtigere, er histon H3K9 og H3K27 acetylering meste placeret på transcription start sites og er beriget med initiativtagere til aktivt transskriberede gener [16], [18], og dermed ændringer i histon H3K9 og histon H3K27 kan have brede og dybtgående virkninger på genekspression og cellulær adfærd. Det er muligt, at collagen mikromiljø også kan modulere acetylering af andre lysinrester. Det har imidlertid vist sig, at GCN5 og PCAF er overflødige og er specielt kræves for histon H3K9 acetylering i fibroblaster [25]. PCAF-null fibroblaster har bevarelse af histon H3K9 acetylering og demonstrere reduktion i histon H3K9 acetyleringen kun når GCN5 er slået ned i disse fibroblaster [25]. Interessant, forfatterne viser overbevisende, at GCN5 kan acetylere histon H3K14 i et in vitro assay, men ingen ændring i histon H3K14 acetylering blev opdaget, da PCAF og GCN5 blev slået ned in vivo [25]. Desuden gjorde nedregulering p300 ikke påvirke histon H3K14 acetylering in vivo, men først og fremmest faldt histon K3K27 acetylering [25]. Det er også muligt, at ændringerne i histon H3K9 og H3K27 acetylering kan skyldes undertrykkelse af histondeacetylaser (HDAC) i tredimensionale collagen. HDAC1 og HDAC7 øges i humane pancreas tumorer i forhold til normalt væv [34], [35]. Desuden udtryk for medlemmer af klasse I HDAC’er i bugspytkirtelkræft cellelinjer er øget i forhold til normale Æske med HDPE celler [36]. I fremtidige studier, vil vi undersøge, om kollagen mikromiljø modulerer udtryk for HDAC’er i bugspytkirtelkræft cellelinjer.

Betydeligt, viser vi, at hatte bidrager til kemo-resistens i tre-dimensionelle kollagen. P300 HAT er blevet vist at være involveret i DNA-skade responset ved at modulere ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) reparere [27]. Faldende aktiviteten eller ekspressionen af ​​p300 HAT undertrykker NHEJ, svækker dobbelt-strenget pause (DSB) reparation og sensibiliserer lunge kræftceller for stråling og kemoterapi [27]. P300 HAT kræves til acetylering af histoner på DSBs at lette kromatin afslapning og eventuel DNA-reparation [27]. Desuden GCN5 stimulerer excision reparation nukleare ved at fremme H3K9 acetylering og kromatin afslapning på steder af skader [28]. Vigtigere er det blevet mere og mere anerkendt, at kromatin tilstand kan påvirke cellulære respons på kemoterapi. Selvom mere kompakt heterochromatin kan begrænse omfanget af indledende DNA-beskadigelse [37], kan det også begrænse adgangen til DNA reparation proteiner. DNA-reparation efter udsættelse for kræftfremkaldende stoffer er mindre effektiv i heterochromatic regioner i forhold til de mindre kompakte euchromatic regioner [38]. I overensstemmelse med den model, hvor heterochromatin begrænser adgangen til proteiner involveret i DNA-reparation, behandling med HDAC-hæmmer trichostatin fremmet euchromatin dannelse og øget DNA-skader reaktion i brystkræftceller [39].

Selvom vi har ikke undersøgt effekt af at målrette hatte in vivo, vores resultater tyder på, at målrettet hatte vil give os mulighed for at øge effekten af ​​kemoterapi i musemodeller for bugspytkirtelkræft og hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Dette understøttes også af resultaterne, at en mere åben kromatin tilstand i PDAC tumor prøver kan være forbundet med dårligere prognose [14], [15]. Selv om flere HDAC-inhibitorer er blevet beskrevet og grundigt undersøgt i cancer progression [40], [41], [42], kun et begrænset antal HAT inhibitorer er blevet udviklet [22]. Det er også vigtigt at bemærke, at PDAC patienter behandlet med HDAC-hæmmer CI-994 og gemcitabin viste ikke øget responsrater i forhold til gemcitabin alene [43]. De første syntetiske HAT hæmmere vist sig effektiv til blokering HAT aktivitet in vitro; blev imidlertid deres anvendelse begrænset af lav metabolisk stabilitet og dårlig cellulær permeabilitet. Anvendelsen af ​​den naturligt forekommende HAT inhibitor anacardic syre blev også begrænset af dårlig cellulær permeabilitet [44]. Selv om naturligt forekommende forbindelser curcumin og garcinol er blevet vist at være effektive HAT inhibitorer in vitro og in vivo [22], der påvises også signifikant ikke-specifik aktivitet. For nylig blev forbindelse C646 designet af virtuel ligand screening og blev vist at være en potent, særdeles selektiv, celle permeable lille molekyle p300 HAT inhibitor [45]. Den C646 inhibitor forhindrer intracellulær histonacetylering og bremser væksten af ​​cancerceller in vitro [45], [46]; dog har effektiviteten af ​​C646 i dyre- og humane undersøgelser ikke blevet rapporteret.

Generelt vi vise, at kollagen mikromiljø in vitro begrænser effektiviteten af ​​gemcitabin gennem HMGA2-afhængig HAT udtryk (fig. 6). Vi viser også, at HMGA2 ekspression er forbundet med histonacetylering i humane PDAC tumorer, især i områder med fibrose, hvilket antyder, at den udtalte fibrotisk reaktion kan bidrage til kemoterapi modstand gennem øget HMGA2-HAT signalering. I betragtning af at der er sket meget få fremskridt i behandlingen af ​​kræft i bugspytkirtlen, rettet hatte kunne være en ny tilgang til bevidstgøre pancreas tumorer til kemoterapi.

Tidligere havde vi offentliggjort, at kollagen mikromiljø inducerede HMGA2 udtryk [Dangi- Garimella S et al, [6]]. Vi har nu vise, at PDAC celler i kollagen mikromiljø fremkalde HMGA2-afhængige HAT udtryk og histon H3 acetylering, tyder på, at kollagen mikromiljø fremmer euchromatin formation. Denne signalvej tillader PDAC celler til at modstå effekterne af gemcitabin i kollagen mikromiljø.

Materialer og metoder

Kemi /Reagenser

GCN5 (sc-20.698) , PCAF (sc-13124), og α-tubulin (sc-8035) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); p300 (05-257), histon H3K9 acetylering (04-1003), og histon H3K27 acetylering (05-1334) antistoffer blev opnået fra Millipore (Billerica, MA); og HMGA2 antistof var fra Biocheck Inc. (Foster City, CA). Sekundære antistoffer blev købt hos Sigma (St. Louis, MO). Type I collagen blev opnået fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Gemcitabin blev opnået fra Eli Lilly (Indianapolis, IN). Nucleofector elektroporering kit blev indkøbt fra Lonza (Walkersville, MD). HMGA2 # 1 (279.254), HMGA2 # 2 (279.255), GCN5 (s5659), PCAF (s16894), og p300 (s4696) siRNA’er blev indkøbt fra Life Technologies (Carlsbad, Californien).

Immunhistokemi (IHC )

pancreasvæv microarrays (TMAS) blev opnået fra US Biomax (Rockville, MD) og bestod af 24 pancreas kerner måler 1,5 mm i diameter og 5 um i tykkelse. Glassene blev trichrom farvet eller farves for H3K9 acetylering, H3K27 acetylering, og HMGA2 ifølge standard IHC-procedurer [5], [6], [47]. Farvede prøver blev vurderet på en skala fra 0-3 med følgende scoringssystem: 0-0% af cellerne farvet; 1- 25%; 2-26-50%, eller 3 . 50%

Cell kultur

Panc1 og CD18 /HPAF-II blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Celler blev holdt i DMEM indeholdende 10% FBS og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) [6]. Cellerne blev testet ved STR profilering på Johns Hopkins ressourcer Core Facility og viste en lignende profil som på ATCC hjemmeside.

Embedding celler i tredimensionale type I collagen geler

Collagen blanding (2 mg /ml) blev fremstillet ved tilsætning af passende mængder af sterilt vand, 10X DMEM og NaOH og holdt på is indtil brug [6], [48], [49]. PDAC celler blev suspenderet i kollagenopløsningen og fik lov at gelere i 15 minutter ved 37 ° C. Regelmæssig medium blev derefter tilsat på toppen af ​​gelen og inkuberet i 24 timer.

Transfektion

Celler blev transficeret med siRNA mod HMGA2, GCN5, PCAF, p300 eller kontrol siRNA (50 nmol) under anvendelse Nucleofector Kit R (Lonza), fik lov at komme sig natten over og derefter udpladet i tredimensionale kollagengeler (2 mg /ml).

immunblotting

Immunoblotting blev udført som tidligere beskrevet [5], [50]. For celler dyrket i collagen, blev matrixen først opløst i collagenase (Worthington Biologicals, Lakewood, NJ) og derefter lyseret som beskrevet tidligere [6], [51].

Kolonidannelseseffektivitet assay

CD18 celler på vævskulturplast eller i tredimensionale kollagengeler blev behandlet med gemcitabin. Fireogtyve timer senere blev cellerne trypsiniseret eller ekstraheret ud af kollagen, og derefter genudpladet på vævskultur plast eller i tredimensionale kollagengeler ved en lav densitet. Cellerne blev fotograferet 5 dage senere og talt.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med GraphPad InStat (LaJolla, CA), ved anvendelse af t-test analyse eller Fishers eksakte test.

Støtte Information

Figur S1.

Virkning af 2D collagen på histon H3K9 og histon H3K27 acetylering.

A, B

. Panc1 og CD18-celler blev dyrket på vævskultur plast eller på collagen I-belagte vævskulturplader (BD BIOCOAT kollagen I) i 24 timer. Celler blev lyseret og immunoblottedes for histon H3K9Ac og H3K27Ac hjælp α-tubulin som lastning kontrol. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg

doi:. 10,1371 /journal.pone.0064566.s001

(TIF)