PLoS ONE: Angivelse af THOP1 og dens forhold til Prognose i ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Undersøgelsen blev designet til at detektere ekspressionsniveauet af thimet oligopeptidase (THOP1) protein i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), og undersøge dens korrelation med clinicopathologic funktioner og prognose.

Metoder

Immunhistokemisk farvning blev anvendt til at bestemme ekspressionen af ​​THOP1 protein i 120 NSCLC prøver og 53 fjernt normale lungevæv. Kvantitativ realtids-PCR og western blotting blev anvendt til at måle ekspressionen af ​​THOP1 i 16 par af primære NSCLC og tilsvarende normale væv.

Resultater

Analyse af immunhistokemisk farvning foreslog lav THOP1 ekspression blev fundet i 71 (59,2%) af de 120 NSCLC prøver og signifikant korreleret med positiv lymfeknude metastaser (

P

= 0,048). Imidlertid blev lav THOP1 ekspression fundet i 22 (41,5%) af de 53 normale lungevæv. Chi-square test antydede, at ekspressionen af ​​THOP1 var signifikant højere i de normale lungevæv end i NSCLC prøver (

P

= 0,032). Real-Time PCR og western blotting viste, at NSCLC prøver var faldet THOP1 mRNA og proteinekspression sammenlignet med tilsvarende normale væv. Univariate analyse viste, at lav THOP1 udtryk signifikant forudsagt faldt 5-års sygdomsfri overlevelse (

P

= 0,038) og samlet overlevelse (

P

= 0,017). Desuden positiv lymfeknude metastaser (

P

= 0,025) og avancerede TNM stadie (

P

= 0,009) signifikant forudsagt faldt 5-års samlede overlevelse. viste imidlertid, multivariat Cox regressionsanalyse at kun lave THOP1 udtryk bevaret sin betydning som en selvstændig prognostisk faktor for ugunstige 5-års sygdomsfri overlevelse (

P

= 0,046) og samlet overlevelse (

P

= 0,021).

konklusioner

THOP1 kan have kliniske potentialer, der skal anvendes som en lovende biomarkør for at identificere personer med bedre prognose og en roman antitumormiddel til behandling af patienter med NSCLC.

Henvisning: Qi L, Li Sh, Si Lb, Lu M, Tian H (2014) Ekspression af THOP1 og dens forhold til Prognose i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (9): e106665. doi: 10,1371 /journal.pone.0106665

Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: 23. maj 2014; Accepteret: 30 Juli 2014; Udgivet 2. september, 2014

Copyright: © 2014 Qi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.571.844), Videnskab og Teknologi Development Foundation i Shandong-provinsen (Nej . 2009GG10002007), og National Natural Science Foundation i Shandong-provinsen (nr ZR2009CM090). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er en af ​​de mest almindelige intrathorakale maligniteter hele verden på grund af sin sene klinisk præsentation og hurtig progression [1], [2]. Trods visse fremskridt i tidlig opsporing og radikal kirurgisk resektion kombineret med adjuverende behandling i den seneste årti, prognosen for NSCLC patienter forblive relativt dårlig [3]. Det er almindeligt anerkendt, at genetisk heterogenitet og miljømæssige faktorer fører til tumorigenese for lungekræft på samme tid. Derfor identifikation af nye prognostiske biomarkører med mulig terapeutisk og prognostisk relevans er vigtigt at optimere behandlingen af ​​NSCLC

Thimet oligopeptidase (THOP1; EC3.4.24.15 eller EP 24,15). Er en karakteristisk metallopeptidaser med et HEXXH zink bindende motiv og er forbundet med metabolisme af adskillige neuropeptider indeholdende fra 5 til 17 aminosyrer, såsom bradykinin, gonadotropin Releasing Hormone, opioider og neurotensin [4], [5], [6]. Akkumuleret beviser, at der THOP1 overvejende blev udtrykt i cytosolen, endoplasmatisk reticulum, mitokondrier og kerne af forskellige normale humane væv og tumorceller [7], [8], [9]. Desuden immunhistokemisk analyse viste, at THOP1 var til stede i 90% af NSCLC cellelinie H1299 og udskilles af cellerne til at spalte og aktivere DTS-201 [10]. Nylig undersøgelse viste, at høj THOP1 mRNA-ekspression niveau i normale baggrund lever af hepatocellulært carcinom (HCC) var signifikant korreleret med bedre overlevelse [11]. Desuden THOP1 kunne hæmme tumor angiogenese og tumor spredning fremmes af BK i melanomaceller [12]. Disse fund indikerer THOP1 kan være en potentiel antitumormiddel til tumorterapi.

Ekspression af THOP1 og dets rolle i prognosen af ​​NSCLC er ikke blevet undersøgt indtil nu. Derfor har vi opdaget ekspressionsniveauerne af THOP1 protein hos patienter med NSCLC ved at ansætte immunhistokemisk metode til at undersøge dets overensstemmelse med clinicopathologic funktioner, postoperativ tumor tilbagefald og prognose.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Qilu Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient til at offentliggøre case detaljer, og erhvervelse af vævsprøver blev udført som foreskrevet af de institutionelle retningslinier.

Patienter

Tumor prøver (n = 120, betyder alder 61 ± 4,35 år) og fjerne normale lungevæv (n = 53, 5 cm fra margenen af ​​tumoren) blev indsamlet fra patienter med NSCLC, som gennemgik komplet tumor resektion (lobectomy eller pneumonectomy) med regional lymfeknude dissektion mellem januar 2006 og december 2007 afdelingen for Thoracic Surgery, Qilu Hospital. Histologisk undersøgelse og kvalitet af kræft celledifferentiering var baseret på klassifikationssystem for World Health Organization revideret i 2004, og TNM af UICC 2009. Ingen patienter havde gennemgået ufuldstændige resektion og modtog kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. De kliniske karakteristika for disse 120 patienter er vist i tabel 1.

Immunhistokemi

Immunohistokemisk farvning for THOP1 blev udført under anvendelse af streptavidin-peroxidase metode. Kort fortalt blev 4-um-tykke snit skåret fra paraffinindlejrede blokke, afparaffiniseret i xylen og dehydreret gennem en række gradueret alkohol. Snittene blev inkuberet i citratbuffer (pH 6,0) med en mikrobølgeovn. Efter afkøles til stuetemperatur, blev objektglassene inkuberet i 3% hydrogenperoxid i 15 minutter for at blokere endogen peroxidase-aktivitet og inkuberet med et monoklonalt museantistof mod THOP1 (Abcam, Cambridge, MA, USA, fortynding 1:50) natten over ved 4 ° C. Efterfølgende blev det biotinylerede sekundære antistof og peroxidase-konjugeret streptavidin kompleks reagens anvendt, efterfulgt af modfarvning med Mayers hæmatoxylin. Positive og negative kontroller blev inkluderet i hvert trin.

Evaluering af THOP1 Protein Expression

De immunfarvet slides blev evalueret af to uafhængige efterforskere i en blindet måde og revurderes af disse efterforskere under en multihead mikroskop i uharmoniske tilfælde at nå til enighed. Ekspression af THOP1 protein blev vurderet ved at beregne et samlet immunfarvning score som produktet af både intensiteten score (0, negativ farvning; 1, svag farvning, 2, moderat farvning, 3, stærk farvning) og andelen score (0, 0- 5%, 1, 6-25%, 2, 26-50%, 3, 51-75%, 4, ≥76%), henholdsvis. Således er den samlede score varierede fra 0 til 7. cutoff værdi for høj og lav THOP1 ekspression blev bestemt på grundlag af en heterogenitet værdi målt gennem en log-rank statistisk analyse med hensyn til den samlede overlevelse. Den fraktil, der gav minimale

P Drømmeholdet værdi blev valgt som cutoff punkt [13]. I korte træk blev 120 patienter arrangeret i rækkefølge efter den samlede farvning score påvist ved immunohistokemisk analyse fra store til små. Ved hver percentil fra 10 til 90 blev dataene inddelt i to grupper og forskelle i samlet overlevelse blev analyseret under anvendelse af log-rank test. Den 41. percentil, der svarer til den samlede farvning score på 4 gav minimum

P Drømmeholdet værdi (

P

= 0,017), og blev valgt som cutoff point. Derfor blev den samlede farvning score på 4 valgt som cutoff point for diskrimination mellem høj og lav THOP1 ekspression. Tumorer med en samlet farvning score ≥4 blev alle defineret som høj THOP1 udtryk, og tumorer med en samlet farvning score. 4 blev alle defineret som lav THOP1 udtryk

RNA Extraction, Reverse-transskription Polymerase Chain Reaction kvantitativ realtids-PCR

Totale RNA’er blev ekstraheret fra væv ved hjælp af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret ved SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved anvendelse af SYBR Green Supermix (Bio-Rad, CA, USA) i THOP1 ifølge producentens anvisninger. Niveauerne af THOP1 messenger RNA (mRNA) blev normaliseret til det humane β-actin ekspressionsniveau og beregnet ved anvendelse af 2

(- △△ CT) metode. Primere blev anvendt som følgende: sense: Primerne for β-actin var: 5′-GCATCCACGAAACTACCT-3 ‘(fremad) og 5′-GAAAGGGTGTAACGCAAC-3′ (revers). THOP1 primere var: 5’-CAT GGC CAA GAC CAG CCA GA-3 ‘(fremad) og 5′-CGC ACG CTT CAG CTC CAG AA-3’ (tilbage)

SDS-PAGE og Western Blot.

Proteiner blev ekstraheret under anvendelse RIPA-lysepuffer. Lige store mængder (20 mg) af protein blev underkastet SDS-PAGE analyse, overført til nitrocellulosemembraner og probet med primære antistoffer. Antistof mod THOP1 blev indkøbt fra Abcam (Abcam, Cambridge, MA, USA, fortynding 1:1000). Anti-β-actin-antistof blev anskaffet fra Sigma (Sigma, St. Louis, USA). Proteinbånd blev påvist ved anvendelse af forøget kemiluminescens-metoden (Millipore, Billerica, MA, USA). Den optiske band densitet blev kvantificeret (Imager af Alpha Corporation, San Leandro).

Opfølgning

Alle patienter udskrevet fra hospitalet blev fulgt op på ambulatoriet hver 3 til 6 måneder. Opfølgning evaluering af patienter bestod af fysisk undersøgelse blodprøver, computertomografi, ultralydsundersøgelse, røntgenbillede af brystkassen, og fiberoptisk bronkoskopi evt. Placeringen og tidspunkt for tumortilbagefald blev registreret. Opfølgning blev afsluttet i alle patienter indtil december 2013 og den mediane opfølgningsperiode var 48 måneder (interval: 15~96 måneder).

Statistisk analyse

Statistisk analyse af data var udført af SPSS 17.0 system. Chi-square test blev udført for at undersøge associering THOP1 og forskellige clinicopathologic faktorer. Opfølgning tid blev censureret, hvis patienten var tabt til opfølgning. Overlevelseskurver blev tegnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log-rank test. Multivariat Cox regressionsanalyse blev brugt til at identificere væsentlige uafhængige prognostiske faktorer. Alle data er gennemsnit ± standardafvigelse (SD) fra uafhængige assays. Andre statistiske analyser blev udført ved anvendelse af en t-test.

P

0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

1.. Angivelse af THOP1 i NSCLC og dets overensstemmelse med clinicopathologic faktorer

Vi har registreret udtryk for THOP1 protein i 120 NSCLC prøver og 53 normale lungevæv ved hjælp immunhistokemi. Som vist i fig. 1, immunhistokemi med THOP1 antistoffer viste en positiv reaktion i cytoplasmaet i NSCLC celler. Ifølge vores tidligere definerede kriterier, blev høj THOP1 ekspression fundet i 49 (40,8%) af de 120 tumorprøver og lav THOP1 ekspression blev fundet i 71 (59,2%) af de 120 tumorprøver. Hertil kommer, som negative kontroller, immunfarvning uden primære antistoffer resulterede ikke i nogen farvning. Som vist i fig. 2, THOP1 blev højt udtrykt i cytoplasmaet af normale bronchiale epitelceller og pneumocytter. Høj THOP1 ekspression blev fundet i 31 (58,5%) af de 53 normale lungevæv og lav THOP1 ekspression blev fundet i 22 (41,5%) af de 53 normale lungevæv. Udtrykket af THOP1 var signifikant højere i de normale lungevæv end i NSCLC prøver (chi-square test,

P

= 0,032).

Forskellige intensiteter af THOP1 proteinekspression i adenocarcinom, negativ ekspression (A), med svag (B), moderat (C), og stærk (D) ekspression. Forskellige intensiteter af THOP1 proteinekspression i pladecellekræft, negativ udtryk (E), med svag (F), moderat (G), og stærk (H) udtryk.

Forholdet mellem THOP1 proteinekspression og clinicopathologic faktorer blev undersøgt ved chi-square test, og vores data viste, at lavere THOP1 udtryk var signifikant korreleret med positiv lymfeknude metastaser (

P

= 0,048). Der var ingen statistisk signifikans i forholdet mellem THOP1 udtryk og andre clinicopathologic variabler (

P

0,05, tabel 1).

For at undersøge ekspressionen af ​​THOP1 gen i NSCLC, vi brugte kvantitativ real -Time PCR for at måle ekspressionen af ​​THOP1 mRNA-niveauer i 16 par af primære tumorer og tilsvarende normale væv. Sammenlignet med deres tilsvarende normale væv, havde NSCLC prøver faldt THOP1 mRNA-ekspression (figur 3A). Konsekvent viste western blotting-analyse, at 12 ud af 16 NSCLC prøver var faldet THOP1 proteinekspression forhold til deres tilsvarende normale væv (figur 3B).

A. Ekspression af THOP1 mRNA i NSCLC væv var lavere end i de normale lungevæv (

P

0,01). B. Western blot analyse tydede på, at NSCLC prøver var faldet THOP1 proteinekspression sammenlignet med tilsvarende normale væv. N: Normal lungevæv, T:. NSCLC prøver

2. Univariate og multivariate overlevelse analyse for 5-års sygdomsfri overlevelse

Tumor tilbagefald udviklet inden for follow-up periode i 82 (68,3%) af de 120 patienter: lokalt recidiv hos 18 patienter, fjernmetastaser i 52 patienter og både lokalt recidiv og fjernmetastaser hos 12 patienter. Univariate analyser (log-rank test) viste, at lav THOP1 udtryk (25,4% versus 40,8%,

P

= 0,038, figur 4A) signifikant forudsagt faldt 5-års sygdomsfri overlevelse. Desuden er resultaterne af multivariat Cox regressionsanalyse viste, at lav THOP1 udtryk bevaret sin betydning som en selvstændig prognostisk faktor for ugunstige 5-års sygdomsfri overlevelse (

P

= 0,046, tabel 2).

3. Univariate og multivariate overlevelse analyse for 5-års samlet overlevelse

Af de 120 patienter, 73 (60,8%) tilfælde døde af kræft-relaterede årsager inden for 5 år efter operationen, den 5-årige samlede overlevelse var 39,2%. Univariate analyser (log-rank test) viste, at lav THOP1 udtryk (29,6% versus 53,1%,

P

= 0,017, figur 4B), positiv lymfeknude metastaser (29,0% versus 50,0%,

P

= 0,025, figur 4C) og avancerede TNM stadie (30,1% versus 53,2%,

P

= 0,009, figur 4D) signifikant forudsagt dårlig 5-års samlet overlevelse (tabel 3). Resultaterne af multivariat Cox regressionsanalyse viste, at den signifikante prognostiske virkning af positiv lymfeknudemetastase (

P

= 0,653, tabel 3) og avancerede TNM stadie (

P

= 0,218, Tabel 3) observeret på univariat analyse forsvandt, og kun lave THOP1 udtryk bevaret sin betydning som en selvstændig prognostisk faktor for ugunstige samlet overlevelse (

P

= 0,021, tabel 3).

diskussion

Selvom der anses for at spille en rolle i neuroendokrine system, [14], THOP1 er blevet en seneste fokus i tumor forskning. Cellefraktionering undersøgelser har vist, at THOP1 er til stede i de partikelformige subcellulære fraktioner af centralnervesystemet væv [15] og udskilt fra markante cellelinjer, såsom rotte gliom C6 [16] og muse AtT-20 [17]. Endvidere blev høj THOP1 mRNA-ekspression i tilsvarende normale væv af hepatocellulært carcinom (HCC) korreleret med en bedre samlet overlevelse [11]. Imidlertid har kun få undersøgelser påvist ekspressionen af ​​THOP1 protein i tumorvæv og forholdet mellem tumor prognose.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​THOP1 i NSCLC og den tilsvarende normale væv, og derefter analyseret forholdet mellem THOP1 udtryk og andre clinicopathologic variabler i NSCLC. Resultaterne af vores undersøgelse viste, at THOP1 universelt blev udtrykt i NSCLC og tilsvarende normale væv, og ekspressionen af ​​THOP1 i normale væv i NSCLC var signifikant forhøjet i både mRNA og protein niveauer. Desuden blev lavere THOP1 ekspression i NSCLC signifikant korreleret med positiv lymfeknude metastaser. Kaplan-Meier analyse i denne undersøgelse viste, at lave THOP1 udtryk signifikant forudsagt faldt 5-års sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse. Desuden positive lymfeknudemetastaser og avanceret TNM stadie signifikant forudsagt faldt 5 års samlet overlevelse. For at eliminere virkningen af ​​blandede faktorer korreleret med prognose på statistisk analyse blev Cox regression multivariate analyse udført for at bestemme uafhængige prognostiske faktorer. Multivariat analyse viste, at kun THOP1 fastholdt sin prognostisk værdi som selvstændig prognostisk faktor for dårlig sygdomsfri og samlet overlevelse. Vores overlevelse analyse viste, at ekspressionen af ​​THOP1 protein kunne være en nyttig diagnostisk markør for patienter med NSCLC. Som anført ovenfor, vores resultater antydede, at THOP1 protein kan have en antitumorvirkning i carcinogenese og tumorprogression af NSCLC.

tidligere undersøgelse antydede, at THOP1 kunne hydrolysere flere slags bioaktive peptider såsom bradykinin (BK) [ ,,,0],18]. BK er en vigtig mediator ansvarlig for tumorassocieret angiogenese og tumorvækst [19], [20], [21]. Desuden blev BK involveret i carcinogenese og cancer progression ved at øge α2β1 integrin ekspression gennem BK receptor signal pathway [22]. Som en antagonist faktor til BK kunne THOP1 inhibere angiogenese og tumorvækst fremmes af BK [12]. Patologisk angiogenese er et relativt tidligt begivenhed i carcinogenese og øget tumor angiogenese er korreleret med tumorinvasion, metastase og dårlig prognose [23], [24]. Derfor nedsat ekspression af THOP1 i NSCLC kan være ansvarlig for cancerudvikling, malignitet og ringe overlevelse på grund af dets reduktion i anti-BK-funktion. Der er gjort

Spændende fremskridt i at ansætte THOP1 til immunterapi i cancere. Det blev rapporteret, THOP1 udskilt af tumorceller var en meget sandsynlige kandidat til den ekstracellulære aktivering af CPI-0004Na som var en prodrug af doxorubicin, og den forbedrede terapeutiske indeks for CPI-0004Na sammenlignet med frit doxorubicin blev bekræftet i tre tumor xenograftmodeller af prostata, bryst, og lungekræft [10], [25]. En anden undersøgelse om cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) foreslog THOP1 kunne styrke immunforsvaret mod intracellulære patogener og cancer ved at bidrage til den C-terminale trimning af CTL-epitoper [26]. Derfor kan THOP1 have klinisk potentiale til at blive ansat som en mere nyttig agent for antitumor terapi for patienter med NSCLC.

Det kan konkluderes, vores retrospektiv analyse dokumenteres, at ekspressionen af ​​THOP1 var signifikant højere i de normale lungevæv end i NSCLC prøver og lav THOP1 ekspression blev signifikant korreleret med positiv lymfeknude metastaser i NSCLC. Desuden høj THOP1 proteinekspression udstillet antitumor ejendom og viste positiv indflydelse på både sygdomsfri og samlet overlevelse. Derfor kan THOP1 have kliniske potentialer, der skal anvendes som en lovende biomarkør for at identificere personer med bedre prognose og en roman antitumormiddel til behandling af patienter med NSCLC.