PLoS ONE: Genome Wide Analyse af androgen receptor Mål afslører COUP-TF1 som Novel Player i Human Prostata Cancer

Abstrakt

Androgen aktivitet spiller en central rolle i prostatakræft progression. Androgen receptor (AR) er den vigtigste mediator af androgen aktivitet i prostata, gennem dets evne til at fungere som en transskription mediator. Her har vi udført en genom-dækkende analyse af humant AR-binding til promotorer i nærvær af en agonist eller antagonist i en androgenafhængig prostatacancer-cellelinie. Mange af AR bundne promotorer er bundet i alle undersøgte betingelser, mens andre er kun bundet i nærvær af en agonist eller antagonist. Flere motiver er beriget med AR bundet initiativtagere, herunder AR Respons Element (ARE) halv-site og elementer til transkription anerkendelse faktorer OCT1 og Sox9. Dette antyder, at disse 3 faktorer kan definere et modul samvirkende transkriptionsfaktorer i prostata. Interessant, er AR bundet initiativtagere fortrinsvis placeret i AT rige genomiske regioner. Analyse af mRNA-ekspression identificeret kyllingeovalbumin opstrøms promotor-transkriptionsfaktoren 1 (COUP-TF1) som en direkte AR målgen, der nedreguleres ved binding af agonisten ligand AR. COUP-TF1 immunfarvning afslørede nucleolar lokalisering af COUP-TF1 i epitel af human androgenafhængig prostatacancer, men ikke i tilgrænsende benign prostata epitel. Stromale celler i både mennesker og mus prostata show nukleare COUP-TF1 farvning. Vi viser desuden, at der er en omvendt korrelation mellem COUP-TF1 ekspression i prostata stromaceller og de stigende niveauer af androgen med fremrykkende puberteten. Denne undersøgelse udvider puljen af ​​anerkendte formodede AR mål og identificerer en negativt reguleret mål af AR – COUP-TF1 – hvilket muligvis kan spille en rolle i human prostatacancer

Henvisning:. Perets R, Kaplan T, Stein I , Hidas G, Tayeb S, Avraham E, et al. (2012) Genom-Bred analyse af androgen receptor Mål afslører COUP-TF1 som Novel Player i Human prostatakræft. PLoS ONE 7 (10): e46467. doi: 10,1371 /journal.pone.0046467

Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrig

Modtaget: 31 marts 2011; Accepteret: 3. september 2012; Udgivet: 4 oktober 2012

Copyright: © Perets et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF), Israel Science Foundation og Prostata Cancer Foundation (EP). TK blev understøttet af en europæisk Molecular Biology Organization (EMBO) langsigtede ph.d.-stipendium. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige ikke-hudkræft hos mænd i USA, med en anslået antal 217,730 nye tilfælde i USA i 2010 [1]. Androgen afsavn terapi er i øjeblikket grundpillen for fremskreden prostatacancer behandling. Androgen deprivation kan opnås gennem androgen depletering (f.eks behandling med GnRH-agonister) undertiden sammen med androgen antagonister såsom flutamid og bicalutamid [2] -. [4]

Androgen virkning på normale og maligne prostata celler medieres gennem dets evne til at trænge ind i celler og binde dets receptor – AR. I fravær af en ligand AR ligger i cytoplasmaet i et kompleks med varmechokproteiner (HSP) og co-chaperoner [5] – [7]. Ved androgen binding AR undergår strukturelle omlejring, som resulterer i dissociation af HSP, eksponering af dets nukleare lokaliseringssignal og translokation ind i kernen. Nuclear AR binder DNA, rekrutterer co-aktivatorer og letter transskription af målgener. Transkriptionen af ​​målgener anses for at være det vigtigste middel, hvorigennem AR påvirker cellerne. Ligand bundet steroid receptorer blev canonically menes at binde en konsensussekvens i DNA, der består af to hexamere halve steder af konsensussekvensen 5′-TGTTCT-3 ‘, indrettet som omvendte gentagelser, adskilt af tre nucleotider [8] – [ ,,,0],15]; endnu dette dogme blev for nylig gjort gældende med hensyn til AR. Det blev for nylig foreslået, som understøttes af vores data, at den halve site er tilstrækkelig til AR-binding til DNA i nærvær af androgen [16] – [18]

I nærværelse af en AR-antagonist, såsom. som flutamid, betyder AR transkriptionel kompleks stadig former, men transskription af velkendte AR målgener ikke ske eventuelt via rekruttering af co-repressorer. For eksempel ved tilsætning af antagonisten bicalutamid, AR skifter ind i kernen, binder promotoren af ​​dens velkendte målgen PSA og rekrutterer co-repressorer såsom SMRT og NCoR [19], [20]. Dannelsen af ​​antagonisten bundet AR transkriptionel kompleks blev nøje undersøgt på enkelte promotorer [19] – [21]. Imidlertid blev hele genomet promotor belægning af antagonist bundet AR aldrig studeret før. Vi antager, at i androgen afhængig prostata kræftceller antagonist bundet AR binder et unikt sæt af målgener, som kan afvige fra de målgener af agonist bundet AR.

Vi har udnyttet genom-dækkende placering analyse af AR i tilstedeværelse af agonist, antagonist eller ingen ligand at studere forskelle og ligheder mellem AR målgener i disse betingelser. Vi har set flere promotorer, der konstitutivt bundet i nærvær af en agonist og antagonist samt promotorer, der er bundet alene i nærværelse af enten en. Vi karakterisere yderligere en hidtil ukendt AR reguleres negativt målgen COUP-TF1, hvilken promotor kun er bundet i nærvær af antagonisten.

Resultater

Androgen Receptor målgener i humane prostatacancerceller

LAPC4 prostatacancerceller udtrykker vildtype AR [22], hvilket afspejler AR status fleste androgenafhængig prostatacancer. I nogle prostatacancercellelinjer, kan visse AR antagonister tjene som agonister, sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af ​​en mutant AR [23] – [27]. Således har vi først testet effekten af ​​androgen, eller AR antagonist på vækst af LAPC4 celler in vitro sammenlignet med celler behandlet med vehikel alene. LAPC4 celler prolifererede i nærvær af androgen, men ikke i nærvær af en antagonist. Når de kombineres flutamid antagoniserer den proliferative effekt af androgen (figur S1). Disse resultater bekræfter androgen afhængighed af LAPC4 celler, viser, at flutamid tjener som en antagonist af AR s proliferative virkning og udelukke muligheden for, at flutamid kan tjene som en funktionel AR agonist i denne cellelinie.

For at identificere den direkte målgener af AR i prostatacancerceller i nærvær af en AR-agonist, AR-antagonist eller i fravær af begge, LAPC4 celler blev første androgen poleres i tre dage. Cellerne blev derefter inkuberet med bærer alene, 10 nM R1881 eller 40 uM flutamid i 16 timer. Længderne af aktivering og R1881 koncentration blev valgt i henhold til tidspunktet for maksimal AR rekruttering til sit bedste studeret målgen PSA [28]. Kromatin immunopræcipitation (chip) af AR bundet kromatin blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Immunoaktiviteten udfældet fraktion og en prøve af indført DNA blev hybridiseret til et mikroarray, der repræsenterer 19.000 humane genpromotorer. Bindende data fra tre chip-chip eksperimenter blev analyseret og prober, der var bundet med p-værdi. 0,001 blev betragtet som AR bundet initiativtagere (ARB’er)

En analyse af AR målgener med bil alene, R1881 og flutamid afsløret tre grupper af ARB’er. Der er en vis overlapning mellem målgener i disse tre betingelser, samt ARB’er specifikke for hver betingelse (figur 1a og tabel S2). Listerne over målgener afslørede nogle gener, der var kendt for at være reguleret af AR såsom HOXB13 [29], [30]. Nogle kendte AR target gener, såsom PSA blev ikke hentet i disse arrays trods for, at genspecifikke ChIP anførte, at den fortrinsvis er bundet af AR (figur S2a). Dette indebærer en vis hastighed for falsk negative resultater. Men som det fulde sæt af mål er ukendt kan ikke estimeres den falske negative sats.

LACP4 celler androgen berøvet i 72 timer og derefter behandlet med vehikel (ethanol), et syntetisk androgen (R1881) eller AR antagonist flutamid. Celler blev fikseret 16 timer efter behandling og chip på chip-analyse blev udført for at identificere AR bundne promotorer. A. Antal AR bundet initiativtagere i hver behandlingsgruppe, og overlap mellem grupperne er vist i Venn-diagram. I hver behandlingsgruppe sekvensen af ​​promotoren sonde i arrayet blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​den klassiske AR responselementet (ARE) eller halv site. Vist er frekvenser på sekvenser indeholdende ARE eller halv websted findes i hver behandlingsgruppe og frekvensen i hver af proberne på arrayet (baggrund). En p-værdi på berigelse blev beregnet baseret på gruppe frekvens sammenlignet med baggrunden af ​​array ved hjælp af standard t-test. Indsat boks viser den klassiske AR responselementet sekvens. B. Tabel viser berigelsen af ​​ARE og halvdelen websted i overlap mellem grupperne. For hvert par af eksperimentelle betingelser hyppigheden af ​​ARE og halvdelen site er beregnet i overlappende initiativtagere og i alle initiativtagerne til begge grupper. P-værdi på berigelse i overlappende initiativtagere i forhold til alle initiativtagere er beregnet ved hjælp hypergeometriske fordeling. C. Co-immunfældning af AR og Sox9 i LAPC4 celler.

Genom-dækkende placering analyseresultater valideret ved anvendelse gen specifikke kromatin IP for otte af de ARB’er i alle tre behandlinger (se figur S2 og tal 2c). Kromatin IP blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder og PCR blev anvendt til at kvantificere mængden af ​​et specifikt DNA-fragment i den udfældede fraktion. Kvantificering af berigelse blev gjort i en beregningsmæssige fordomsfri metode. Vi brugte tre gange berigelse som vores bindende cutoff (baseret på PSA-promotor binding, se figur S2a). Vi har valideret bindende i otte genomiske steder, hver i nærvær af køretøjet, agonist eller antagonist. Ud af de 24 testede 18 betingelser viste sig at være bundet af AR i array’et. Ud af disse blev 16 også bundet af gen-specifikke IP. Derfor konkluderede vi, at i 16/18 (89%) testede promotor-betingelser, gen specifikke data bekræftede array-data indikerer en falsk positiv rate på 11%.

A. LAPC4 celler blev androgen berøvet i 72 timer og derefter behandlet med en syntetisk androgen (R1881), en AR-antagonist (flutamid) eller vehikel (ethanol) i 24 timer. Real-time PCR blev anvendt til at kvantificere mRNA niveauer af de angivne gener. Hver ekspressionsniveauet blev indstillet til GAPDH mRNA-niveau og vist som fold ændring fra køretøjet behandlet kontrol. Hver søjle repræsenterer mindst fire eksperimenter hver udført i tre eksemplarer. P-værdi blev beregnet ved anvendelse t-test, sammenlignet med vehikel behandling. B. Western blot-analyse viser COUP-TF1 og AR ekspressionsniveauer efter behandling med R1881 eller Flutamid i 48 timer. Hver behandlingsgruppe blev udført og vist i dubletter. C. Analyse af AR binding til kuppet-TF1 genomisk locus. LAPC4 celler blev androgen berøvet i 72 timer og derefter behandlet med en syntetisk androgen (R1881), en AR-antagonist (flutamid) eller vehikel (ethanol) i 16 timer. Chip med et anti AR antistof blev udført. PCR for de angivne områder omkring kuppet-TF1 transkriptionsstartsitet sammenlignet med ikke-bundet gen præsenteres for 3 folds fortyndinger af input og immunpræcipiteret fraktion. Berigelse af binding til hver region sammenlignet med en ikke-bundet promotor (GAPDH) kvantificeres under hvert billede. PCR for 5 ‘UTR af COUP-TF1 præsenteres i øverste panel (COUP-TF1 5’UTR), binding til kuppet-TF1 promotor præsenteres i midten panel og binding til en region opstrøms for promotoren (COUP-TF1 upstream) præsenteres i den nederste panel. D. Skematisk fremstilling af AR bindingssteder i det genomiske locus omgivende kup-TF1 TSS, vist i figur C. Green søjler repræsenterer områder analyseret for AR binding. Genomisk placeringer af AR bindende i tilstedeværelse af flutamid og R1881 er præget af grøn og orange trekanter henholdsvis.

Vores eksperimenter afslørede konstitutiv binding af AR til PSA-promotoren i overværelse af køretøjet, R1881 eller flutamid (figur S2a), som forventet [20]. Konstitutiv AR-binding blev valideret i flere andre gener, såsom de nye ARB’er

sox5

(figur S2b),

dock1

(figur S2C) og

slitrk3

(figur S2E).

IL1R2

er en hidtil ukendt ARB, bundet i nærvær af enten agonist eller antagonist, men ikke uden en ligand (tal S2F).

B3gnt5

promotor er bundet af AR kun ved tilstedeværelsen af ​​en agonist (figur S2d).

AR målgener er jævnt fordelt langs de forskellige kromosomer for alle testede ligander, som analyseres af Webgestalt [31] (figur S3).

Gene ontologi annotation (GO) blev udført for at finde funktionelle grupper, der er beriget inden ARB’er. I alle ligand indstillinger undersøgt, trods stor variation i målgener, de berigede kategorier, var disse kategorier, der er involveret i DNA binding og transskription aktivitet (tabel 1).

ER halv site er fremherskende i AR bindingssteder

vi kiggede for udbredelsen af ​​den kanoniske androgen anerkendelse element i ARB sæt identificerede vi, sammenlignet med alle 18,051 sonder på array. Vi lod i op til to fejlparringer i 15 bp androgen responselement (ARE) sekvens. ARE blev fundet i 4% af alle sonder på arrayet. Ved scanning er i de tre lister over ARB’er var der kun mild berigelse af ER i forhold til baggrunden i R1881 og flutamid grupper (figur 1a). Ved scanning er i initiativtagerne, der var bundet i to af de betingelser, i forhold til dens udbredelse i initiativtagerne til begge grupper, var der ingen yderligere berigelse (figur 1b). Tilsvarende resultater blev beskrevet af andre, både i AR bundet promotorer og AR bundne enhancere [16] – [18]. Således er vores resultater støtter den opfattelse, at den dogmatiske kanoniske ER websted ikke i sig selv, spiller en central rolle i AR rekruttering.

Dernæst spurgte vi, om er halvt stedet (5′-AGAACA-3 ‘) er beriget i nogen af ​​grupperne, uden fejlparringer. Den halve stedet blev søgt i ARB’er forhold til matrix baggrund. Den halve stedet er viste sig at være stærkt beriget i alle tre grupper af ARB’er (figur 1a). Deraf tidligere rapporteret halve websted, der er fremherskende i ARB’er i nærvær af en agonist [16] – [18] beriges også i nærværelse af en antagonist. Den halve websted er yderligere beriget med promotorer, der er bundet i to betingelser, sammenlignet med dens udbredelse i begge grupper sammen (figur 1b). Derfor vil der i de betingelser, undersøgte vi halv site er en universel anerkendelse element for androgen receptoren, uafhængigt af ligand.

Sox9 og OCT1 er formodede AR co-faktorer

En sekvensanalyse af ARB’er blev anvendt til at afsløre AR co-transkriptionsfaktorer, som kunne være almindeligt forbundet med det. For at søge anerkendelse elementer af kendte transkriptionsfaktorer vi brugte CIS [32] for at scanne ARB’er for tidligere definerede elementer af kendte transkriptionsfaktorer anerkendelse. De berigede elementer i hver gruppe af ARB’er kan ses i tabel 2. Blandt de elementer, hvoraf nogle, såsom OLT og forkhead familier af transkriptionsfaktorer, blev tidligere rapporteret at være involveret i AR aktivitet [17].

Vi fandt Sox9 element at være væsentligt beriget med ARB’er i alle tre testede betingelser. Specielt i flutamid behandlede gruppe af ARB’er Sox9 genkendelseselement blev fundet i 15% af ARB’er (p = 0,0003). Interessant Sox9 blev for nylig beskrevet som aktiv i prostata carcinogenese og embryogenese [33], [34] [35] og aktiveres som reaktion på androgen behandling i tidlige prostata udvikling [34]. Følgelig Sox9 og AR co-immunopræcipitat i LAPC4 celler (figur 1c). Tilsammen Vores data tyder Sox9 som en formodet AR co-faktor.

Vi ønskede yderligere at kigge efter nye motiver, som blev beriget med ARB’er gennem

de novo

motiv søgning. Weeder [36], en udtømmende

de novo

motiv søgealgoritme, afslørede motivet GCAAATCA at blive væsentligt beriget med agonist bundet gruppe, og yderligere analyse afslørede det at blive beriget i alle ARB grupper (tabel 3 øverste del ). Denne sekvens overlapper den kanoniske OCT1 anerkendelse element ATGCAAAT. Den kanoniske OCT1 anerkendelse element er også udbredt i vores liste over ARB’er men ikke så markant som GCAAATCA (tabel 3 nederste del).

ARB’er er placeret på AT-rige genomiske regioner

for yderligere at karakterisere de ARB’er vi beregnet GC indholdet af alle ARB’er, og sammenlignet det med arrayet baggrund GC-indhold. Overraskende fandt vi, at ARB’er er stærkt og signifikant AT rige. Indholdet af hele systemet GC er 54,3%, mens GC-indhold af agonisten og antagonist-ARB’er er 46,4% (p = 1,6 * 10

-13) og 48,5% (p = 3,4 * 10

-5 ), henholdsvis. For at bekræfte, at dette fænomen er ikke en selektionsbias af array, vi sammenlignet det med GC-indhold af MLL1 bundne prober, der blev offentliggjort anvendelse af den samme array [37]. MLL1 bundne prober indeholdt 56,1% GC, svarende til arrayet baggrund. For yderligere at validere dette resultat vi beregnet GC indholdet af tidligere offentliggjorte AR bundet initiativtagere. I Massie

et al.

Datasæt, der analyserede androgen bundet promotorer i nærvær af androgen [16] fandt vi et GC-indhold på 52,6% sammenlignet med 53,6% i hele systemet (p = 0,0004). For at fastslå, at dette ikke er et generelt fænomen transkriptionsfaktorer undersøgte vi den GC-indhold af p53 bindingssteder som reaktion på bestråling [38]. Indholdet af p53 bindingssteder GC er 55,7% sammenlignet med 52,5% for baggrunden. Derfor konkluderer vi, at AR har en tendens til at associere med AT rige initiativtagere.

AR binding til promotor ikke tilstrækkeligt til androgen regulering af tilstødende gener

For at vurdere relevansen af ​​AR binding til transskription vi målte mRNA ekspressionen af ​​flere ARB gener under de 3 forskellige androgen behandlinger, hvor de blev fundet at binde, ved hjælp af real time PCR. Som forventet viste nogle ARB’er forøget ekspression efter androgen behandling og nedsat ekspression ved tilsætning af antagonisten flutamid. Men andre ARB’er såsom DOCK1 og GLI3 ikke vise en androgen respons under testbetingelserne (figur 2a). COUP-TF1, som blev foreslået af vores genom-dækkende analyse at være bundet af AR i flere steder omkring transkriptionsstartstedet (TSS), reguleres negativt af androgen (figur 2a).

Syntaxin 6 ( STX6) er en vesikel transportør protein, der for nylig blev vist at blive reguleret af p53 og nødvendig for kræft celleadhæsion og overlevelse [39]. STX6 blev afsløret af vores genom-dækkende placering analyse at være bundet af AR i tilstedeværelse af enten R1881 eller flutamid. STX6 mRNA niveauer var lidt nedreguleret af R1881, selv om dette ikke nåede statistisk signifikans. Men STX6 var signifikant opreguleret ved flutamid (figur 2a).

Som forventet, den velkendte AR target PSA opreguleres ved androgen og ned reguleret af flutamid.

Således AR binding til promotor steder kan være forbundet med enten opregulering, nedregulering eller ingen ændring af transskription.

COUP-TF1 regulering af AR agonister og antagonister

Vi længere ønskede at spørge, om flutamid bundet AR har en funktionel transkriptionel rolle . For at besvare dette spørgsmål, vi valgte at fokusere på én flutamid aktiveret promotor – promotoren for kyllingeovalbumin Upstream Promotor – Transskription Factor 1 (COUP-TF1). Coup-TF1 er en forældreløs nukleare receptor, der fungerer primært som transskription repressor [40], [41]. Vores

in vivo

bindingsanalyse foreslog, at AR binder den genomiske sekvens opstrøms for transkriptionsstartsitet af kup-TF1 flere steder og 5′-utranslaterede region (UTR) i

kup-TF1

gen. For at undersøge reguleringen af ​​COUP-TF1 ved AR vi først yderligere valideret binding af AR til de genomiske sekvenser omgiver kuppet-TF1 transskriptionsstartstedet. I nærvær af AR antagonist flutamid AR er bundet i området 1-2 KB opstrøms i TSS, i kuppet-TF1 promotor og i 5′-UTR af genet. Men i tilstedeværelse af androgen AR binder området 1-2 kb opstrøms til TSS, men ikke den promotor eller 5’UTR (figur 2c og 2d).

Som beskrevet ovenfor, COUP-TF1 mRNA-niveauer er negativt reguleret af androgen og positivt reguleret af flutamid. Vi yderligere valideret denne observation på proteinniveauet ved western blot-analyse. COUP-TF1 proteinniveauer i LAPC4 celler ændrer ikke efter tilsætning af R1881 i 48 timer til androgen berøvede celler. Men i nærværelse af flutamid i 48 timer, Coup-TF1 proteinniveauer stige (figur 2b). Interessant samtidigt til opregulering af COUP-TF1, er AR-ekspression nedreguleres ved tilsætning af flutamid, hvilket viser en negativ feedback sløjfe af AR-aktivering i LAPC4 celler. Det kan konkluderes, som vist ved kvantitativ realtids-PCR og western blot-analyser, antagonist bundet AR positivt regulerer COUP-TF1 i LAPC4 celler.

COUP-TF1 udtrykkes i maligne prostata-epitelceller og ikke i normal prostata epitel

for at undersøge udtryk mønster af COUP-TF1 i human prostata og prostatakræft vi brugte immunhistokemi til at opdage COUP-TF1 i 28 humane tumorprøver. Vi har detekteret COUP-TF1 i den maligne epitel af 21 ud af 28 primære prostatakræft undersøgte prøver. Vi kunne ikke finde en sammenhæng mellem COUP-TF1 farvning og Gleason score eller recidiv i enten epitel eller stromaceller. Men vi fandt signifikant højere niveauer af COUP-TF1 farvning i neoplastisk prostata epitel og i de præmaligne prostata intraepitelialneoplasi (PIN) sammenlignet med farvning af tilstødende godartet prostata epitel (figur 3a og 3b). Dette antyder, at COUP-TF1 kunne spille en rolle i tidlige stadier af prostata tumorigenese. Interessant nok blev COUP-TF1 distribueres i epitelceller i en nucleolar fordeling, mens stromale celler, der omgiver de epiteliale neoplasi viste et nukleart mønster af farvning.

A. Immunhistokemisk farvning af human prostatacancer prøver og tilstødende godartede kirtler til COUP-TF1 viser en nucleolar fordeling af COUP-TF1 i maligne celler (øverst til venstre) og ingen COUP-TF1 farvning i den tilstødende godartet kirtel (nederst til højre). Stromaceller viser nuklear farvning af COUP-TF1. En repræsentant for 28 analyserede prøver er vist. B. prostata intraepitelialneoplasi (PIN) viser nucleolar fordeling af COUP-TF1 og tilstødende stromale celler viser nuklear farvning. C. immunfarvning af LAPC4 xenografter viser nucleolar COUP-TF1 farvning.

For at bekræfte COUP-TF1 antistofspecificitet vi har plettet LAPC4 xenografter for COUP-TF1 og fundet en nucleolar fordeling af COUP-TF1 ( figur 3c) svarende til fordelingen vist i human prostatacancer epitel. Western blot-analyse af disse celler med samme COUP-TF1 antistof afslørede et enkelt bånd på 46 KD, svarende til COUP-TF1.

For at validere den negative regulering mellem AR og COUP-TF1 i prostata vi brugte præpubertale Balb /c-mus. Præpubertale mus har et lavt testosteronniveau til tre uger, hvor niveauet stiger som musen når puberteten [42] – [44]. Vi undersøgte COUP-TF1 niveauer i prostata af mus på aldre 3, 5 og 7 uger. I overensstemmelse med vores observationer i humane prøver, var der ingen COUP-TF1 farvning i normal mus prostata epitel. Men vi var specielt interesseret i COUP-TF1 niveauer i prostata stroma (uro-genital mesenkym), på grund af den velkendte afgørende rolle, stromal AR i prostata udvikling [45], [46]. Stromale-celle COUP-TF1 niveauer faldt med muse alder (figur 4a). Konkret kunne vi se en negativ sammenhæng mellem AR og COUP-TF1 niveauer i enkelte prostata kanaler i alle dias undersøgte (sammenlign figur 4b og 4c). Disse resultater viser et omvendt forhold mellem AR aktivering og COUP-TF1 udtryk i normal prostata udvikling.

prostata fra pre pubertetsudvikling Balb /c mus på aldre 3, 5, blev 7 uger opnået, og en immunhistokemisk farvning for COUP- TF1 prædannedes. For hver aldersgruppe blev analyseret mindst 4 mus. A. stromal celle farvning for COUP-TF1 blev kvantificeret ved en patolog som procent af stromale celler farvet. Et gennemsnit af alle lapper blev beregnet for hver mus og anvendes til yderligere analyse. P-værdi blev beregnet ved anvendelse t-test sammenlignet med alderen 3 uger. B. En normal 3 uger gamle muse prostata blev farvet for AR og c. COUP-TF1. Serielle sektioner fra den samme kirtel er vist. Epitelceller er positive for AR og negativ for COUP-TF1. Peri-epitel stromaceller, mellem blå og gule linjer, er negative for AR og positive for COUP-TF1. Stromaceller fjernere fra kirtlen, mellem gule og grønne linjer, er positive for AR og negativ for COUP-TF1. Lignende omvendt korrelerede farvede mønstre blev set i alle slides undersøgte.

Diskussion

Overgangen af ​​prostatakræft til hormonrefraktær tilstand er et stort vendepunkt i udviklingen af ​​prostatakræft, og AR spiller en vigtig rolle i denne overgang. I øjeblikket bruges AR antagonister såsom flutamid og bicalutamid, påtage sig rollen som receptoragonister når sygdommen bliver hormon refraktær. Den første bevis på denne overgang fra antagonist til agonist blev udledt fra den kliniske observation, at prostatakræft patienter havde en 30% meningsfuldt svar til tilbagekaldelse af et steroid hormon antagonist som den første manøvre efter primær hormonbehandling fiasko [47]. Dette fænomen bedt forskerne at undersøge, hvordan AR-antagonist kan fungere som agonister i hormon refraktær prostatacancer. To undersøgelser viste, at i HRPC, AR-antagonister rekruttere coactivatorer (i stedet for co-repressorer) til AR bundet målgener PSA og KLK2 giver en mekanistisk forklaring på dette fænomen [19], [20]. Vi antager, at der ud over denne ændring finder sted på den enkelt mål gen-niveau, der er en global ændring i AR målgener, som kunne tilføje en anden forklaring på den klinisk observation. Til dette formål, vi først ønskede at sammenligne in vivo DNA binding af AR bundet til enten flutamid eller androgen.

Bindingen af ​​AR til DNA, selvom ligand afhængig, er ikke afhængig af co-aktivatorer. Efter induktion med flutamid, AR binder til PSA-promotoren. PSA-promotoren blev også vist i forskellige forsøg, der skal bindes af AR uden ligand (figur S2a), medens forstærkeren ikke binder ikke-ligerede AR [28]. Det fik os til at definere spektret af ARB’er mellem ikke-ligerede AR, agonist bundet AR (R1881) og antagonist ligand AR (flutamid).

I vores genom-dækkende placering analyse af AR målgener vi har opdaget initiativtagere, der er bundet konstitutivt med agonistisk ligand, antagonist ligand eller ingen ligand på alle (figur S2). Ingen af ​​de få gener, der blev anset for at være bundet kun i tilstedeværelse af køretøjet i henhold til vores

in vivo

bindende analyse blev valideret i gen specifikke kromatin immunpræcipitationsanalyse; det er derfor mindre sandsynligt, at ligandbindende inducerer AR dissociation fra kromatin.

Adskillige gener blev differentielt bundet af AR, i nærvær af agonisten eller antagonisten (figur 2c og figur S2d). For at vurdere virkningen af ​​AR bindende for transkription målte vi ekspressionen af ​​flere af disse ARB gener under 3 forskellige behandlingsbetingelser. Nogle af de konstitutivt bundne gener blev androgen reguleret (fx STX6 og PSA). Andre blev udtrykt i LAPC4 men ikke reguleret af androgen under de betingelser, som de binder. Derfor AR binding er ikke tilstrækkelig til transkriptionel aktivering af ARB’er eller androgen regulering. Det er sandsynligt, at yderligere betingelser der kræves, såsom rekruttering af co-aktivatorer, yderligere transkriptionsfaktorer eller histon modifikationer. Alternativt, AR kunne være ansvarlig for transkriptionsinitiering, men ikke for transkription forlængelse, som kræves til aktivt transkriberede gener [48].

Denne differentielle binding i nærvær af flutamid kan være af særlig betydning, når man overvejer antagonist til agonist konvertering i hormon refraktær prostatacancer. Det er rimeligt at antage, at disse gener kan let induceres ved overgangen til hormon ildfasthed da de allerede er bundet af en AR, og behøver kun at yderligere rekruttere co-aktivatorer og den basale transskription maskiner. Dette fund kunne også have terapeutisk betydning ved anvendelse af begrebet syntetisk letalitet:. Disse målgener, der kun aktiveres i flutamid behandlede celler kunne tjene som terapeutiske mål i kombination med flutamid

For at få oplysninger om AR aktivitet i androgenafhængig prostatacancer en bioinformatiske analyse af AR målgener blev udført. GO analyse af ARB’er antyder, at AR udøver sin cellulære virkning ved binding til promotorer af andre transkriptionsfaktorer i nærvær af alle de forskellige ligander (tabel 1). Dette antyder, at AR er en mester regulator af prostata epitelceller.

Næste vi kiggede for kendte og

de novo

motiver i ARB’er. Denne analyse kunne identificere transkriptionsfaktorer, der fungerer som co-regulatorer af transskription sammen med AR. Vores analyse viste en ikke-konsensus OCT1 motiv, der blev rapporteret tidligere at være involveret i AR transskription [49]. Analyse af alle kendte TRANSFAC motiver afslørede både Brachyury og Sox9 motiver at være stærkt beriget ARB’er af alle grupper (tabel 2).

Brachyuri er medlem af T-box protein familie, der i udstrakt involveret i embryogenese [ ,,,0],50], og selv om det blev rapporteret at blive udtrykt i prostata i skala udtryk stor analyser [51], og i flere prostatakræft-cellelinier [52], dens præcise rolle blev aldrig rapporteret.

Sox9, er en Sry-relateret gruppe på højt mobilitet (HMG) faktor, der tidligere blev rapporteret til at spille en rolle i prostata udvikling. Det udtrykkes på at udvikle prostata epitelial knopper med stærkeste udtryk i de distale tips af knopper. En alvorlig defekt i udviklingen af ​​den ventrale prostata blev observeret i Sox9 mutante dyr [53]. skal evalueres yderligere mulige rolle Sox9 som en AR co-regulator. Imidlertid blev kooperativ vekselvirkning af POU homeodomæneproteiner såsom Oct1 eller Oct4 med HMG faktorer såsom Sox9 eller SOX2 tidligere beskrevet [54], [55]. en.