PLoS ONE: Multiplexed Quantum Dot Mærkning af aktiveret c-Met Signalering i kastrationsresistent human prostatakræft

Abstrakte

Den potentielle anvendelse af multiplex kvantepunkt mærkning (MQDL) for kræft afsløring og prognose og overvågning terapeutiske reaktioner har tiltrukket interesse bioengineers, patologer og kræft biologer. Mange publicerede undersøgelser hævder, at MQDL er effektiv til kræft biomarkør opdagelse og nyttige i kræft diagnose og prognose, har disse undersøgelser ikke er blevet standardiseret over kvantitative biokemiske og molekylære bestemmelser. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi et molekylært karakteriseret human prostatacancer celle model udviser aktiveret c-Met signalering med epitelial til mesenkymale overgang (EMT) og dødbringende metastatisk progression til knogle og blødt væv som den gyldne standard, og sammenlignede c-Met-celle signalering netværk i denne model, i kliniske prostatacancer vævsprøver menneskelige og i en kastrationsresistent human prostatacancer xenograftmodel. Vi observerede c-Met signalering netværk aktivering, manifesteret ved øget phosphoryleret c-Met i alle tre. Downstream overlevelse signalering netværk blev medieret af NF-KB og Mcl-1 og EMT blev drevet af receptor aktivator af NF-KB-ligand (RANKL), på enkelt celle niveau i kliniske prostatacancer prøver og xenograft model. Resultater blev bekræftet ved real-time RT-PCR og western blots i en human prostatacancer celle model. MQDL er et kraftfuldt værktøj til vurdering af biomarkør udtryk og det giver molekylære indsigt i kræft progression på både celler og væv niveau med høj grad af følsomhed

Henvisning:. Hu P, Chu GC-Y, Zhu G, Yang H, Luthringer D, Prins G, et al. (2011) Multiplexed Quantum Dot Mærkning af aktiveret c-Met Signalering i kastrationsresistent human prostatakræft. PLoS ONE 6 (12): e28670. doi: 10,1371 /journal.pone.0028670

Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Oktober 21, 2011; Accepteret: November 12, 2011; Udgivet: December 21, 2011

Copyright: © 2011 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af forskningsbevillinger 2PO1CA098912 og 1RO1CA122602 af National Institutes of Health /National Cancer Institute, og prostatakræft Foundation Challenge Award (LWK Chung). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Semi-leder quantum dots (QDs) fluorescerende nanopartikler er blevet anerkendt som en af ​​de store nylige fremskridt for vores evne til at opdage relevante biomarkører udtrykt af celler, væv og sera [1], [2], [3 ], [4], [5]. De unikke optiske og elektroniske egenskaber af QDs medtage deres smalle og symmetriske emissionsbånd, størrelse-og materiale-afstemmelige lysemission, høj overflade til volumen-forhold, fotostabilitet, signal lysstyrke og følsomhed, og samtidig excitation af flere fluorescens farver gør det muligt at detektere flere mål samtidigt på enkelt celle niveau [3], [6]. Quantum dot mærkning QDL, er overlegen i forhold til konventionelle organiske farvestoffer til celler og væv farvning, især da sidstnævnte udbytte brede båndbredde med overlappende signal emissioner og er meget modtagelige for fotoblegning. Multiplexing biomarkører med forskellige farver tilvejebringer betydelige fordele frem for traditionelle organiske eller fluorescerende farvestoffer til påvisning og analyse af dynamiske ændringer i proteiner og nukleinsyrer i celler eller væv under patofysiologiske betingelser. QDL er blevet anvendt med held til påvisning af niveauerne af ekspression af gener

in situ

forbundet med vigtige biologiske processer såsom epitelial til mesenkymale overgang [6] i cancermetastase [7], protein biomarkører i blodet, tilstedeværelsen af nukleinsyrer, microRNA og DNA methylering i sera eller vævsekstrakter med prøver stregkodede for hurtig behandling af automatiserede protokoller [8], [9], [10]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi multiplekset kvantepunkt mærkning (MQDL) for at påvise den aktiverede c-Met-medieret celle signalvej fører til EMT, kræft vækst og knogler og blødt væv metastase i et hidtil ukendt prostatacancer metastaser model [11], [ ,,,0],12], [13]. Vi bekræftede niveauerne af genekspression vurderet ved MQDL med genekspression som bestemt ved RT-PCR og Western blotting. Vi anvendte derefter MQDL protokollen til at bestemme, om c-Met cellesignalering pathway og EMT aktiveres i en kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) dyremodel og i klinisk prostatacancer prøver opnået fra patienter med højt Gleason scores og knoglemetastaser. Vi observerede, at aktivering af c-Met er tæt knyttet til EMT i cancerceller og deres efterfølgende øget migration, invasion og metastase [14], [15], [16]. c-Met signal aktivering i human prostatacancer har vigtige kliniske implikationer: 1) c-Met nedstrøms signalering drev EMT og cancer cell migration, invasion, metastase og overlevelse i flere humane faste tumormodeller herunder prostatacancer [15], [17], [18], [19]. 2) Da målretning c-Met og VEGFR2 nedstrøms signalering med en syntetisk multipelt tyrosinkinaseinhibitoren, cabozantinib (XL-184), resulterede i en bemærkelsesværdig beslutning af knogle- og blødt væv metastaser i et stort antal patienter med solide tumorer, herunder CRPC patienter [20 ], [21], ville det være vigtigt at vise, om disse celle signalveje kan blive aktiveret i kliniske prøver og i relevante tumor xenograftmodeller. Vi anvendte en human prostatacancer-cellelinie til at påvise, at c-Met-aktivering giver EMT og prostatakræft knogle og blødt væv metastaser og undersøgt i dybden c-Met signaleringsaktivering ved molekylær analyser med resultaterne bekræftet af MQDL. Vi derefter anvendes MQDL at evaluere c-Met signaleringsaktivering i klinisk prostata cancer vævsprøver og korreleret resultaterne med en kastrationsresistent human prostatacancer xenograftmodel. Vi viste, at MQDL, kombineret med Vectra Image Analysis, forbedrer den kvantitative profilering evne af individuelle biomarkører på enkelt celle niveau. En række biomarkører forbundet med EMT, såsom nedsat ekspression af EpCAM, og forøget ekspression af N-cadherin, vimentin og RANKL, og c-Met signal aktivering, herunder VEGF, neuropilin 1, PC-Met og phospho (P) -NF -κB p65 [15], [22], blev analyseret. Resultaterne af disse undersøgelser viste en bemærkelsesværdig parallel EMT og c-Met-aktivering mellem prostatacancercelle model, den CRPC xenograft model og kliniske prostatacancer prøver. De metoder, der er etableret i den foreliggende undersøgelse kunne være af betydelig værdi i den nærmeste fremtid at karakterisere andre aktiverede signalveje i kliniske prøver, afhøre molekylære mekanismer underliggende kræft progression, identificere druggable mål, og følge op på klinisk respons af patienterne til terapeutisk intervention.

Materialer og metoder

Cell kultur og celle transfektion

LNCaP cellelinje, venligst leveret af afdøde Dr. Gary Miller fra University of Colorado (Denver, CO), var dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) suppleret med 5% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lowrenceville, GA), penicillin (100 ug /ml) og tetracyklin (100 U /ml) ved 37 ° C i fugtig atmosfære med 5% CO

2. Etableringen af ​​kloner der overudtrykker RANKL protein blev rapporteret tidligere [23]. Kort fortalt var en fuld-længde cDNA koder for humant RANKL fra OriGene (Rockville, MD) klonet ensrettet til p3 × flag- myc-CMV-25 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved Notl- og Xbal restriktionsenzymsteder. Efter transfektion af LNCaP-celler ved 75% konfluens med FLAG-mærket RANKL og neo plasmid under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) i en 6-brønds plade i 48 timer blev celler trypsineret og podet på en 15 cm skål. De stabile LNCaP-neo og LNCaP-RANKL celler blev underkastet G418-selektion (400 ug /ml) og enkelt celle kloner blev isoleret og holdt i 200 ug /ml G418 for RNA og protein-ekstraktion og immunoassay under anvendelse af 8 brønde kamre objektglas (Thermo Videnskabelige, Rochester, NY). Tre LNCaP-RANKL og 2 LNCaP-neo cellekloner blev selekteret. Siden deres biokemiske fænotyper var ens vi anvendte en klon af hver til undersøgelsen.

reverse transkriptase (RT) PCR

Totalt RNA fra celler blev isoleret under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Inc. ; Germantown, MD) ifølge producentens instruktioner. Komplementær DNA (cDNA) blev dannet ud fra 3 ug totalt RNA ved anvendelse SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen; 1 pi cDNA blev underkastet PCR-analyser ved anvendelse af følgende primere: RANKL F, 5′-TGG ATC ACA GCA CAT CAG AGC AG-3 ‘; RANKL R, 5′-TGG GGC TCA ATC TAT ATC TCG AAC-3′; E-cadherin F, 5’-GCC AAG CAG CAG TAC ATT CTA CAC G-3 ‘; E-cadherin R , 5’-GCT GTT CTT CAC GTG CTC AAA ATC C-3 ‘; N-cadherin F, 5′-GAT GTT GAG GTA CAG AAT CGT, N-cadherin R, 5′-GGT CGG TCT GGA TGG CGA-3′ ; vimentin F, 5′-GGA CTC GGT GGA CTT CTC, vimentin R, 5’-CGC ATC TCC TCC TCG TAG-3 ‘, c-Met F, TGGGAATCTGCCTGCGAA;. c-Met R, CCAGAGGACGACGCCAAA PCR reaktionscykler involverede en indledende denaturering ved 94 ° C i 10 minutter, 36 cyklusser ved 94 ° C, 1 min, 55 ° C, 30 sekunder, for RANKL72 ° C, 1 min efterfulgt af en endelig 72 ° C i 10 min extension for E-cadherin. og N-cadherin genamplifikation, PCR-reaktionerne løb for 32 cyklusser og annealing temperaturer var 55 ° C og 47 ° C, henholdsvis i 30 sek. til vimentin og GAPDH amplifikation, løb PCR-reaktionerne i 28 cyklusser med udglødningstemperaturer ved 48 ° C i 30 sek. De amplificerede PCR-produkter blev detekteret og analyseret på 1% agarosegel

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i RIPA-buffer indeholdende 1 × proteaseinhibitorcocktail (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). og centrifugeret, og supernatanterne blev opsamlet og kvantificeret under anvendelse af Bradford Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Cellelysaterne (20-30 ug) blev opløst på en 4-12% Bis-Tris gradient SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) under reducerende betingelser, efterfulgt af transblotting over på nitrocellulosemembran (BioRad Laboratories, Hercules, CA), og blokeret i 5% fedtfri mælk /PBST i en time ved stuetemperatur (RT) og inkuberet med fortyndet primære Abs i blokerende buffer ved 4 ° C natten over. Kilden og fortynding af primær Abs var: RANKL (sc-74.261, 1:400), E-cadherin (sc-7870, 1:1000), vimentin (sc-6260, 1:500), c-Met (SC- 10; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), N-cadherin (# 610.920, 1:200) (BD Transduction Laboratories, San Jose, Californien og Santa Cruz Biotechnology), p-Met (Tyr-1230 /34/35) (# 44888G; 1:500) (Invitrogen), p-NF-KB p65 (Ser536) (# 3033; 1:1000), NF-KB p65 (# 4764; 1:1000) (Cell Signaling Teknologi, Danvers, MA). Produktion og brug af androgen receptor antistof (PG21, 1:500) blev tidligere rapporteret [24]. Membranerne blev skyllet 3 × med PBST, inkuberet med peroxidase-konjugeret anti-muse eller anti-kanin sekundært Abs ved stuetemperatur i en time og skyllet 3 × med PBST. Signalerne blev visualiseret under anvendelse af ECL Plus-reagens (GE Healthcare Biosciences; Pittsburg, PA). Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific) blev anvendt før re-sondering med forskellige Abs.

In vivo eksperimenter

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med en godkendt protokol fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC # 2999, Cedars-Sinai Medical center, og A10-0100, University of British Columbia). LNCaP-RANKL og LNCaP-neo-celler (1 x 10

6 celler /50 pi PBS) blev inokuleret intracardialt i 5- til 7 uger gammel mand athymiske nøgne mus (Charles River, n = 20 for LNCaP-RANKL og n = 15 for LNCaP-neo). Alle mus blev regelmæssigt overvåget for metastatisk tumor dannelse, som først fandt sted ved 8 wks. Dyrene blev aflivet efter 12 wks.

prøver Prostatakræft væv

formalin-fikseret og paraffin-indstøbt (FFPE) menneskelige prostata cancer prøver blev indhentet fra Patologisk Institut for Cedars-Sinai Medical Center (IRB # Pro 00.021.228). Yderligere prostatakræft vævsprøver kliniske blev opnået fra Dr. Fouad Habib ved University of Edinburgh, Skotland, og Dr. Hua Yang på Jilin University, Kina. Anvendelse af kliniske prøver blev godkendt af de menneskelige væv institutionelle anmeldelse udvalg på de respektive institutioner.

CRPC implanteret

For at nedsætte arbejdsgrupper protokoller for enkelt og sekventiel multipel mærkning QD, vi valgte at bruge en LTL -313 CRPC xenograftmodel da det efterligner kastrationsresistent prostatacancer og giver ensartede og let tilgængelige multiple vævsprøver kritiske for udvikling og etablering af en ny MQDL protokol. FFPE væv fra en kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) LTL-313 (Living Tumor Laboratory, www.livingtumorcentre.com) xenograftmodel blev opnået fra Vancouver Cancer Center, BC Cancer Agency, Vancouver, Canada. LTL-313 tumor linje blev udviklet fra prostata nål biopsiprøve fra en 80-årig patient diagnosticeret med Gleason score 8 prostatacancer med et serum PSA-niveau på 17 ng /ml på tidspunktet for diagnosen [25]. protokol Tumoren line Udviklingen blev godkendt af Clinical Research Ethics Board fra University of British Columbia, i overensstemmelse med de forsøgsdyr retningslinjer for Institute of Experimental Animal Sciences (Human eksemplar brug var med godkendelser fra University of British Columbia, Canada (IRB # UBC BCCA REB # H04-60131). Kort fortalt at etablere kastrationsresistent prostatacancer, var friske LTL-313 tumorvæv fra 5. generation af podning skåret i 3 × 3 × 1 mm stykker og re-podet ind i subrenal kapsler af mandlige NOD-SCID-mus. dyrene blev opretholdt i tumordannelse i to måneder før kastration at fjerne androgener. Tre uger efter kastration, når tumorvolumenet blev reduceret signifikant, de resterende tumorvæv blev høstet og fremstillet som FFPE vævsblokke. Xenongraft væv anvendt i denne undersøgelse blev afledt fra 9 tumorer fra kastrerede mus og 5-tumorer fra 5 intakte muse værter suppleret med testosteron, der havde undergået proformaoperationsgruppen.

immunoassayreagenser

De primære antistoffer (Abs) og deres kilder var: mus monoklonalt Abs til humant EpCAM (VU-1D9) og RANKL (12A668) fra Novus Biologicals (St. Charles, MO); monoklonalt muse-Ab til c-Met (25H2) og kanin monoklonalt Ab til E-cadherin (24E10) fra Cell Signaling Technology; kanin polyklonalt Ab til androgen receptor, AR, (PG 21), leveret af Dr. Gail Prins fra University of Illinois (Urbana, IL); ged polyklonale Ab til neuropilin-1 (C-19), kanin-polyklonalt Abs til N-cadherin (H-63), Mcl-1 (S-19), p-NF-KB p65 (Ser 536), og VEGF (A -20) fra Santa Cruz Biotechnology, Inc .; og kanin polyklonale Ab til p-c-Met (pYpYpY1230 /1234/1235) fra Invitrogen. Sekundære Ab’er anvendt i undersøgelsen blev fremstillet i en cocktail af biotinyleret Ab’er til muse, kanin, og gede-IgG (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Phosphatbufret saltvand (PBS) og streptavidin-konjugeret QDs på 565-, 585-, 605-, 625-, 655- og 705 nm bølgelængder som 1 uM stamopløsning blev indkøbt fra Invitrogen.

Immunohistokemisk (IHC ) farvning

IHC fulgt vores offentliggjorte protokol [26] med mindre modifikationer. FFPE sektioner (4 um) blev deparaffineret, rehydreret, og underkastet antigen-genvinding. Efter inkubering i Dual Endogen Enzyme Block opløsning (Deeb, Dako, Carpinteria, CA) i 10 minutter, afsnittet blev behandlet med primært antistof fortyndet med Antibody Diluent opløsning (Dako) som følger: RANKL (1:100), c-Met ( 01:50), neuropilin 1 (1:100), androgen receptor (1:200), N-cadherin (1:100), Mcl-1 (1:100); p-NF-KB-p65 (Ser536) (1:100), VEGF (01:50) og pc-Met [pYpYpY1230 /1234/1235] (1:100), vimentin (1:100), og E-cadherin ( 1:200) ved 4 ° C natten over. Afsnittet blev derefter vasket 3 gange i PBST (PBS indeholdende 0,2% Tween 20) i 5 minutter per vask. For at detektere specifik farvning blev snit behandlet i 30 minutter med EnVision

+ Dual Link System-HRP (Dako), som indeholdt peberrodsperoxidase-konjugeret gede-antistoffer til mus og kanin Ig. Afsnittet blev vasket 3 gange i 5 minutter hver, og specifikke pletter blev udviklet med 3,3′-diaminobenzidin (Dako).

Single QD Mærkning (SQDL)

IHC farvning protokol var modificeret til enkelt QD mærkning. Streptavidin-konjugeret QDs (565-, 585-, 605-, 625-, 655- og 705 nm) blev fremstillet som 10 nM i PBS med 6% IgG-fri, protease-fri BSA (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) . Antigen udtagne væv eller faste celleprøver blev inkuberet i PBS indeholdende 2,5% hesteserum (Vector Laboratories) og 20% ​​Streptavidin Block Reagent (Invitrogen) i 20 minutter, efterfulgt af behandling med primære Abs som beskrevet ovenfor i afsnittet ovenfor immunoreagenser i PBS plus 1% hesteserum og 20% ​​Biotin Block Reagent (Invitrogen) ved 4 ° C natten over. Efter en 3 x 5 min PBST (PBS + 0,4% Triton X-100) skylning prøver blev inkuberet med det sekundære Ab cocktail ved stuetemperatur i 30 minutter og derefter inkuberet med det respektive streptavidin-QD ved 37 ° C i 60 minutter. Ved afslutningen af ​​hver inkubation blev prøverne underkastet rutinemæssig 3 × 5 min PBST (PBS + 0,4% Triton X-100) skylning. Efter den sidste skylning, blev objektglassene monteret i vandige monteringsmuligheder medier indeholdende 4’6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories) til billeddannelse. De Ab fortyndinger blev beskrevet i IHC afsnittet ovenfor.

Multipleksede QD Mærkning (MQDL)

Den fælles protokol QD mærkning blev modificeret til MQDL, hvor en enkelt vævssnit blev udsat for farvning for flere markører i en sekventiel måde. For hver biomarkør test, mærkning startede med et streptavidin blokering, efterfulgt af primær Ab reaktion og biotinyleret sekundært Ab inkubation og omsætning med streptavidin-konjugeret QD ved en specificeret bølgelængde. Snit blev inkuberet sekventielt (med en 3 x 5 min PBST skylning efter hver inkubering). Primære Abs og fortyndinger i MQDL var identiske med dem, der anvendes til SQDL. Immunreaktionen sekvenser var: 1) Anti-neuropilin-1 Ab, 2 timer, stuetemperatur; biotinyleret heste-anti-gede-IgG, ved stuetemperatur, 30 min; streptavidin-QD705, ved 37 ° C, 1 time. 2) Anti-p-c-Met Ab, ved 4 ° C, natten over; biotinyleret heste-anti-kanin-IgG, ved stuetemperatur, 30 min; streptavidin-QD655 ved 37 ° C, 1 time. 3) Anti-VEGF Ab, ved stuetemperatur, 2 timer; biotinyleret heste-anti-kanin-IgG, ved stuetemperatur, 30 min; streptavidin-QD625 ved 37 ° C, 1 time. 4) Anti p-p65-NFKB Ab ved 4 ° C natten over; biotinyleret heste-anti-kanin-IgG ved stuetemperatur, 30 min; streptavidin-QD565 ved 37 ° C, 1 time. 5) Anti RANKL Ab ved stuetemperatur, 2 timer; biotinyleret heste-anti-muse-IgG ved stuetemperatur, 30 min; streptavidin-QD585 ved 37 ° C, 1 time. 6) Montering i vandige montering medier indeholdende DAPI. Ab koncentrationer blev beskrevet i IHC sektion. Sektioner af FFPE LNCaP-RANKL human prostatacancer-celler blev anvendt som positiv kontrol. For negativ kontrol blev primære Abs erstattet med isotype- og arter-matched kontrol Abs og anvendes på en umiddelbart tilstødende vævssnit, og MQDL blev udført parallelt med vævet slide mærket med test primære Abs.

Billede erhvervelse

En CRi spektral billeddannende system (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) med indbyggede Nuance v3.1 software blev brugt til at dokumentere multispektrale billeder efter producentens anbefalede protokol. For hvert felt af kræft væv, blev serielle billeder erhvervet ved en 10 nm bølgelængde interval 450-800 nm, et interval vælges svarende til det aktive fluorescerende QDs. Det genererer et ubehandlet billede “cube” som en stak af 36 separate billeder med hvert billede indeholder det komplette spektral information for hver pixel på det givne bølgelængde. Alle billeder blev erhvervet ved 400 × forstørrelse, med en 50 millisekunder eksponering. For at undgå variationer i mærkning på grund af celle heterogenitet blev fem billeder fra forskellige ondartede væv sites taget for hver vævsprøve til efterfølgende kvantificering.

Billede Dekonvolution

Billede udfoldning eller unmixing protokol blev brugt til at udvinde specifik mærkning af en specificeret QD. En spektral bibliotek til 565, 585, 605, 625, 655, og 705 nm blev bygget til udfoldning af performimg flere SQDLs hjælp androgen receptor (AR) antistof uden endelig DAPI modfarvning på serielt tilstødende vævssnit. Den positive mærkning af AR blev bekræftet ved parallel IHC farvning på tilstødende væv. Spektret af DAPI blev opnået ved at montere det tilstødende væv i det vandige montering medium indeholdende DAPI. Spectra væv autofluorescens blev erhvervet for hver væv fra en negativ kontrol dias (se MQDL afsnit) udarbejdet af IHC uden fluorescerende markører. reduktion autofluorescens blev udført ved hjælp af Fast Komponentanalyse plug-in software. Den spektrale bibliotek blev derefter anvendt til at unmix terningen. De separate spektrale bidrag til data “terning” er udsendt som udpegede farvede intensitet kort. Disse billeder repræsenterer distributionen af ​​hver af de QDs og autofluorescens i vævet. Efter udfoldning af billederne, var mærkningen baggrund filtreret og kun de sande positive signaler blev vist på billederne af figurerne præsenteret.

Signal Kvantificering

Den spektrale bibliotek blev brugt til at deconvolute den imaging terning til at udtrække mærkning af individuelle QD hjælp inForm v1.3 software (Caliper) efter den anbefalede strategi. Først blev et træningssæt bestående af to klasser af væv skabt: “kræft” og “ikke-cancer”. Softwaren blev uddannet på disse områder ved hjælp af spektre af både DAPI kontrastfarve og multiplex QD immunolabeling og testet på 50 tilfældigt udvalgte celler fra hvert billede for at bestemme nøjagtigheden af ​​differentiere de to klasser. Denne proces blev gentaget, indtil yderligere iterationer ikke længere forbedret nøjagtigheden. Histologiske H /E billeder blev derefter anvendt til at lokalisere kræftceller baseret på nuklear mærkning DAPI. En indbygget algoritme blev derefter anvendt til at definere den cytoplasmiske vs. nukleare subcellulære regioner. Baseret på en analyse af billeder på 400 × forstørrelse, de optimale tærskel indstillinger tilnærmet: fast skala 200, minimum blob størrelse 20, maksimal blob størrelse 10.000, cirkularitet tærskel 0, kant skarphed 0, fylde hullet aktiveret (nukleare parametre); indre afstand til Nucleus 1, ydre afstand til Nucleus 7, minimum cytoplasma prøvestørrelse 1, minimum signal område 0, maksimal signal rækkevidde 65535 (cytoplasmatiske parametre). For at eliminere ikke-specifikke signaler ved den angivne spektrum, idet en acellulær område inden analyseret blev anvendt som baggrund mærkning. QD fluorescensintensitet i hver celle blev eksporteret til et Excel-regneark (Microsoft, Seattle, WA) og udsat for statistisk analyse [27], [28].

Resultater

Udvikling af en kvantitativ QD mærkning protokol til vurdering af genekspression forbundet med aktiveringen af ​​c-Met-signalering og EMT i dyrkede humane LNCaP-celler, der stabilt tansfected med RANKL

LNCaP knogle og blødt væv metastaser model: En hidtil ukendt LNCaP knoglemetastaser model blev udviklet ved stabil transfektion af denne cellelinje med RANKL (LNCaP-RANKL), som driver EMT i de transficerede celler. Når RANKL overudtrykker LNCaP-celler blev injiceret intracardialt i mus de udviste en øget forekomst af knogle- og blødt væv metastaser (tabel 1).

Validering af aktiverede c-Met signaling komponenter, der fører til EMT af RT- PCR, Western blot og Single Quantum Dot mærkning, SQDL: Sammenligning af genekspression mellem stabil LNCaP-neo kontrol og LNCaP-RANKL celler under anvendelse af RT-PCR og Western blot viste tegn på aktiveret c-Met signalering gennem forøget ekspression af c-Met, PC-Met, og p-NFKB p65 (figur 1). Cellerne undergik morfologiske (Panel A) og biokemiske (Paneler B og C) epitelial til mesenkymale overgang, med nedsat intercellulær adhæsion medieret af E-cadherin og EpCAM, og øget N-cadherin, vimentin og RANKL. Disse vurderinger af c-Met signalering aktivering og EMT blev udsat for SQDL analyser med en særlig indsats for at bekræfte, hvis c-Met aktivering og EMT fandt sted i denne celle model af prostatakræft progression. SQDL bekræftet, at i sammenligning med kontrol LNCaP-neo-celler (figur 2A), LNCaP-RANKL celler (figur 2B) var aktiveret c-Met signalering som afsløret ved en forhøjet ekspression af RANKL, c-Met, pc-Met og p-NFKB p65 og dokumentation for EMT, et cadherin switch af forhøjet udtryk for N-cadherin, vimentin og RANKL men faldt ekspressionen af ​​E-cadherin og AR. Kvantitative analyser (figur 3) på 1.000 tilfældigt valgte cancerceller ved inForm software (Caliper) støttede billeddata hvor både AR og E-cadherin ekspression blev drastisk faldt og aktiverede c-Met signalering komponenter førte til EMT, såsom forhøjet ekspression af c-Met, pc-Met, p-NFKB p65, blev N-cadherin, vimentin, og RANKL observeret i LNCaP-RANKL, sammenlignet med LNCaP-neo-celler. Denne kvantitative SQDL protokol blev vedtaget for genekspression analyser af en etableret CRPC LTL-313 xenograftmodel.

RANKL-transficeret LNCaP celler induceret EMT i histomorphology (A) og genekspression i mRNA (B) og protein (C ). Data repræsenterer en af ​​3 RANKL-stabilt transficeret og 2 neo-stabilt transficeret LNCaP-cellekloner.

Differential QD mærkning af proteiner blev udført i LNCaP-neo (A) og LNCaP-RANKL (B) celler hjælp DAPI kernefarvning som reference. For hver analyse, QD mærket protein udtryk præsenteres i pseudofarve med overlejret billede af DAPI og QD-signaler (fusioneret). × 400.

Cell-baserede gennemsnitlige intensitet tæller fra 1000 hver af neo og RANKL-transficeret LNCaP kloner blev kvantificeret ved hjælp inForm software. Statistisk signifikante ændringer i proteinekspression blev observeret (

P

0,05)

Validering af c-Met signalering aktivering og EMT i CRPC LTL-313 model med resultater bekræftes af. IHC og SQDL

for at forstå den kliniske betydning af c-Met signalering aktivering og EMT i LNCaP-RANKL model og de tilhørende stigninger i prostatakræft metastaser, definerede vi c-Met signalvejen og EMT i en CRPC LTL-313 xenograftmodel opnået fra Living Tumor Laboratory (livingtumorcentre.com). Vi inkluderede yderligere c-Met signalering forbundet gener såsom neuropilin-1, VEGF, p-Akt, VEGFR2, Mcl-1 og AR, der blev karakteriseret som mediatorer af c-Met downstream overlevelse signalering [15], [21], [ ,,,0],29], [30]. Figur 4 viser, at øget c-Met signaling-associerede gener og nedsat AR ekspression i CRPC LTL-313 xenotransplantater holdes i kastrerede værter, som vurderet ved IHC (Panel A) og SQDL (Panel B) sammenlignet med de xenotransplantater holdes i intakte mus med androgen tilskud.

c-Met aktiveret og blev påvist EMT associerede proteiner i CRPC LTL-313 xenograft model ved konventionel IHC (A) og SQDL (B). Kastration steg et panel af gener i LTL-313 xenograft prostatacancer og nedsat AR ekspression sammenlignet med xenotransplantater opnået fra intakte værter ved både IHC og SQDL. × 400.

MQDL analyse viste aktiveret c-Met og EMT i en CRPC LTL-313 xenograftmodel og primære og metastatiske menneskelige prostata cancer vævsprøver. En række humane prostata cancer-xenotransplantater opnået fra Living Tumor Laboratory blev brugt til at teste den kvantitative MQDL protokollen. Vi valgte LTL-313 model for denne opgave, fordi denne model udviser CRPC karakteristika med en tilbøjelighed til primært lymfeknude, lunge- og levermetastaser med sjældne knoglemetastaser, når tumorerne er implanteret og dyrket under de renale kapsler. Vi testede hypotesen om, at tumorer dyrket hos kastrerede mus ville udvikle kastration modstand og har aktiveret c-Met signalering fører til EMT, sammenlignet med tumorer dyrket i mus suppleret med exogent androgen (figur 5A). blev taget tre metoder: 1) at etablere en robust MQDL protokol til at detektere og kvantificere et panel af gen udtryk på CRPC LTL-313 model vævsprøve med resultater sammenlignet med SQDL; 2) at bruge denne etableret kvantitative MQDL protokol for at bekræfte, om aktivering af c-Met og EMT forekommer i CRPC LTL-313 væv opretholdt i de kastrerede værter; og 3) ved den standardiserede MQDL protokollen til at demonstrere aktiveringen af ​​c-Met og EMT induktion i både primære og skelet metastatiske humane prostatakræft væv. Figur 5B viser den kvantitative MQDL analyser af neuropili-1, PC-Met, VEGF, p-NFKB p65, og RANKL, tidligere rapporteret at være associeret med c-Met signal aktivering [15], [22] og EMT [26], [31] i humane prostata kræftceller og i CRPC LTL-313 model. Vi viste aktiveret c-Met-signalering og EMT, som udvises af forøget ekspression af neuropilin-1, VEGF, og RANKL-proteinet og aktivering af PC-Met og p-NFKB p65 i CRPC LTL-313 tumor model med højere ekspression og aktivering af disse gener i LTL-313 tumorxenoplantater holdes kastrerede forhold til intakte mus. Som en intern kontrol for at minimere eventuel fluorescens interferens af flere QD prober, udførte vi MQDL side om side med den SQDL protokollen (se ovenfor). Den forhøjede ekspression af de 5 undersøgte gener viste sig at være statistisk signifikant ved kvantitative infom analyser (figur 5B). Vi bestemt dette panel af 5 gener i primær prostatakræft prøver med forskellige Gleason score og fandt, at ekspressionen af ​​neuropilin-1, VEGF, pc-Met, RANKL, og p-NFKB p65 var mere ophøjet i dårligt differentierede (Gleason score 10) end moderat differentieret (Gleason score 7, 3 + 4) prostatacancer (figur 6). Disse resultater taget sammen, bekræftede, at QD mærkning er meget følsom og alsidig og kan bruges til multipleksing genekspressionsprofiler i forsøgsmodeller på enkelt celle niveau.

Single tumor vævssnit fra intakte og kastrerede værter blev udsat til sekventiel MQDL. Forøget ekspression af c-Met aktiverede gener blev detekteret i tumorvæv fra kastrerede værter. (A) En stak af flere billeder (terning), nuklear farvning (DAPI), og individuel genekspression (i pseudocolors) er vist. Genekspression signaler blev overlejret med DAPI nukleare signaler for at give et sammensat billede til analyse. × 400.