PLoS ONE: Ataksi-Telangiectasia Gruppe D Som supplement Gene (ATDC) Fremmer Lung Cancer Cell Proliferation ved Aktivering NF-KB Pathway

Abstrakt

Tidligere undersøgelser foreslog Ataksi-telangiectasia gruppe D supplere gen (ATDC) som et onkogen i mange typer af kræft. Men dets udtryk og biologiske funktioner i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) fortsat uklare. Heri undersøgte vi dens ekspressionsmønster i 109 tilfælde af humane NSCLC prøver ved immunohistokemi og fandt, at ATDC blev overudtrykt i 62 af 109 NSCLC prøver (56,88%). ATDC overekspression korreleret med histologisk type (p 0,0001), tumor status (p = 0,0227) og histologisk differentiering (p = 0,0002). Dernæst vi overudtrykt ATDC i normalt humant bronchieepithelceller cellelinje HBE og forarmet sit udtryk i NSCLC cellelinjer A549 og H1299. MTT og kolonidannelse assay viste, at ATDC overekspression fremmet celledeling, mens dens udtømning hæmmede cellevækst. Desuden viste cellecyklusanalyse, at ATDC overekspression faldt procentdelen af ​​celler i G1-fasen og forøgede procentdelen af ​​celler i S-fase, mens ATDC siRNA behandling steg procentdelen G1-fasen og reducerede fase procentdel S. Yderligere undersøgelser afslørede, at ATDC overekspression kunne opregulere cyclin D1 og c-myc ekspression i HBE-celler, mens dens udtømning nedreguleret cyclin D1 og c-myc-ekspression i A549 og H1299-celler. Desuden blev ATDC overekspression også forbundet med en forøget proliferation index, cyclin D1 og c-myc ekspression i humane NSCLC prøver. Yderligere forsøg viste, at ATDC opreguleret cyclin D1 og c-myc-ekspression uafhængigt af wnt /β-catenin eller p53 signalvej. Interessant ATDC overekspression øget NF-KB reporter luciferaseaktivitet og p-IKB proteinniveauet. Tilsvarende NF-KB inhibitor blokerede virkningen af ​​ATDC på opregulering af cyclin D1 og c-myc. Afslutningsvis viste vi, at ATDC kunne fremme lungekræft spredning via NF-KB induceret opregulering af cyclin D1 og c-myc

Henvisning:. Tang ZP, Dong QZ, Cui QZ, Papavassiliou P, Wang ED Wang EH (2013) Ataksi-Telangiectasia Gruppe D som supplement Gene (ATDC) Fremmer Lung Cancer Cell Proliferation ved Aktivering NF-KB Pathway. PLoS ONE 8 (6): e63676. doi: 10,1371 /journal.pone.0063676

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: November 15, 2012; Accepteret: April 7, 2013; Udgivet: 12 juni 2013

Copyright: © 2013 Tang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud 81071905 og 81272606). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er en af ​​de førende årsager til alle cancerrelaterede dødsfald på verdensplan og især ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) udgør hovedparten af ​​de diagnosticerede tilfælde [1], [2] . Flere faktorer, herunder genetiske, epigenetiske og microenvironmental, spiller en vigtig rolle i overlevelsen og kolonisering af tumorceller på et fjernt vævssted, hvilket fører til metastase [3]. Trods mange eksperimentelle undersøgelser, en underliggende molekylære mekanisme, der regulerer metastase af individuelle tumorer er endnu ikke fuldt forstået. På grund af den begrænsede succes konventionelle behandlinger for at opnå en overlevelse i patienter med lungecancer langsigtet, har været fokuseret forskningsindsats på de biologiske veje er involveret i tumor progression og neoplastisk celle overlevelse for at identificere potentielle terapeutiske mål [4].

Ataksi-telangiectasia gruppe D supplere gen (ATDC) er medlem af den tredelte motiv (TRIM) familie [5]. TRIM proteiner har typisk en række konserverede domæner herunder flere zinkfinger motiver og en leucin-zipper-motiv. Disse proteiner er blevet demonstreret at deltage i cellevækst regulering og udvikling og er blevet impliceret i adskillige humane sygdomme, såsom HIV-infektion og leukæmi [6], [7]. Især TRIM proteiner, såsom TRIM8, TRIM22, TRIM38 og TRIM40 er blevet rapporteret til at engagere sig i regulering NF-KB-aktivering [8] – [11]. ATDC, også kendt som TRIM29, blev oprindeligt identificeret i en søgning for genet ansvarligt for genetisk lidelse ataxia-telangiectasia og viste sig at besidde radiosensitivitet suppressor-funktioner [12]. Efterfølgende undersøgelser viste, at ATDC blev overudtrykt i flere typer cancer, herunder pancreas, mave, blære, colorectal, ovarie- og endometriale cancere, såvel som i plasma celle myeloma [13] – [21]. Betragtninger, blev sit udtryk tilsyneladende reduceret i flere andre tumorer, såsom melanom, bryst-, prostata-, hoved og hals kræft [22] – [27]. Kun én rapport beskrevne forøget ATDC-mRNA-ekspression i association med høj histologisk kvalitet, stor tumorstørrelse, grad af tumorinvasion og lymfeknudemetastaser i gastrisk cancer [15]. Men til vores bedste overbevisning, det protein udtryk for ATDC og dets forhold til klinisk-patologiske faktorer i primær lungekræft er aldrig blevet karakteriseret.

En nylig undersøgelse i en pancreas adenocarcinom cellelinje viste, at ATDC interagerer med Disheveled -2 og komponenterne af β-catenin ødelæggelse kompleks at stabilisere β-catenin og aktiverer Wnt signalering, en afgørende pathway, der fremmer tumorprogression i mange typer cancer [13]. Andre undersøgelser antydet, at ATDC binder p53 i cytoplasmaet at vil binde det fra kernen resulterer i nedregulering af dets målgen p21 [28]. I A431 humane pladecarcinom cellelinje blev ATDC noteret for at interagere med den intermediære filament protein vimentin og med en inhibitor af proteinkinase C, og ville dermed være en bestanddel af proteinkinase C-signaltransduktionsvej [29]. Tilsammen disse tidligere undersøgelser antyder, at ATDC kan fungere som et onkogen at fremme cancercelleproliferation og invasion. Men de biologiske roller ATDC i lungekræft celler er endnu ikke fastlagt,.

For at løse ovenstående spørgsmål, tjekket vi ATDC udtryk og vævsfordeling i ikke-småcellet lungekræft ved immunhistokemi og analyseret sit samarbejde med klinisk-patologiske parametre. Vi undersøgte også roller ATDC på celledeling og cellecyklus progression hjælp GAIN- eller tab-af-funktion tilgange. Endnu vigtigere, vi udforskede potentiel mekanisme, hvormed ATDC funktioner til at fremme udbredelsen af ​​lungekræft celler.

Metoder

Patienter og Prøver

Denne undersøgelse blev foretaget med godkendelse af den institutionelle gennemgang bord på Kina Medical University. Skriftligt samtykke blev givet af deltagerne for deres oplysninger, der skal lagres i databasen i deres enheder, der skal anvendes i denne undersøgelse hospital. Og al klinisk undersøgelse er blevet udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen. De primære tumor prøver blev indsamlet fra 109 patienter med planocellulært karcinom (SCC) eller adenocarcinom i lungerne, som blev komplet kirurgisk resektion i First Affiliated Hospital i Kina Medical University mellem 2001 og 2004. Stor celle karcinom, adenosquamøst celle karcinom eller anden NSCLC undertyper blev udelukket fra denne undersøgelse. Opfølgning oplysninger blev opnået ved at gennemgå patienternes journaler. Ingen af ​​patienterne havde modtaget strålebehandling eller kemoterapi før kirurgisk resektion, og alle patienter blev behandlet med rutinemæssig kemoterapi efter resektion. Alle 109 sager blev revideret til histologisk undertype, differentiering, og tumor stadie. Den histologiske diagnose og kvalitet blev vurderet på hæmatoxylin og eosin-farvede snit i henhold til World Health Organization (WHO) retningslinjer for klassificering. Af 109 tilfælde, 46 (42,2%) var SCC og 63 (57,8%) var adenocarcinom. Lymfeknudemetastaser blev identificeret i 44 (40,4%) af de 109 patienter. Den p-TNM af Den Internationale Union mod Kræft (7. udgave) blev anvendt til at klassificere sager.

Cell Kultur og behandling

NHBE, A549, H1299, H157 og H460-cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). LH7 og LK2 cellelinjer blev indkøbt fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. Den BE1 cellelinje blev tilvejebragt som en gave af Dr. J Zheng (Patologisk Institut, Peking University School of Medicine). Den BE1 cellelinje blev etableret af Dr. J Zheng og Dr. WY Zhu i 1995 og nu kunne købes fra nationale platform for Eksperimentel Cell Ressourcer for Sci-Tech (Peking, Kina). Celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt kalveserum. Celler blev dyrket på sterile vævsdyrkningsskåle og blev passeret hver 2 dage ved hjælp 0,25% trypsin (Invitrogen). NF-KB-inhibitor BAY 11-7082 (10 uM, 6 timer) blev købt fra Sigma Aldrich.

Immunhistokemi

Kirurgisk udskårne tumor prøver blev fikseret med 10% neutral formalin, indlejret i paraffin og 4 um tykke snit blev fremstillet. Immunfarvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-kompleks-metoden (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Kina). Snittene blev afparaffiniseret med xylen, rehydratiseret med gradueret alkoholserie og kogt i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i 2 minutter i en autoklave. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved anvendelse af hydrogenperoxid (0,3%) før inkubering af sektionerne med normalt gedeserum for at reducere ikke-specifik binding. Vævssnit blev derefter inkuberet med ATDC kanin-polyklonalt antistof (1:150 fortynding) (cat.17542-1-AP, Proteintech, IL, USA). Kanin immunoglobulin (ved den samme koncentration af antigenet specifikt antistof) (cat.NC-100, Maixin, Fuzhou, Kina) blev anvendt som en negativ kontrol. Immunhistokemisk farvning for Ki67 (1:200 fortynding) (cat.MAB-0129, Maixin, Fuzhou, Kina), c-myc (1:500 fortynding) (cat.ab32, Abcam) og cyclin D1 (1:100 fortynding) ( cat.2978, cellesignalering teknologi, Boston, MA, USA) blev også udført efter producentens anvisninger. Farvning for alle primære antistoffer blev udført ved stuetemperatur i 2 timer. Biotinyleret gede-anti-muse-serum-IgG eller biotinyleret gede-anti-kanin-serum-IgG (klar-til-brug) (cat.KIT-9922, Maixin, Fuzhou, Kina) blev anvendt som det andet antistof. Efter vask blev sektionerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret streptavidin-biotin, efterfulgt af 3, 3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid at udvikle peroxidase reaktion. Kontrastfarvning blev gjort med hæmatoxylin, og sektionerne blev derefter dehydreret med ethanol, før de monteres.

To efterforskere uafhængigt evalueret alle tumor dias. Fem tilfældige felter blev undersøgt per dias, og 100 celler blev vurderet pr høj forstørrelse felt (400 ×). Normal bronkieepitel i tumorsnit blev anvendt som en intern negativ kontrol. Immunfarvning af ATDC blev scoret efter en semikvantitativ skala ved at evaluere farvning intensitet og procentdelen af ​​celler i repræsentative tumorområder sammenlignet med den observeret i kontrolcellerne. Positiv immunfarvning blev defineret som et særskilt cytoplasmatisk farvning af tumorcellerne. Intensiteten af ​​ATDC cytoplasmatisk farvning blev yderligere stratificeret som 0 (ingen farvning), 1 (svag) og 2 (stærk). Procent scoringer blev betegnet som 1 (1-25%), 2- (26-50%), 3 (51-75%) og 4 (76-100%). Pointene for hver tumor prøve blev multipliceres for at give en endelig score fra 0 til 8 og den samlede ekspression af ATDC blev bestemt som enten negativ eller lav ekspression (-), hvis den samlede score var 4, og som positiv ekspression eller høj udtryk (+), hvis den samlede score var ≥4.

immunhistokemisk farvning for Ki-67 blev vurderet og scoret som en procentdel af de immunoreaktive kræftceller, med i alt 500 tumorceller undersøgt pr dias. Medianværdien af ​​denne serie (35%) blev anvendt som en tærskelværdi for at stratificere tumorerne ind i gruppen med en lav ( 35%) indeks og den ene med en høj (≥35%) indeks for celleproliferation. Ekspressionen af ​​c-myc og cyklin D1 blev defineret som højt udtryk eller lavt niveau i henhold til de tidligere kriterier [30], [31].

kvantitativ real-time PCR (SYBR Green Method)

Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse SYBR Green PCR Master mix med et samlet volumen på 20 pi i 7900HT Hurtig real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktionen betingelse er som følger: 95 ° C i 30 sekunder, 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. En dissociation trin blev påført til at generere en smeltekurve for at bekræfte specificiteten af ​​amplifikationen. p-actin-transskripter blev amplificeret og tjente som reference. De relative niveauer af genekspression var repræsenteret ACt = Ct-gen -Ct reference, og folden ændring af genekspression blev beregnet med 2-ΔΔCt metode. Eksperimenter blev udført tre gange

primersekvenserne var som følger:.

β-actin fremad, 5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3 ‘, β-actin omvendt, 5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′ ; ATDC frem, 5’-GCACCGGACACCATGAAGA-3 ‘, ATDC omvendt, 5′-GGAGACGAGGGCTGGTATGA-3’.

Western blot analyse

I alt proteiner fra NSCLC væv og lungekræft cellelinier blev udvundet i lysepuffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og kvantificeret under anvendelse af Bradford-metoden. Halvtreds mikrogram protein blev separeret ved SDS-PAGE (12%). Efter overførsel blev det polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende antistoffer: ATDC (1:1000; cat.17542-1-AP, Proteintech), β- actin (1:500, cat.612657), β-catenin (1:1000; cat.610154) (BD Transduction Laboratories), cyklin A2 (1:1000, cat.4656S), cyclin D1 (1:1000; kat. 2978), cyclin E1 (1:800; cat.4129), CDK2 (1:1000; cat.2546), CDK4 (1:1000; cat.2906), CDK6 (1:1000; cat.3136), p- Rb (Ser807 /811) (1:2000, cat.8516), P21 (1:800, cat.2947), p-IKB (Ser32) (1:500; cat.2859) (Cell signalering teknologi, Boston, MA , USA), c-Myc (1:1000; cat.ab32, Abcam), aktive β-catenin (1:500; cat.05-665, Millipore), p65 (1:500; sc-8008, Santa Cruz) . Efter inkubation med peroxidase-koblet anti-muse (cat.sc-2005) eller kanin (cat.sc-2004) IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved 37 ° C i 2 timer blev bundne proteiner visualiseret under anvendelse af ECL (Thermo Fisher Scientific) og kvantificeres ved hjælp Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative protein niveauer blev beregnet i forhold til p-actin som lastning kontrol.

plasmidtransfektion og Lille interfererende RNA Behandling

pCMV6-ATDC plasmid blev købt fra Origene. pCMV6 tom vektor blev anvendt som en negativ kontrol. On target plus siRNA’er for ATDC (M-012.409-01) og ikke-målretning siRNA # 1 (D-001.810-01) blev indkøbt fra Dharmacon (Lafayette, CO, USA). Plasmidet og siRNA blev transficeret ind i celler ved anvendelse Attractene transfektionsreagens (Qiagen, Hilden, Tyskland). Kort beskrevet blev celler podet i en 6-brønds plade 24 timer før forsøget. blev bestemt mRNA og protein niveauer af ATDC 48 timer efter transfektion.

Cell Proliferation Test og kolonidannelse Assay

Celleproliferation assay blev udført under anvendelse af Cell Counting Kit-8-opløsning (Dojindo, Gaithersburg, MD) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev cellerne podet ved en koncentration på 5 × 10

3 celler /100 pl /brønd i 96-brønds dyrkningsplader og behandlet med 10 pl /brønd af Cell Counting Kit-8 løsning under de sidste 4 timer af kulturen . Optisk densitet af brøndene blev målt ved 450 nm bølgelængde under anvendelse af en mikropladelæser.

I kolonidannelse assayet blev celler plantes i tre 6-cm celle dyrkningsskåle (1 x 10

3 celler pr skål ) og inkuberet i 12 dage. Pladerne blev vasket med PBS og farvet med Giemsa. Antallet af kolonier med mere end 50 celler blev talt.

Cell Cycle Analysis

Celler (5 x 10

5) blev podet i en 6 cm vævskulturskål. Efter inkubation i 12 timer blev celler behandlet med serum sult i 24 timer før transfektion med angivne doser af plasmider eller siRNA. Ved de angivne tidspunkter blev cellerne høstet, fikseret i 1% paraformaldehyd, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og farvet med 5 mg /ml propidiumiodid i PBS suppleret med RNase A (Roche, Indianapolis, IN) i 30 minutter ved stuetemperatur. De farvede celler blev opsamlet og analyseret under anvendelse BD flowcytometri systemer

Luciferase Reporter Assay

reportergen transfektion og luciferaseaktivitet assay blev udført som følger:. Celler i sammenflydende vækst på en plade med 24 var cotransficeret med ildflue luciferase reporter (0,2 ug) sammen med Renilla luciferase reporter (Promega Co.) (0,02 ug) i 12 timer under anvendelse af et attractene reagens (Qiagen) ifølge protokollerne fra producenterne. De reporter plasmider i TOP /FLASH, p53 og NF-KB blev købt fra Biotime Biotechnology, Kina. Luciferaseaktiviteten blev målt i celleekstrakter ved anvendelse af en dobbelt luciferase rapporteret gen (Promega, CA, USA). Den relative aktivitet af reportergenet blev beregnet ved at dividere signalerne fra ildflueluciferase reporter af signaler opnået fra Renilla luciferase reporter.

Statistical Analysis

SPSS-version 16.0 for Windows blev anvendt til alle statistiske analyser. Chi-squared test blev anvendt til at undersøge mulige sammenhænge mellem ATDC udtryk og clinicopathologic faktorer. Den t-test blev anvendt til at teste forskel mellem grupperne og p-værdier var baseret på to-sidet statistisk analyse, med en p-værdi på 0,05 udpegning af statistisk signifikans

Resultater

Overekspression af ATDC protein i ikke-småcellet lungekræft væv og dets forhold til klinisk-patologisk Faktorer

for at undersøge ATDC protein niveauer i lungekræft, vi undersøgte ATDC udtryk i et panel af 109 NSCLC prøver og 20 parret homologe normale lungevæv ved hjælp af immunhistokemi. Overekspression af ATDC blev bemærket i 62 (56,88%) ud af 109 NSCLC prøver, og ATDC proteinet blev primært lokaliseret i cytoplasmaet af tumorcellerne (Figur 1C-F). Ingen eller svag farvning signaler blev påvist i de normale lungevæv og de normale bronchiale epitel støder op til tumoren (figur 1A-B).

A. Negativ farvning i normale pneumocytter i alveolerne i ikke neoplastiske lungevæv. B. Negativ farvning i normal bronkieepitel i ikke-neoplastisk lungevæv. C. Negativ ATDC farvning i lunge adenocarcinom. D. Svag ATDC farvning i lunge adenocarcinom. E. Svag ATDC farvning i lungerne pladecellecarcinom. F. Strong ATDC farvning i lunge pladecellekræft.

blev også analyseret Forholdet mellem ATDC udtryk og flere clinicopathologic parametre. Som vist i tabel 1, blev der observeret en signifikant sammenhæng mellem ATDC overekspression og omfanget af den primære tumor (T1 versus T2-T4:42.11% versus 64,79%, p = 0,0227), histologisk differentiering (godt differentiering versus moderat /dårlig differentiering: 31.43% versus 68,92%, p = 0,0002) og histologiske typer (pladecellecarcinom versus adenocarcinom: 97,83% versus 26,98%, p 0,0001). Ingen statistisk signifikant forskel blev fundet mellem ATDC overekspression og patientens alder (p = 0,5449), køn (p = 0,3696), nodal status (p = 0,2327), eller TNM stadie (p = 0,5085).

ATDC fremmer celleproliferation i Lung cancercellelinier

Ekspression af ATDC blev analyseret ved realtids-PCR og Western blot assays i et panel af lungekræft cellelinier og i normal bronchial epitelcellelinie HBE (figur 2a- B). Vi fandt, at både ATDC mRNA og protein ekspressionsniveauer i NSCLC cellelinjer var meget højere end den, HBE, især i A549 og H1299 cellelinier. For at undersøge en mulig rolle af ATDC i cellevækst for lungekræft, vi transficeret en ATDC cDNA ekspressionskonstruktion i HBE-celler og anvendt en pulje bestående af tre siRNAs ATDC-målretning til knockdown ATDC udtryk i både A549 og H1299 celler (figur 2C-D). HBE-celler viste en signifikant stigning i ATDC ekspression efter ATDC transfektion mens ATDC-specifikke siRNA effektivt blokeret ATDC ekspression i A549 og H1299 cellelinier.

A. mRNA ekspressionsniveauer af ATDC analyseret ved Real-time PCR i et panel af lungekræft cellelinier. Bemærk den højeste ekspression observeres i A549-cellelinje og den laveste ses i HBE celle. B. protein ekspressionsniveauer af ATDC analyseret ved Western-blot i et panel af lungekræft cellelinier. Bemærk en direkte korrelation af proteinniveauet (B) med transkripterne (A) i hver cellelinie. C. Real-time PCR-analyse af ATDC overekspression effektivitet i HBE-celler og depletion effektivitet i A549 og H1299-celler ved transskriptionsniveau. D. Western blot-analyse af ATDC overekspression effektivitet i HBE-celler og depletion effektivitet i A549 og H1299 celler ved en proteinniveau. Båndet af lavere MW i H1299-celler er et protein nedbrydningsprodukt. Bemærk en direkte sammenhæng af proteinet niveau (D) med udskrifter (C) i hver cellelinje.

MTT assay viste, at transfektion af ATDC cDNA i HBE-celler fremmes cellevækst sammenlignet med kontrol (transfektion af tomme vektorer) (HBE kontrollerer versus ATDC cDNA: 1,06 ± 0,05 versus 1,41 ± 0,05, p 0,05). Virkningen af ​​ATDC på proliferation kapacitet blev også analyseret ved hjælp af kolonidannelse assayet. ATDC overekspression i HBE celler førte til en bemærkelsesværdig stigning i koloni-numre (HBE kontrol versus ATDC cDNA: 221 ± 13 versus 441 ± 9, s 0,05). På den anden side, celleproliferationen sats (A549 NC versus siATDC: 1,23 ± 0,03 versus 0,84 ± 0,03; H1299 NC vs siATDC: 1,72 ± 0,01 versus 1,19 ± 0,02; p 0,05) og kolonidannelse evne (A549 NC versus siATDC: 400 ± 12 versus 150 ± 14; H1299 NC versus siATDC: 258 ± 20 versus 119 ± 17; p 0,05) blev svækket i A549 og H1299-celler med ATDC knockdown (figur 3). Disse resultater helt antyder, at ATDC kunne modulere lungekræft celleproliferation.

A. MTT-assay viser, at ATDC transfektion i HBE-celler fremmer cellevækst og ATDC knockdown i A549 og H1299-celler inhiberer celleproliferation. B-C. Vurdering af klonogene potentialer i ATDC overekspression celler og ATDC udtømte celler ved at tælle kolonier numre. En bemærkelsesværdig stigning i koloni numre blev observeret i HBE-celler med ATDC overekspression i sammenligning med kontrol, og antallet af dannede kolonier ved A549 og H1299-celler behandlet med ATDC siRNA var langt mindre end af kontrolceller. Kolonner i C repræsenterer middelværdien af ​​3 dubletter; søjler repræsenterer standardafvigelse [13]. * Angiver en statistisk signifikans i forskellen mellem de angivne 2 bar-værdier (p 0,05).

ATDC Letter G1 /S Overgang og Up-regulerer Cyclin D1 og c-myc ekspression i Lung Cancer Cells

Cellecyklusanalyse ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) blev udført i ATDC overudtrykker HBE-celler og i ATDC forarmet A549 og H1299-celler (figur 4). ATDC overekspression faldt procentdelen af ​​celler i G1-fasen (HBE kontrol versus ATDC cDNA: 68.04% ± 0,04% versus 57.74% ± 0,51%, p 0,05) og øgede procentdelen af ​​celler i S-fase (HBE kontrol versus ATDC cDNA: 12,48% ± 0,74% mod 27,62% ± 0,61%, p 0,05). Omvendt ATDC siRNA behandling øgede cellerne i G1 fasen (A549 NC versus siATDC: 64,99% ± 0,57% mod 75,99% ± 2,72%, H1299 NC versus siATDC: 52,66% ± 1,47% mod 63,80% ± 1,13%, p 0,05 ) og faldt cellerne i S-fasen (A549 NC versus siATDC: 29,59% ± 0,45% versus 9,24% ± 0,06%; H1299 NC versus siATDC: 37,55% ± 3,13% versus 20,80% ± 3,11%, p 0,05) sammenlignet med kontrol. Disse resultater antyder, at ATDC kan fremme cellecyklusprogression via G1 /S grænsen

Bemærk ATDC overekspression i HBE-celler øger S-fase celler og nedsætter G1-fase celler. (P lt; 0,05 sammenlignet med kontrol). ATDC knockdown i A549 og H1299 celler øger G1 fase celler og nedsætter S fase celler (p 0,05 sammenlignet med kontrol).

For at undersøge mekanismen for cellecyklusprogression reguleret af ATDC i lungekræft, vi undersøgte virkningen af ​​ATDC på cyclin A, cyclin D1, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6, p-Rb og c-myc i lungekræft cellelinier. Som vist i figur 5, afslørede western blotting-analyse, at ATDC overekspression opreguleres protein niveauer af cyclin D1, CDK4, CDK6, p-Rb og c-myc i HBE-celler, mens knockdown af ATDC nedsat ekspression af disse proteiner i A549 og H1299-celler. Tilsammen antyder disse resultater, at ATDC kan fremme G1 /S overgang via opregulering cyclin D1 og c-myc-ekspression.

Western blotting-analyse afslører, at ATDC transfektion øger cyclin D1 og c-myc ekspression i HBE-celler og knockdown af ATDC nedsætter protein niveauer af cyklin D1 og c-myc i både A549 og H1299 celler, uden væsentlige ændringer i cyclin A og cyclin E-ekspression.

ATDC Expression korrelerer med Ki67 Mærkning Index, cyklin D1 og c-myc Niveauer i NSCLC Væv

Vi undersøgte sammenhængen mellem niveauet af total ATDC protein og spredning indeks (Ki67 mærkning) i NSCLC. Vi fandt, at sager med et højt niveau af ATDC-proteinekspression tendens til at vise en høj spredning indeks, i forhold til dem med et lavt niveau af ATDC (p = 0,0022) (figur 6). Immunfarvning for cyklin D1 og c-myc blev også udført i NSCLC prøver og deres foreninger med ATDC udtryk blev analyseret (figur 6). Som vist i tabel 1, ATDC overekspression korreleret med en høj grad af cyclin D1 (p = 0,0010) og c-myc-ekspression (p = 0,0150).

Immunhistokemisk farvning af ATDC (A og B), cyclin D1 (C og D), c-Myc (E og F) og Ki67 (G og H) i NSCLC prøver. A, C, E og G angiver en repræsentativ tilfældet med positiv ATDC demonstrerer en høj grad af cyclin D1 og c-myc, en høj mærkning indeks for Ki67, mens B, D, F og H repræsenterer et tilfælde med negativt ADTC og tilsvarende negativ cyclin D1 og c-myc farvning eller lavt niveau af Ki67-mærkning.

ATDC Up-regulerer cyclin D1 og c-myc i Lung Cancer Cells Uafhængig af wnt /β-catenin eller p53 signalvej

De seneste data viser, at overekspression af ATDC fører til wnt signalering aktivering i pancreas adenocarcinom cellelinjer. Dette rejser spørgsmålet om, hvorvidt ATDC medieret opregulering af cyclin D1 og c-myc i lungekræft celler resulterer fra en aktivering af Wnt signaltransduktionsvej, hvor cyclin D1 og c-myc er afgørende elementer. For at teste dette vi målte totale β-catenin og aktive β-catenin-niveauer ved Western blot-analyse, og undersøgte wnt aktivitet ved luciferase reporter assays i HBE-celler overudtrykker ATDC og i H1299 og A549-celler bankede-down af ATDC. Ingen synlige ændringer i wnt aktivitet og β-catenin-niveauer blev bemærket i disse celler med ændrede niveauer af ATDC (Figur 7A-B). Virkningen af ​​ATDC på lungekræft celleproliferation synes at være uafhængig af wnt /β-catenin signaltransduktionsvej.

A. Der var ingen signifikant ændring af Topflash luciferaseaktivitet efter ATDC transfektion i HBE-celler og efter siRNA behandling i A549 og H1299-celler. B. Der var ingen signifikant ændring af β-catenin og aktive β-catenin-proteinniveauer efter ATDC transfektion i HBE-celler og efter siRNA behandling i A549 og H1299-celler. C. ATDC transfektion i HBE celler eller dens udtynding i A549 celler ændrede ikke niveauet af p53 luciferaseaktivitet. D. ATDC transfektion i HBE eller dets udtynding i A549 celler ændrede ikke protein niveau af p53 target gen p21.

Siden ATDC blev rapporteret at øge celledeling via hæmning af p53 nukleare aktiviteter, vi spekulerede hvis ATDC medieret opregulering af cyclin D1 og c-myc i lungecancerceller kunne skyldes den hæmmende virkning på p53-protein. Blandt de 3 anvendte cellelinjer ovenfor har H1299-celler været velkendt at have p53-genet tabt, mens HBE og A549-celler udtrykker vildtype p53. Derfor vurderede vi effekten af ​​ATDC på p53 aktivitet i HBE og A549 celler. Som vist i figur 7C-D, har overekspression af ATDC i HBE-celler ikke signifikant ændrer aktiviteten af ​​p53-responsive luciferase reporter eller ekspressionen af ​​p53 målgen p21. Hverken ændring blev bemærket i A549 celler forarmet af endogen ATDC. I forbindelse med, at ATDC reguleret cyclin D1 og c-myc niveau p53-nul-H1299 celler, vi troede, at effekten af ​​ATDC på cellecyklus progression i lungekræft celler kan være uafhængig af p53-aktivitet.

ATDC opregulerer cyclin D1 og c-Myc gennem aktivering af NF-KB Pathway

Da både cyclin D1 og c-myc var downstream mål for NF-KB, undersøgte vi protein ekspression af p65, p-IKB og NF-KB luciferaseaktivitet at vurdere, om ATDC kunne regulere aktiveringen af ​​NF-KB-vejen (figur 8A-B). Det viste sig, at ATDC overekspression i HBE celler opreguleret NF-KB reporter luciferaseaktivitet, og tilsvarende, ATDC udtynding i A549 og H1299 celler nedreguleret dets aktivitet. På den anden side, niveauet af p-IKB var opreguleret i HBE-celler transficeret med ATDC og nedreguleret i A549 og H1299-celler udtømt for endogent ATDC, selv om der ikke var nogen signifikant ændring af den samlede p65 niveau i disse celler. Disse resultater antyder en mulig involvering af NF-KB-aktivering i ATDC induceret opregulering af cyclin D1 og c-myc. Bay 11-7082, som inhiberer phosphorylering og nedbrydning af IkBa at blokere NF-KB-aktivering, blev også anvendt i HBE-celler transficeret med ATDC at bekræfte virkningen af ​​NF-KB-aktivering. Som vist i figur 8C, NF-KB inhibitor tilbageføres virkningen af ​​ATDC på cyclin D1, c-myc og p-Rb i HBE-celler. Derfor kan NF-KB-aktivering være en forudsætning for ATDC induceret opregulering af cyclin D1 og c-myc.

A. ATDC overekspression opreguleret NF-KB reporter luciferaseaktivitet i HBE-celler og ATDC depletion inhiberede NF-KB reporter luciferaseaktivitet i både A549 og H1299-celler. B. ATDC transfektion forøget p-IKB ekspression i HBE-celler og ATDC depletion faldt niveauet p-IKB i A549 og H1299-celler.