PLoS ONE: Myeloide Klynger er forbundet med en Pro-Metastatisk Miljø og dårlig prognose i ryge-relaterede Early Stage Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Denne undersøgelse havde til formål at forstå rolle myeloide celle klynger i uengagerede regionale lymfeknuder fra tidlig stadie ikke-små patienter celle lungekræft.

Metoder

uengagerede regionale lymfeknude sektioner fra 67 patienter med stadium i-III resektion ikke -lille celle lungekræft blev immunfarvet at opdage myeloide klynger, STAT3 aktivitet og okkult metastaser. Anthracosis intensitet, myeloid klynge infiltration forbundet med anthracose og pSTAT3 niveau blev bedømt og forbundet med patientens overlevelse. Multivariate Cox regressionsanalyse blev udført med prognostiske variable. Humane makrofager blev anvendt til

in vitro

nikotin behandling.

Resultater

CD68

+ myeloide klynger forbundet med anthracosis og med en immunosuppressiv og metastase-fremmende fænotype og forhøjet samlet STAT3-aktivitet blev observeret i ikke-involverede lymfeknuder. Hos patienter med en rygevaner, myeloid klynge score signifikant korreleret med anthracosis intensitet og pSTAT3 niveau (P 0,01). Nikotin aktiveret STAT3 i makrofager i langvarig kultur. CD68

+ myeloide klynger korrelerede og colocalized med okkulte metastase. Myeloid klynge score var en uafhængig prognostisk faktor (P = 0.049) og var forbundet med overlevelse af Kaplan-Maier estimat hos patienter med en historie af rygning (P = 0,055). Kombinationen af ​​myeloid klynge score med enten lymfeknude stadium eller pSTAT3 niveau defineret to populationer med en signifikant forskel i overlevelse (P = 0,024 og P = 0,004, henholdsvis). Salg

Konklusioner Salg

Myeloide klynger fremme en pro-metastatisk mikromiljø i uengagerede regionale lymfeknuder og associeret med okkulte metastaser i tidligt stadie ikke-småcellet lungekræft. Myeloid klynge score er en uafhængig prognostisk faktor for overlevelse hos patienter med en historie af rygning, og kan præsentere en ny metode til at informere terapi valg i adjuverende. Yderligere valideringsundersøgelser er berettiget

Henvisning:. Zhang W, Pal SK, Liu X, Yang C, Allahabadi S, Bhanji S, et al. (2013) Myeloide Clusters er forbundet med en Pro-Metastatisk Miljø og dårlig prognose i ryge-relaterede Early Stage Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (5): e65121. doi: 10,1371 /journal.pone.0065121

Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Italien

Modtaget: Februar 14, 2013; Accepteret den 22. april 2013; Udgivet: 24. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under tilskud nummer P30CA033572. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA. [1] på trods af reducerede rygning satser, cigaretrøg er stadig den vigtigste risikofaktor forbundet med lungekræft. [2] Tobaksrøg indeholder tusindvis af kemikalier, omkring 70 er kendte carcinogener. [3] anthracosis, som er aflejringen af ​​sort støv stof, er blevet fundet i lungerne og lymfeknuder (LMS) af dem med en historie af rygning. [4] Udsættelse for tobaksrøg inducerer mutagenese fører til udvikling af lungekræft, og fortsatte rygning medfører øget dødelighed og tilbagefald i tidligt stadium sygdom. [5] Selv behandlinger er tilgængelige til behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), de fleste patienter udvikler recidiv på grund af sin meget invasive og metastatiske kapacitet. Der er behov for nye strategier for tidlig forudsigelse af mikrometastatisk sygdom og invasive kapacitet NSCLC.

Inden tumormikromiljøet, immunceller producere immunosuppressive faktorer, såsom interleukin (IL) -6, IL-10, transformerende vækstfaktor -β og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), hvilket resulterer i ineffektive anti-tumor immunrespons og fremme af tumorvækst, angiogenese og invasion. [6], [7], [8], [9], [10] mikromiljø af maligniteter, herunder NSCLC konverterer myeloide celler, som er afgørende for både medfødte og adaptive immunitet, i immunosuppressive celler, der letter immun unddragelse. [6], [11], [12], [13] konstitutiv aktivering af signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) i myeloide celler er afgørende for udviklingen af ​​immunosuppression i primære tumorer og deres mikromiljø. [7], [9], [14]

betydningen af ​​myeloide celler er blevet beskrevet i condition præ- metastatisk væv for den fremtidige såning af metastatiske tumorceller. [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] i nogle tumormodeller , infiltrerende myeloide celler i pre-metastatiske væv danner klynger, som såkaldte “pre-metastatiske nicher.” [16], [19], [20] i en nylig rapport, sphingosin-1-phosphat-receptor 1 (S1PR1 ) -STAT3 signalering akse i myeloide celler viste sig at være kritisk for myeloid celle kolonisering i præ-metastatiske steder, fremme metastase. [24] korrelationen mellem infiltration af myeloide celleklynger med forudbestemte metastatiske steder og patient prognose er ikke tidligere blevet beskrevet . Vi antager, at infiltration af myeloide celler og forhøjet STAT3 aktivitet inden for pre-metastatisk væv fra NSCLC patienter kunne forudsige patienternes resultater efter kirurgisk resektion. Regionale LN er almindeligt invaderet af NSCLC-celler i processen med metastase. Vi studerede uengagerede regionale LN fra patienter med resektabel NSCLC at bestemme sammenhængen mellem myeloide celleklynger, aktivering af STAT3 og patientens prognose.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

patient prøver blev indsamlet i overensstemmelse med City of Hope institutionel review board (IRB # 10062) og patient skriftligt informeret samtykke blev opnået. Uengagerede lymfeknude væv blev opsamlet fra 67 patienter med en patologisk verificeret diagnosticeret NSCLC, som gennemgik enten mediastinal lymfeknude sampling eller fuldstændig lymphadenectomy og viste sig at have patologisk bestemt n0 sygdom eller N1-N3 sygdom. Patienterne havde mindst en lymfeknude karakteriseret som uengagerede med tumor, med tilgængelige paraffinindstøbt væv. En uengagerede lymfeknudevæv blok fra hver kvalificeret patient blev opnået og fire-um snit blev fremstillet til efterfølgende analyser. Iscenesættelse blev bestemt af amerikanske Blandede Cancer retningslinjer, 7

th edition. [25] Patientdemografi og kliniske karakteristika er vist i tabel 1. Normal LN sektioner fra 4 personer uden kræft blev købt fra Abcam, IMGENEX og GeneTex, og alle var etisk opnået og undersøgt og diagnosticeret med licens patologer.

Immunhistokemi (IHC)

Sektioner blev inkuberet med antistoffer mod CD68 (ABD Serotec, klon 514H12, 01:50) , pY705-STAT3 (Cell Signaling, klon D3A7, 01:50), CD33 (Leica, klon PWS44, 1:200), CD163 (ABD Serotec, klon EDHu-1, 1:200), IL-6 (Abcam, 1 :400), IL-10 (ABD Serotec, klon JES3-12G8, 1:100), VEGF-A (Abcam, klon VG-1, 1:200), matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9, Cell Signaling, 1: 100), Stromal celleafledt faktor 1 /chemokin (CXC-motivet) ligand 12 (SDF-1 /CXCL12, R 2, carbon pigment optrådte fast men spredt (ikke grupperet); 3, blev klynger af mere end omkring 50 celler med fast kulstof pigment observeres. Repræsentative billeder er vist i fig. 1. For myeloid klynge infiltration evaluering blev IHC slides farvet for CD68 undersøgt under 40x forstørrelse i hele sektioner og scorede på et heltal skala fra 1 til 3 som følger: 1, myeloid klynge område var mindre end 5% af hele væv området ; 2, myeloid klynge område var mellem 5% og 50% af hele LN vævsområde; 3, myeloid klynge område var større end 50% af det samlede LN vævsområde (fig. 1). Samlet pSTAT3 niveau blev scoret som procentdelen af ​​pSTAT3

+ -celler i 10 tilfældige felter under 100 x forstørrelse (fig. 1). STAT3 aktivitet i myeloide celler i forbindelse med anthracosis blev scoret på et heltal skala fra 1 til 3 ud af 10 tilfældige felter under 200x forstørrelse: 1, mindre end 5% af de anthracotic celler pSTAT3

+; 2, 5% -50% var pSTAT3

+; 3, over 50% var pSTAT3

+ (fig. 1). I tilfælde af uenighed om anthracosis intensitet, myeloid klynge infiltration og myeloid celle pSTAT3 plan blev sektionerne revurderet af de to observatører sammen og en endelig beslutning blev taget. I tilfælde af uenighed om den samlede pSTAT3 niveau, blev en middelværdi beregnes som det endelige score.

HE farvning og IHC farvning for CD68 eller pSTAT3 viser repræsentative billeder til scoring af anthracosis intensitet, anthracotic myeloid klynge infiltration, samlet STAT3 aktivitet og anthracotic myeloid celle STAT3 aktivitet. Nummeret på det øverste venstre hjørne af hvert billede viser score. (Scale bar, 200 um)

For prognostisk evaluering, blev patienterne dikotomiseret i lave og høje grupper for hver markør: anthracosis intensitet: 1 eller 2 = lav, 3 = høj; myeloid klynge infiltration forbundet med anthracose: 1 eller 2 = lavt; 3 = højt; Samlet STAT3-aktivitet: mindre end eller lig med 50% = lav, mere end 50% = høj; STAT3 aktivitet i myeloide celler i forbindelse med anthracosis: 1 = lav, 2 eller 3 = høj

Slides farvet for pan-CK hjælp IHC blev vurderet for tilstedeværelsen af ​​okkult metastaser under 100 × og 200 × forstørrelse.. Okkulte metastatiske NSCLC celler er relativt store i størrelse, høj i nuklear-cytoplasmatisk forhold, og viser klart og intensiv ring-lignende cytoplasmatisk mørkebrun 3,3′-Diaminobenzidin-farvning. [28]

Cellekultur

THP-1 blev opnået fra American Type Culture Collection og differentieret til makrofager ved phorbol 12-myristat 13-acetat stimulation. Humane mononukleære celler fra perifert blod fra raske donorer blev isoleret med Histopaque 1077 (Sigma). Monocytter blev beriget med EsaySep CD14

+ udvælgelse kit (StemCell Technologies) og differentieret til makrofager ved dyrkning ved tilstedeværelse af 10 ng /mL granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (PeproTech) i 6 dage og hvile i 1 dag. Makrofager blev behandlet med nikotin (Sigma-Aldrich) med eller uden en uM AZD1480 (leveret af AstraZeneca), for den angivne tid.

Western blotting

Lige mængder af cellelysat proteiner fremstillet med RIPA puffer blev underkastet natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese og immunblottet med antistoffer mod pY705-STAT3 (Cell Signaling), total STAT3 (Santa Cruz) og β-actin (GE healthcare).

Statistisk analyse

kvantificerede positiv farvning områder i IHC blev analyseret med Students

t

-test. Parvise korrelationer blandt laboratorium biomarkør måling blev vurderet af Spearman rang korrelationskoefficient. Kaplan-Meier kurver blev genereret for at vurdere forskellene mellem overlevelseskurver og P-værdier baseret på log-rank test blev præsenteret. Målinger af hver biomarkør blev passe med en univariate Cox proportionel risiko regressions model. For at undersøge yderligere forudsigelse magt over kliniske variabler blev multivariat Cox regressionsanalyse også udført til model udvælgelse blandt scenen, nodal fase, anthracosis intensitet, myeloide klynger forbundet med anthracosis, samlet pSTAT3 niveau, myeloid klynge pSTAT3 niveau og okkult metastaser. En effekt blev anset for at være statistisk signifikant, når den tilsvarende P-værdi 0,05 (*, P 0,05, **, P 0,01, ***, P 0,001). Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af R-software.

Resultater

Myeloide klynger fremtrædende og overordnede STAT3 aktivitet er dramatisk forhøjet i uengagerede NSCLC regionale lymfeknuder

Sammenlignet med normale LN fra individer uden cancer, fremtrædende carbon pigment deposition, dvs. anthracose, blev observeret i ikke-involverede LN fra NSCLC-patienter, som vist i fig. 2A. Immunfluorescensfarvning demonstrerede anthracotic celler CD68

+ myeloide celler (Fig. 2A). Sammenlignet med ikke-involverede regionale LN fra prostatacancer, melanom eller brystcancer patienter (data ikke vist), tilstedeværelsen af ​​myeloide celler i forbindelse med anthracose var enestående i ikke-involverede NSCLC regionale LN. Ved IHC-farvning, fandt vi, at de myeloide celler i forbindelse med anthracose sædvanligvis dannet klynger, som ikke blev observeret i normale LN (fig. 2B). Forhøjet samlet STAT3 aktivitet i uengagerede LN fra NSCLC patienter blev også påvist ved IHC farvning for pY705-STAT3 (Fig 2B.)

(A) HE farvning af normale LN fra enkeltpersoner uden kræft (n = 4;. Venstre to paneler) og uengagerede regionale LN fra NSCLC patienter (midterste to paneler) viser anthracotic carbon pigment (angivet med pile, Scale bar, 20 pm) i patientens LN. Immunfluorescensfarvning for CD68 (højre panel) viser anthracotic pigment er inden CD68

+ celler (Bemærk de sorte prikker, der er angivet med små pile i CD68

+ celler Scale bar, 20 pm). (B) IHC farvning viser fremtrædende CD68

+ myeloide klynger forbundet med anthracosis og højt aktiveret STAT3 i uengagerede NSCLC regionale LN (højre paneler) sammenlignet med normale LN (n = 4; venstre paneler) (Scale bar, 200 um).

Positive korrelationer mellem anthracosis intensitet, myeloid klynge infiltration og pSTAT3 niveau i NSCLC patienter med en historie af rygning

Hos patienter med en historie af rygning, anthracosis intensitet, myeloide klynger forbundet med anthracosis, samlet STAT3 aktivitet og anthracotic myeloid celle STAT3-aktivitet var ikke forbundet med sygdomsprogression (data ikke vist). Men CD68

+ myeloid klynge infiltration positivt korreleret med anthracosis intensitet og overordnede pSTAT3 aktivitet (fig. 3A). STAT3-aktivering i anthracotic myeloide klynger også forbundet med anthracose intensitet (fig. 3A). I modsætning hertil hos patienter uden en historie af rygning, anthracosis blev fundet, men korrelationer mellem STAT3 og anthracosis eller myeloide klynger forbundet med anthracosis blev ikke fundet (fig. 3A). Således har vi fokuseret vores undersøgelse på den rolle, myeloide klynger og STAT3 i patienter med rygning historie.

(A) Hos patienter med en rygning historie, men ikke i dem uden en historie af rygning, myeloid klynge infiltration forbundet med anthracose korrelerer med anthracose intensitet og samlet STAT3 aktivitet; anthracose korrelerer med STAT3 aktivitet i myeloide klynger forbundet med anthracose. Korrelationen blev bestemt med parametrisk Spearman rang korrelation test. Vist er middeltal ± SEM, ** P 0,01, *** P 0,001. (B) Nikotin aktiverer STAT3 i humane makrofager. Western blotting viser pSTAT3 og total STAT3 udtryk i humane THP-1-afledte makrofager og humane primære monocytafledte makrofager efter nikotin behandling med eller uden AZD1480.

Nikotin aktiverer STAT3 i humane makrofager

tobaksrygning er en af ​​de hyppigste årsager til anthracosis inden lungevævet. [4], [29] Da sammenhængen mellem anthracosis intensitet og STAT3 aktivitet kun blev observeret i NSCLC patienter med en historie af rygning, vi vurderet, om den vanedannende komponent af tobaksrøg, nikotin, aktiverer STAT3 i humane makrofager. Som vist i fig. 3B, STAT3-aktivitet var forhøjet i både monocytiske cellelinje THP-1-afledte makrofager og primære monocytafledte makrofager efter nikotin behandling i 2 dage, og aktivering blev fuldstændigt ophævet ved en Janus kinase (JAK) inhibitor, AZD1480, viser aktiveringen er via JAK-STAT3 vej.

Pro-kræft og pro-metastatisk fænotype af myeloid klynger

Vi karakteriseret fænotype CD68

+ myeloide klynger forbundet med anthracosis i uengagerede regionale LN fra NSCLC patienter med rygning historie med IHC (fig. 4). Da anthracotic pigment bliver på vævet under immunfarvning, det tjener som et cytoplasmatisk markør for de myeloide celler i forbindelse med anthracose. Ekspressionen af ​​CD33 bekræftede disse celler var fra myeloid linage (data ikke vist). For at undersøge om de myeloide klynger M2-polariseret, udførte vi CD163-farvning og klyngerne viste stærk farvning. Undersøgelse af myeloid klynge fænotype viste ekspression af IL-6 og IL-10, som begge er immunosuppressive faktorer. Ekspressionen af ​​VEGF-A og MMP-9 er angivet en rolle i angiogenese og vævstype-remodeling. VEGF-A er også kendt for at inhibere dendritcellemodning. [30] Aktivering af STAT3 opregulerer Bd-XL ekspression i myeloide celler, [24] og myeloide klynger viste positiv farvning for Bcl-xL. SDF-1 /CXCL12 har en rolle i rekruttering af NSCLC via SDF-1 /CXCL12-CXC kemokinreceptor typen 4 akse, [31], [32] og IHC-farvning viste, at SDF-1 blev højt udtrykt ved myeloide klynger. Alle disse molekyler er STAT3 nedstrøms regulerede gener. [7] Desuden IL-6, IL-10 og VEGF-A er STAT3 aktivatorer. [7] Statistisk analyse viste en signifikant forskel i ekspressionen af ​​disse molekyler mellem myeloide klynger forbundet med anthracose og andre områder inden for LN.

IHC-farvning demonstrerer ekspressionen af ​​CD163, IL-6, IL-10, VEGF-A, MMP-9, SDF-1 og Bcl-xL ved de myeloide celler associeret med anthracosis. For hvert protein blev repræsentative billeder, der viser positive og negativ farvning områder valgt fra samme glas. Kvantificeringen blev udført ved at analysere tilfældige billeder af myeloide klynge områder i forbindelse med anthracosis og andre områder (10 billeder for hver gruppe) fra 10 patienter. To-tailed Students

t

-test blev anvendt til statistisk analyse. Vist er middelværdier ± SEM, *** P 0,001. (Scale bar, 200 um for 100 × og 400 ×, 25 um for 1600 ×)

Myeloide klynger korrelerer og colocalize med LN okkulte metastaser

Tilstedeværelsen af ​​okkulte LN metastaser har været forbundet med dårlig prognose i en stor gruppe af patienter med resektabel NSCLC. [28] Ved at vurdere pan-CK, vi har registreret okkulte metastatiske tumorceller i LN af 8 patienter ud af de 49 patienter med en rygevaner (fig. 5A) . Interessant nok viste de fleste patienter er positive for okkult LN metastase (7 ud af 8) øget myeloide klynger forbundet med anthracose i uengagerede LN (fig. 5A). Tilstedeværelsen af ​​okkult LN metastase var positivt korreleret med myeloide klynger forbundet med anthracose (P = 0,012, r = 0,350) og anthracose intensitet (P = 0,032, r = 0,310). Desuden blev de okkulte metastatiske tumorceller normalt påvises i eller meget tæt på klynger af myeloide celler i forbindelse med anthracose (6 af 8;. Figur 5A (a-b)). Dobbelt farvning for pan-CK og CD68 bekræftede colokalisering (fig. 5B).

(A) IHC farvning viser okkult metastaser i “uengagerede” LN (top to paneler) og metastatiske tumorceller i en involveret LN som den positive kontrol (nederste venstre panel) (Scale bar, 50 um). Søjlediagrammet viser sammenhængen mellem myeloid klynge infiltration forbundet med anthracose og tilstedeværelsen af ​​okkult metastase (OM). Den P-værdi blev bestemt ved parametrisk Spearman rang korrelation test. (B) Konfokal billeder viser colokalisering af pan-CK

+ NSCLC celler (pile) og CD68

+ myeloide klynger forbundet med anthracosis. (Scale bar, 50 um) (C) Konfokal billeder viser colokalisering af myeloide klynger forbundet med anthracose (pile) og CFN. (Scale bar, 50 um)

Det har vist sig, at CFN udtryk i pre-metastatisk væv er forhøjet, og det spiller en vigtig rolle i dannelsen af ​​pre-metastatiske myeloide klynger. [16] I Desuden STAT3 regulerer ekspressionen af ​​CFN i præ-metastatiske myeloide celler. [24] LN snit farvet for CFN og CD68 viste, at CFN er colocalized med små klynger af myeloide celler i forbindelse med anthracose (fig. 5C), hvilket indikerer en mulig rolle for CFN i rekrutteringen af ​​myeloide celler og dannelse klynge i NSCLC regionale uengagerede LN.

myeloide klynger og overordnet pSTAT3 niveau forudsige prognosen for NSCLC patienter med en historie af rygning

Vi vurderede den prognostiske værdi af anthracosis intensitet, CD68

+ myeloid klynge infiltration forbundet med anthracose og pSTAT3 niveau. I en univariat analyse, anthracotic myeloid klynge score viste en tendens til signifikans i forudsigelsen af ​​den samlede overlevelse (P = 0,061, Hazard ratio (HR) = 2,22, 95% CI [0,96, 5,13]). En Kaplan-Meier overlevelse estimat med log-rank test viste også en næsten signifikant forskel mellem myeloid klynge forbundet med anthracose-høj og -Lav gruppe (P = 0,055;. Figur 6A). Både median overlevelse og 5-års overlevelsen er forbedret i den lave myeloid klynge gruppe (median overlevelse: 116,1 måneder, 95% CI [86,0, NA] vs. 56,1 måneder, 95% CI [35,1 – NA] 5-års overlevelse: 78,5%, 95% CI [63,3%, 97,3%] versus 38,0%, 95% CI [20,8%, 69,3%]). Desuden viste overordnet pSTAT3 en tendens til signifikans i forudsigelsen af ​​den samlede overlevelse (P = 0,093, Fig 6B.)

Kaplan-Meier kurver viser overlevelsen af ​​patienter grupperet efter:. (A) myeloid klynge infiltration forbundet med anthracosis, (B) samlet pSTAT3 niveau, (C) kombinationen af ​​nodal scenen og myeloide klynger forbundet med anthracosis, (D) kombinationen af ​​myeloide klynger forbundet med anthracose og samlede pSTAT3 niveau (n = 49).

i en multivariat Cox regressionsanalyse til model udvælgelse ,, nodal scenen og anthracotic myeloid klynge score blev efterladt i den endelige model (nodal etape: P = 0,033, HR = 1,75, 95% CI [1,05, 2,94]; anthracotic myeloid klynge score: P = 0,049, HR = 2,34, 95% CI [1,00, 5,43]), der viser, at myeloide klynger forbundet med anthracosis i regionale uengagerede LN give yderligere forudsigelse magt til patient samlede overlevelse ud over konventionelle klinisk-patologiske variabler. Derfor har vi kombineret nodal scenen og myeloide klynger forbundet med anthracosis at forbedre den samlede overlevelse forudsigelse. På trods af en begrænset stikprøve, viste patienter med negative LN og lave myeloide klynger væsentligt forbedret overlevelse sammenlignet med dem med positive LN og høje myeloide klynger (P = 0,024; median overlevelse: 113.0 måneder vs. 44,0 måneder 5 års overlevelse: 83,1% vs. 15,0%;. figur 6C). Kombinationen af ​​anthracotic myeloid klynge score og overordnede pSTAT3 niveau defineres også to populationer af patienter med signifikant forskellig prognose (P = 0,0041;. Figur 6D). Disse data tyder på, at myeloide klynger forbundet med anthracosis i uengagerede LN er selvstændige prædiktorer for dårlig prognose i at ryge NSCLC patienter.

Diskussion

Udvikling af metastatisk sygdom efter kirurgisk resektion af NSCLC kræver mangesidede interaktioner lettes ved tumor og stromale celler i mikromiljøet på den metastatiske stedet, herunder immunceller. Infiltration af CD68

+ myeloide celleklynger forbundet med anthracosis var fremtrædende i godartet LN fra NSCLC patienter og aktivering af STAT3 blev forhøjet i overensstemmelse med tidligere rapporter på flere maligniteter. [14], [24] Pre-metastatisk niche dannelse har været tilskrives en række forskellige mediatorer, herunder VEGF, MMP-9, STAT3 og SDF-1 /CXCL12. [16], [20], [21], [24] Fænotypisk afgrænsning af de myeloide klynger set i uengagerede LN viste ekspression af IL -6, IL-10 og VEGF-a som inhibitorer af antitumor immunitet, VEGF-a og MMP-9 som pro-angiogene faktorer og SDF-1 som en kemoattraktant for cirkulerende NSCLC-celler. De rigelige myeloide klynger forbundet med anthracose i uengagerede LN kan bidrage til immunosuppressive miljø og spille en pro-cancer og pro-metastatisk rolle. Ekspression af anti-apoptotiske gen Bd-XL er også i overensstemmelse med en tidligere rapport om præ-metastatiske myeloide klynger. [24]

I tumor mikromiljø, STAT3 formidler flerstrenget krydstale mellem tumor-associerede myeloide celler og andre stromale celler, herunder endotelceller. [10] Således, ud over virkningen af ​​tumor-secernerede faktorer og rygning, højden af ​​STAT3-aktivitet i præ-metastatiske LN kan også bidrage til tumormetastase og progression gennem infiltration af myeloide celler. Nylige undersøgelser viser, at inhibering af STAT3, som konstitutivt aktiveret i præ-metastatiske nicher, kan falde myeloid celleinfiltration i fremtidige metastatiske steder. [24], [33] STAT3 hæmmer også antitumorimmunitet at lette carcinogen-induceret lunge tumor formation. [ ,,,0],34] Vores data viser, at nikotin var i stand til at aktivere STAT3 i humane makrofager med efterfølgende ophævelse af JAK /STAT hæmning, tyder på, at dannelsen af ​​pre-metastatiske steder og metastaser hos patienter med rygning relateret NSCLC kan være følsomme over for STAT3 blokade.

Påvisning af okkulte metastaser hos patienter med opereret NSCLC giver ekstra prognostiske kriterier, som kan anvendes ved bestemmelse adjuverende terapi. [28] Da vi evaluerede okkult metastase i godartede LN, de fleste blev fundet i dem med høje niveauer af myeloide klynger forbundet med anthracose og okkulte metastatiske tumorceller colocalized inden disse klynger. Rekruttering af disse myeloide klynger og efterfølgende okkult metastaser kan skyldes CFN, som også var til stede i uengagerede LN på stedet for de klynger.

Fordi myeloid celle STAT3 aktivitet ikke kun konsekvenser immune regulering i forbindelse med tumor [14], men også spiller en vigtig rolle i præ-metastatisk væv, [24] dannelsen af ​​myeloide klynger og aktiveringen af ​​STAT3 kan påvirke patientens prognose. Hos patienter uden lymfeknudeinvolvering, dem med lave niveauer af myeloide klynger forbundet med anthracose viste forbedret overlevelse. Kombinationen af ​​anthracitic myeloid klynge score og pSTAT3 niveau nærmere defineret prognose over tumor og LN etape i patienter med resektabel NSCLC.

Selvom vores resultater er lovende, den aktuelle undersøgelse har flere begrænsninger. Først Konklusionerne begrænset af det lille antal patienter, der danner vores kohorte. Fremtidige studier med større antal patienter vil blive udført for at validere konklusionerne. For det andet, vores tidligere publikation viste, at STAT3 aktivering i myeloide klynger er afgørende for deres kolonisering ved præ-metastatiske steder for at lette metastaser i musemodeller. [24] På samme måde vores aktuelle undersøgelse viser, at myeloid klynge infiltration i uengagerede LN af NSCLC patienter korrelerer med okkult metastaser og prognose. Det er dog vigtigt at bemærke, at sammenhængen ikke gør lige årsagssammenhæng. Myeloid klynge akkumulering i NSCLC pre-metastatiske LN kan forekomme som en sekundær begivenhed i løbet af metastatisk progression. Således vil det være nødvendigt direkte beviser for, at CD68

+ myeloide klynger er ansvarlige for grunding NSCLC nodal metastaser.

På trods af de begrænsninger, vores undersøgelse dokumenterer, at STAT3 og myeloid infiltration associeret med tidlig metastatisk sygdom og kan være vigtige i rygning-induceret lungekræft. Korrelationen af ​​myeloide klynger forbundet med anthracosis og pSTAT3 med patienten overlevelse giver yderligere oplysninger, når man overvejer den fremtidige behandling. Hæmning af veje, der stimulerer præ-metastatisk niche dannelse kan vise sig mere effektiv end standard kemoterapi. Undersøgelse i større kohorter for validering og prospektive forsøg vil yderligere definere den rolle af myeloide klynger og STAT3 i tidlig fase NSCLC. Endvidere vil undersøgelsen af ​​frisk væv og isolering af levedygtige myeloide klynger give indsigt i de cellulære mekanismer involveret.

Tak

Vi vil gerne takke Brian Armstrong, Ph.D. of Light Microscopy Imaging Core, Rebecca Nelson, Ph.D. af Institut for Information Sciences og medarbejdere i Patologi Core på City of Hope Comprehensive Cancer Center, for deres bistand i undersøgelsen.