PLoS ONE: S100 Calcium protein A6 Fremmer Epithelial-Mesenchymale Overgang gennem β-Catenin i kræft i bugspytkirtlen Cell Line

Abstrakt

Patogenesen af ​​pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) forbliver dårligt forstået. S100 calcium-bindende protein A6 (S100A6) er blevet forbundet med PDAC; Men virkningen af ​​S100A6 på PDAC migration og invasion er endnu ikke blevet undersøgt. I denne undersøgelse blev Panc-1-celler transficeret med et plasmid at inducere overekspression af S100A6, og β-catenin blev slået ned med en specifik kort hårnål RNA (shRNA). Den sårhelende og Transwell assays viste, at S100A6 fremmet PDAC cellemigration og invasion. Endvidere β-catenin shRNA inhiberede migration og invasion af PDAC celler. Vi bekræftede, at S100A6 inducerer PDAC cellemigration og invasion via aktivering af β-catenin in vitro. Vurdering af mRNA og protein niveauer afslørede, at S100A6 inducerer forøget ekspression af β-catenin, N-cadherin og vimentin og nedsat ekspression af E-cadherin i PDAC celler. β-catenin shRNA ændres også ekspressionen af ​​epitel-mesenkymale overgang (EMT) -relaterede markører i PDAC celler. Specifikt ekspression af E-cadherin blev forøget, hvorimod ekspression af N-cadherin og vimentin blev reduceret. Endelig viste vi, at S100A6 ændrer ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører via β-catenin aktivering. Afslutningsvis S100A6 inducerer EMT og fremmer cellemigration og invasion i en β-catenin-afhængig måde. S100A6 kan derfor udgøre en roman potentiel terapeutisk mål for behandling af kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Chen X, Liu X, Lang H, Zhang S, Luo Y, Zhang J (2015) S100 Calcium protein A6 Fremmer Epiteliale-Mesenchymale Overgang gennem β-Catenin i kræft i bugspytkirtlen Cell line. PLoS ONE 10 (3): e0121319. doi: 10,1371 /journal.pone.0121319

Academic Redaktør: Yue Wang, Statens Institut for Viral Disease Control og Forebyggelse, CDC, Kina, KINA

Modtaget: December 10, 2014 Accepteret: 30 januar 2015; Udgivet: 23 marts 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Basic and Clinical samarbejde Foundation of Capital Medical University No.13JL77 (Kina). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er et alvorligt globalt sundhedsproblem. Det er den fjerde mest almindelige årsag til kræft dødsfald i USA, med en 5-års samlede relative overlevelse på 6% [1]. I Kina, Den mediane overlevelse for PDAC patienter er 7,8 måneder, med 30,0% af patienter, der gennemgår helbredende hensigtserklæringer operationer, og kun 9,8% af patienterne, som fik omfattende [2] behandling. Trods fremskridt i behandlingen, PDAC stadig er særdeles modstandsdygtig over for tiden tilgængelige strålebehandling og kemoterapi [3]. En bidragyder til dårlig prognose er begrænset forståelse af patogenesen af ​​pancreascancer. Derfor er der et presserende behov for at belyse de molekylære mekanismer, der er forbundet med forekomsten, udvikling og metastase af denne dødelige sygdom.

S100A6 tilhører S100 familien, ekspression er forbundet med tumorgenese og metastase [4] . Logsdon et al. [5] brugte mikroarrays at profilere PDAC genekspression, identificere i alt 158 ​​pancreas cancer-relaterede gener, herunder S100A6. Vores gruppe har tidligere udført immunhistokemisk analyse af S100A6 udtryk i pancreas væv, der bekræfter, at S100A6 udtryk er forhøjet i PDAC prøver, i forhold til normale væv [6]. Ohuchida et al. [7] viste, at ekspression af S100A6 primært er begrænset til kernerne i bugspytkirtelkræftceller, og høje nukleare S100A6 protein ekspressionsniveauer er forbundet med en dårlig prognose. Rolle S100A6 i forhold til tumordannelse og metastase er imidlertid dårligt forstået. Nogle undersøgelser har vist, at S100A6 er involveret i reguleringen af ​​wnt /β-catenin signalvej [8], hvilket fører til nedbrydning af β-catenin.

Wnt /β-catenin signalering påvirkninger celleskæbnen, proliferation, polaritet, og celledød under fosterudviklingen, samt vævshomeostase hos voksne [9]. Aberrant regulering af denne omsætningsvej er derfor forbundet med en række sygdomme, herunder cancer, fibrose og neurodegeneration [10]. Wnt pathway er sammensat af Wnt ligand protein og celleoverfladereceptor, udover cytoplasmatiske komponenter, og en specifik nuklear transkriptionel kompleks [11]. Når wnt ligand-proteinet binder til frizzlede, en celleoverfladereceptor, er det wnt pathway aktiveret. Cytoplasmatisk β-catenin derefter ind i cellekernen, hvor det modulerer transkription og herved påvirke celleproliferation og tumormetastase. I denne proces, β-catenin er nøglen effektormolekyle [12]. En række cellulære proteiner, herunder wnt, kan påvirke β-catenin produktion og akkumulering i cytoplasmaet. RNA sekventering af pancreas cirkulerende tumorceller implicerer Wnt og β-catenin i metastaser [13].

Der er et væld af forskning vedrørende de attributter af cirkulerende tumorceller, der vedrører den epitel-mesenkymale overgang (EMT) [ ,,,0],14,15]. EMT refererer til transdifferentiering af epitelceller i mesenkymale celler under visse fysiologiske og patologiske tilstande, ledsaget af cellemorfologi og genekspression ændringer [16]. EMT forekommer i en række forskellige processer, såsom embryonisk udvikling, sårheling, nogle kroniske sygdomme, og tidligt stadium tumormetastase. Nedregulering af E-cadherin, en epitelial markør, er kendetegnende for EMT. Tabet af E-cadherin er ledsaget af opreguleringen af ​​mesenchymale markører, såsom N-cadherin og vimentin. EMT er nødvendigt for størstedelen af ​​tumormetastaser, herunder PDAC [17]. Wnt /β-catenin pathway er en af ​​de vigtigste signalveje, der er involveret i EMT-induktion.

I denne rapport undersøgte vi funktionen og tilknyttede mekanisme S100A6 i forhold til EMT induktion, ved at vurdere dens indflydelse på Panc-1 migration og invasion celle.

Materialer og metoder

Cell linje

den menneskelige pancreascancer cellelinje, Panc-1, blev købt fra American Type Culture Collection (USA). Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Invitrogen, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen, USA), 1% penicillin og streptomycin (Invitrogen, USA) ved 37 ° C med 5% CO

2.

plasmider og RNA Interference

de supplerende DNA til human S100A6 og den negative kontrol DNA blev indsat i en GV146 plasmidvektor købt fra Genechem (Shanghai, Kina). En shRNA sekvens målretning β-catenin (5′-ATCACTGAGCCTGCCATCTGTGCTCTTCG-3 ‘) og en negativ kontrol-sekvens blev syntetiseret og ligeret ind i pRFP-C-RS vektor (Origene Technologies, USA). Plasmiderne blev amplificeret i henhold til fabrikantens anvisninger. Sekvensanalyse efter kloning afslørede 100% homologi til offentliggjorte sekvenser.

kortvarig transfektion og Oprettelse af stabile cellelinier

S100A6 overekspression plasmid og kontrol plasmid blev transficeret i Panc-1 celler ved hjælp opti- MEM reduceret serummedium (Invitrogen, USA) og lipofectamin 2000 (Invitrogen, USA), ifølge producentens anvisninger.

β-catenin shRNA og kontrol shRNA blev transficeret ind Panc-1-celler som anført ovenfor. Efter transient transfektion blev Panc-1-celler udvælges under anvendelse af 1,0 ug /ml puromycin og opretholdt i vækstmedium suppleret med 1,0 ug /ml puromycin. Klonale populationer af celler blev isoleret ved at overføre enkelt klumper af celler i individuelle brønde i en seks-brønds plade. Celler blev derefter holdt ved 37 ° C med 5% CO

2.

Så S100A6 overekspression og kontrol plasmider blev transficeret ind β-catenin knockdown stabile cellelinier, som anført ovenfor.

sårhelende Assay

Celler blev podet i seks-brønds plader og transficeret ved S100A6 overekspression eller kontrol plasmid, og β-catenin shRNA eller kontrol shRNA. Efter 36 timer blev komplet medium erstattet med FBS-DMEM, og efter yderligere 6 timer blev cellemonolag såret med en 200-pi steril plastik tip. Kulturerne blev derefter opretholdt i FBS-DMEM, og oprullede områder blev observeret og fotograferet ved anvendelse af et omvendt mikroskop ved 0, 24 og 48 timer efter sårdannelse. Såret bredde blev målt ved hjælp af billede J software. Sårheling sats blev vurderet som følger:

Transwell Assay

Transwell kamre (Corning, USA) med en 8-um pore blev anvendt til at vurdere migration i 24-brønds plader. Efter transfektion et volumen af ​​celler 200-pi, ved en densitet på 1 x 10

5 /ml i FBS-DMEM blev udsået i de øvre kamre. De nedre kamre blev fyldt med DMEM indeholdende 10% FBS som en stimulerende faktor. Kamrene blev inkuberet i en befugtet vævskultur-inkubator ved 37 ° C, 5% CO

2 atmosfære, i 8 timer. Celler blev derefter fikseret med 95% ethanol i 20 minutter, farvet med krystalviolet i 30 minutter og talt ved anvendelse af et mikroskop med en 40 × objektiv.

For at vurdere celleinvasion, BioCoat Matrigel (BD Biosciences) (300 mikrogram /ml, 100 uL pr kammer) blev anvendt til de øvre indsætte kamre 5 timer før at følge proceduren for migration beskrevet ovenfor.

Kvantitative Real-Time PCR

Total RNA fra Panc -1 celler blev isoleret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, USA). Totalt RNA blev anvendt som en skabelon til at syntetisere cDNA ifølge producentens anvisninger (Invitrogen, USA). Real-time PCR blev udført under anvendelse af en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), med en reaktionsblanding bestående af 5-pi 2 × SYBR Green Master Mix, 1-pi-skabelon, 0,4-pi forward primer, 0,4- pi revers primer og 3,2-pi RNA-frit vand. Cykliseringsbetingelserne var 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 95˚C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Genekspressionsniveauer blev normaliseret i forhold til den for GAPDH. Alle reaktioner blev udført tre gange. Relative mRNA-niveauer blev præsenteret som 2

-ΔΔCt [18]. De anvendte primere er beskrevet i tabel 1.

Western Blotting

Efter transfektion, celler blev høstet ved hjælp af RIPA-lysepuffer (Solarbio, Beijing, Kina) suppleret med PMSF proteasehæmmer (Solarbio , Beijing, Kina). Proteinkoncentrationerne af prøverne blev bestemt under anvendelse af et protein kvantificeringskit (Keygen Biotech, Nanjing, Kina). Prøver (40-100 ug) blev derefter underkastet 10% SDS-PAGE og overført til en polyvinylidendifluoridmembran (PVDF). Membraner blev blokeret i 2 timer i 5% fedtfri tørmælk. Membraner blev inkuberet med specifikke antistoffer ved 4 ° C natten over. De følgende primære antistoffer blev anvendt i denne undersøgelse: anti-β-catenin (Cell Signaling Technology 8480, USA), anti-E cadherin (Abcam ab1416, USA), anti-N cadherin (Abcam ab19348, USA), anti-vimentin ( Abcam ab8069, USA) og anti-β-actin (Cell Signaling Technology 8457, USA). Membranerne blev derefter inkuberet med de tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer (Odyssey). Western blots blev kvantificeret under anvendelse Odyssey Infrarød Imaging. Protein-ekspressionsniveauer blev normaliseret i forhold til den for β-actin.

Statistical Analysis

Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget uafhængigt mindst tre gange. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (standardafvigelse). Studerendes

t

-test blev anvendt til statistisk analyse. Alle data blev analyseret under anvendelse af SPSS 17.0 statistisk programpakke og tallene blev dannet ved anvendelse af GraphPad Prism 5-softwaren. For alle tests, p 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.

Resultater

S100A6 fremmer PDAC celle migration og invasion in vitro

For at vurdere, om S100A6 fremmer PDAC celle migration og invasion, Panc-1 celler blev transficeret med en S100A6 overekspression plasmid eller et kontrolplasmid. Real-time RT-PCR blev anvendt til at verificere, at S100A6 overekspression plasmid øgede mRNA-niveauer af S100A6 i Panc-1-celler. Vi har registreret en betydelig stigning i niveauet af S100A6 mRNA i S100A6-overudtrykker celler, sammenlignet med kontrolceller (P 0,001) (. S1 Fig). Dernæst vi undersøgt effekten af ​​S100A6 udtryk på celle invasion in vitro. En sårhelende assay viste en signifikant stigning i sårheling sats i S100A6-overudtrykker celler, sammenlignet med kontrolceller, 24 og 48 timer (p = 0,006 og p 0,001, henholdsvis) (. Figur 1A og 1B). En transwell assay viste også øget migration og invasion i S100A6 overudtrykkende celler (p = 0,04 for migration assay, p = 0,006 for invasionen assay) (Fig. 1C og 1D). Disse data antyder, at S100A6 fremmer invasion af PDAC celler.

(A) sårhelende assay celler, der overudtrykker S100A6 (venstre), kontrolceller (højre). (B) Den sårhelende var signifikant højere i S100A6 overudtrykker celler, i forhold til kontrol-celler, ved 24 og 48 timer. (C) Transwell assay, “I” repræsenterer S100A6 overekspression i migration analysen; “II” betegner kontrolgruppen i migration assay; “III” repræsenterer S100A6 overekspression i invasionen assay; “IV” repræsenterer kontrolgruppen i invasionen assay. (D) repræsentativ statistisk diagram for Transwell assay viser en betydelig stigning i migration (I) og invasion (II) ved S100A6 overudtrykker celler, i forhold til kontrol-celler. * P 0,05; ** P 0.01.

S100A6 ændrer ekspressionen af ​​β-catenin og EMT-relaterede markører i PDAC celler

Når undersøger de mulige nedstrøms mediatorer af S100A6 med ansvar for fremme af PDAC celle migration og invasion vi bemærkede, at overekspression af S100A6 resulterede i en betydelig stigning i β-catenin-mRNA-niveauer i Panc-1-celler (p = 0,006) (fig. 2A). Eftersom EMT spiller en vigtig rolle i invasionen-metastase proces, vi fortsatte med at vurdere ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører. Ekspressionen af ​​epitel markør E-cadherin blev reduceret på mRNA-niveauet, mens ekspression af de mesenkymale markører N-cadherin og vimentin var forøget (p 0,001, p = 0,002 og p 0,001, henholdsvis) (fig. 2B). Vi undersøgte også proteinniveauer af β-catenin og EMT markører anvendelse af Western blotting, og bekræftede, at overekspression af S100A6 øgede ekspression af β-catenin (p = 0,024) (fig. 2C og 2D), faldt den for E-cadherin og øget ekspression af N-cadherin og vimentin (p = 0,009, p = 0,026, p = 0,044, henholdsvis) (fig. 2E og 2F). Tilsammen antyder disse resultater, at S100A6 hæver β-catenin-niveauer og ændrer ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører i PDAC celler.

(A) Overekspression af S100A6 resulterede i en signifikant stigning i niveauet af β-catenin-mRNA i Panc-1-celler. (B) Real-time PCR viste, at S100A6 overekspression resulterede i nedsat ekspression af E-cadherin, og forøget ekspression af N-cadherin og vimentin. (C) Western blotting viste, at S100A6 opreguleret β-catenin på proteinniveauet. (D) repræsentativ statistisk diagram viser øgede β-catenin-proteinniveauer sammenlignet med kontrollen. (E) Western blotting viste, at S100A6 overekspression resulterede i ændret ekspression af EMT-relaterede markører. Specifikt blev protein ekspression af E-cadherin reduceres, hvorimod ekspression af N-cadherin og vimentin blev forøget. (F) De relative protein niveauer af E-cadherin, N-cadherin og vimentin afveg betydeligt mellem S100A6-overekspression tilstand og kontrol. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

β-catenin shRNA ændret migration og invasion af PDAC celler in vitro

For at undersøge effekten af ​​β-catenin om migration og invasion af PDAC celler, vi brugte β- catenin shRNA at generere en stabil β-catenin knockdown Panc-1-cellelinien. Panc-1-celler transficeret med ikke-mål shRNA blev anvendt som kontrol. Knockdown af β-catenin blev bekræftet ved realtids-PCR og Western blotting (p 0,001 og p = 0,001, henholdsvis) (. S2 Fig). En sårhelende assay og transwell assay blev udført for at vurdere effekten af ​​β-catenin om migration og invasion. Den sårhelende assay viste, at knockdown af β-catenin signifikant inhiberede migration af PDAC celler sammenlignet med kontrollen tilstand ved begge 24 og 48 timer (p = 0,013 og p = 0,002, henholdsvis) (fig. 3A og 3B). Transwell assay viste nedsat migration og invasion i β-catenin knockdown celler, sammenlignet med kontrollen (p = 0,009 for migration assay, p = 0,015 for invasionen assay) (fig. 3C og 3D). Disse data indikerer, at inhibering af β-catenin reducerer migration og invasion af PDAC celler in vitro.

(A) sårhelende assay viste et signifikant fald i migration i β-catenin shRNA gruppe (venstre) i forhold til kontrolgruppen (højre). (B) Den sårhelende var signifikant lavere i S100A6-udtrykkende celler, sammenlignet med kontrollen, ved 24 og 48 timer. (C) Transwell assay viste, at β-catenin shRNA dramatisk faldt antallet af trækkende og invaderende celler (× 40). “Jeg” repræsenterer β-catenin shRNA i migration analysen; “II” betegner kontrolgruppen i migration assay; “III” betegner β-catenin shRNA i invasionen assay; “IV” repræsenterer kontrolgruppen i invasionen assay. (D) repræsentativ statistisk diagram for Transwell assay viser et signifikant fald i migration (I) og invasion (II) i β-catenin shRNA gruppe, sammenlignet med kontrolgruppen. * P 0,05; ** P 0.01.

β-catenin shRNA ændrer ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører i PDAC celler in vitro

For at vurdere, om β-catenin er involveret i EMT, vurderede vi udtrykket af EMT-relaterede markører på mRNA og protein niveauer i β-catenin-knockdown Panc-1 celler. Knockdown af β-catenin resulterede i øgede niveauer af E-cadherin mRNA, og nedsatte niveauer af N-cadherin og vimentin mRNA (p = 0,002, p 0,001 henholdsvis) (. Figur 4A). Western blotting-resultater vedrørende proteinekspression stemte overens med real-time RT-PCR data. Specifikt blev protein ekspression af E-cadherin forøget, mens ekspression af N-cadherin og vimentin blev reduceret (p = 0,004, p = 0,007 og p = 0,017, henholdsvis), i β-catenin-knockdown Panc-1-celler (Fig . 4B og 4C). Disse data antyder, at β-catenin ekspressionsniveauet korrelerer med ekspression af EMT-relaterede markører i PDAC celler.

(A) β-catenin shRNA resulterede i en signifikant stigning i niveauerne af E-cadherin-mRNA, og et betydeligt fald i niveauerne af N-cadherin og vimentin mRNA. (B) Western-blotting viste, at β-catenin shRNA resulterede i opreguleret protein ekspression af E-cadherin og nedreguleret protein ekspression af N-cadherin og vimentin. (C) De proteinniveauer ved E-cadherin, N-cadherin og vimentin var signifikant forskellige mellem β-catenin shRNA gruppe og kontrolgruppen. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

S100A6 fremmer PDAC celle migration og invasion via β-catenin aktivering in vitro

For at undersøge, om S100A6 fremmer PDAC celle migration og invasion via regulering af β-catenin, vi transficeret stabil β-catenin-knockdown Panc-1-celler med en S100A6 overekspression plasmid. Vi vurderede β-catenin-ekspression under anvendelse af real-time RT-PCR og Western blot-analyser. Der var ingen signifikante forskelle i mRNA og protein niveauer mellem de to grupper (p = 0,354 og p = 0,765, henholdsvis) (S3 Fig.). Disse resultater antyder, at β-catenin var faktisk stabilt slået ned, og at dens ekspression blev ikke påvirket af S100A6 overekspression. Dernæst udførte vi sårheling og transwell assays for at vurdere migration og invasion af disse celler. Den sårhelende assay viste, at migration ikke var signifikant forskellig mellem de to grupper, på 24 eller 48 timer (p = 0,983 og p = 0,875, henholdsvis) (fig. 5A og 5B). Resultaterne af transwell assay var i overensstemmelse med den sårhelende assay med ingen signifikant forskel mellem grupperne for enten migration eller invasion (p = 0,803 for migration assay, p = 0,659 for invasionen assay) (fig. 5C og 5D ). Disse data indikerer, at S100A6 har ingen effekt på migration og invasion i stabile β-catenin-knockdown PDAC celler. Dette antyder, at S100A6 fremmer PDAC celle migration og invasion via β-catenin aktivering in vitro.

(A) sårhelende assay viste ingen ændringer i migration af β-catenin-shRNA celler overekspression S100A6 (til venstre) sammenlignet med β-catenin-shRNA kontrolgruppe (højre). (B) Der var ingen signifikant forskel i sårhelende hastighed mellem de to grupper. (C) Der var ingen signifikant forskel i transwell analyseresultaterne mellem de to grupper med hensyn til både migration og invasion (× 40). “Jeg” repræsenterer β-catenin-shRNA + S100A6 overekspression i migration analysen; “II” repræsenterer β-catenin-shRNA + S100A6-kontrol i migration analysen; “III” betegner β-catenin-shRNA + S100A6 overekspression i invasionen assay; “IV” repræsenterer β-catenin-shRNA + S100A6-kontrol i invasionen analysen. (D) repræsentativ statistisk diagram for Transwell assay viser ingen signifikant forskel i migreringen (I) eller invasion (II) assays mellem de to grupper.

S100A6 fremmer EMT gennem aktivering af β-catenin

for at undersøge potentialet mekanistisk forhold mellem S100A6 og β-catenin i forhold til EMT i kræft i bugspytkirtlen, vi transficeret stabile β-catenin-knockdown Panc-1-celler med en S100A6 overekspression plasmid eller en kontrol plasmid, og evalueret udtryk for EMT-relaterede markører. Real-time RT-PCR viste ingen signifikante forskelle i mRNA-niveauer af E-cadherin, N-cadherin og vimentin mellem de to grupper (p = 0,227, p = 0,228 og p = 0,067, henholdsvis) (fig. 6A). Vi bekræftede, at proteinet niveauer af E-cadherin, N-cadherin og vimentin også ingen forskel de to grupper (p = 0,267, p = 0,638 og p = 0,940, henholdsvis) (fig. 6B og 6C). Disse resultater antyder, at S100A6 har nogen virkning på EMT-relaterede markører i stabile β-catenin-knockdown PDAC celler, hvilket indikerer, at S100A6 ændrer ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører via aktivering af β-catenin.

(A) Der var ingen signifikante forskelle i ekspression af EMT-relaterede markører mellem β-catenin-shRNA celler, der overudtrykker S100A6 og β-catenin-shRNA kontrol celler. (B) Western-blotting viste lignende ændringer i ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører i de to grupper. (C) Ingen signifikante forskelle blev set mellem de to grupper med hensyn til ekspressionen af ​​E-cadherin, N-cadherin og vimentin protein.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi viste, at S100A6 overekspression fremmer, og β-catenin shRNA inhiberer, PDAC cellemigration og invasion. Vi konstaterede, at S100A6 fremmer PDAC cellemigration og invasion via β-catenin-aktivering in vitro. Vi bekræftede også, at S100A6 ekspression korrelerer med den for β-catenin og at ekspressionen af ​​EMT-relaterede markører i PDAC celler modificeres af både S100A6 overekspression og β-catenin knockdown.

S100A6 er rapporteret at være opreguleret i en række af cancere, herunder lunge-, tyktarms-, hud, mave, bugspytkirtel duktalt adenokarcinom og andre epiteliale cancere [19]. Det forlyder, at forøget ekspression af S100A6 kan fremme celleproliferation og migration i humant hepatocellulært carcinom [20]. Endvidere kan serum S100A6 niveauer tjene som en potentiel prognostisk biomarkør i gastrisk cancer, og inhibering af S100A6 formindsker den metastatiske potentiale af gastriske cancerceller [21]. I pancreas carcinogenese, har immunhistokemiske assays blevet anvendt til at påvise, at Panin 1a celler ikke udtrykker S100A6, og at andelen af ​​positivt farvede celler forøges proportionalt med Panin kvalitet, med S100A6 mRNA-niveauer også stigende på en trinvis måde [22,23] .

en bred vifte af eksperimentelle modeller er tyder på en vigtig rolle for β-catenin i bugspytkirtelkræft metastaser [24]. Nowotny et al. [25,26] foreslog, at S100A6 kan have en virkning på calcyclin-bindende protein (CacyBP) /Siah-1 interagerende protein (SIP) og undertrykker af G2 allel af Skp1 (Sgt1). CacyBP /SIP blev identificeret som en S100A6-bindende protein, der er involveret i ubiquitinering og nedbrydning af β-catenin [27]. Sekvensen af ​​Sgt1 deler 20% identitet med den af ​​CacyBP /SIP. Endvidere blev Sgt1 og CacyBP /SIP fundet at binde Skp1 og aktivere Skp1p-cullin-F-box-protein (SCF) ubiquitinligase. Denne ligase er beskrevet i mammale celler som et kompleks, der regulerer ubiquitinering og nedbrydning af phosphoryleret β-catenin [28]. En anden undersøgelse [29] bekræftede, at CacyBP /SIP ikke detekteres i normale pancreas væv, men opdages i kræft i bugspytkirtlen. Vi spekulere derfor, at S100A6 påvirker nedbrydningen af ​​β-catenin via Cacy BP /SIP og Sgt1 i PDAC. I denne undersøgelse S100A6 induceret β-catenin-ekspression på både mRNA og protein niveauer. Desuden er både en sårhelende assay og et transwell assay viste, at S100A6 overekspression fremmer PDAC cellemigration og invasion.

I talrige modeller, herunder brystepitelceller og carcinoma cellelinier, Wnt /β-catenin pathway menes at inducere EMT. β-catenin er normalt bundet til E-cadherin, hvilket er vigtigt for celle-celle-forbindelser og cadherin cytoskelettet. Desuden kan β-catenin transport ind i kernen fremme ekspressionen af ​​EMT beslægtede gener [30]. Nogle undersøgelser [31-34] har bekræftet, at visse faktorer kan styre epitelial plasticitet og ændre metastase gennem β-catenin-afhængig regulering i PDAC, kolorektal cancer, hepatocellulært carcinom og brystkræft. Vores undersøgelse viste også, at β-catenin knockdown kan inducere opregulering af E-cadherin og nedregulering af N-cadherin og vimentin.

En nylig undersøgelse rapporterede, at S100A4, et medlem af S100 familien, kunne være en nøglefaktor at fremme EMT-processen i PDAC [35]. I denne undersøgelse har vi undersøgt forholdene mellem S100A6, β-catenin, EMT og PDAC celleinvasion. Vi bekræftede, at S100A6 kunne foranledige EMT i en β-catenin-afhængig måde, ved at demonstrere, at S100A6 kan fremme cellemigration og invasion gennem β-catenin in vitro. Den nøjagtige rolle S100 familie og beslægtede proteiner med hensyn til kræft i bugspytkirtlen er et vigtigt spørgsmål, der fortjener yderligere undersøgelse.

Konklusion

S100A6 kan fremkalde EMT og fremme celle migration og invasion i en β catenin-afhængig måde. S100A6 kan derfor udgøre en roman potentiel terapeutisk mål for PDAC.

Støtte Information

S1 Fig. Transfektion med S100A6 overekspression resulterede i en betydelig stigning i S100A6 mRNA-niveau

*** p 0,001

doi:. 10,1371 /journal.pone.0121319.s001

(TIF)

S2 Fig. β-catenin blev med succes slået ned i PDAC celler.

(A) Real-time RT-PCR viste et signifikant fald i β-catenin mRNA-niveauet i β-catenin shRNA Panc-1-celler. (B) Western-blotting viste et signifikant fald i β-catenin protein i β-catenin shRNA gruppe, i forhold til kontrollen. (C) Indholdet af β-catenin-protein var signifikant forskellige mellem de to grupper. ** P 0,01; *** P 0,001

doi:. 10,1371 /journal.pone.0121319.s002

(TIF)

S3 Fig. β-catenin-ekspression ikke opreguleret af S100A6 i β-catenin-knockdown stabile celler.

(A) Der var ingen signifikante forskelle i β-catenin mRNA niveauer mellem stabile β-catenin-knockdown celler overeksprimerer S100A6 og stabil p-catenin knockdown celler, der udtrykker kontrol plasmid. (B) Western-blotting viste lignende ændringer i β-catenin mellem de to grupper. (C) Der var ingen signifikante forskelle mellem β-catenin protein niveauer mellem de to grupper.

Engelsk i dette dokument er blevet kontrolleret af mindst to professionelle redaktører, både engelsk som modersmål. For et certifikat, skal du see:https://www.textcheck.com/certificate/GZTsUk

doi:10.1371/journal.pone.0121319.s003

(TIF)