PLoS ONE: En Multifunktionel Drug Kombination Viser meget potent terapeutiske virkning mod human Kræft i athymiske Mice

Abstrakt

Tumoren mikromiljø spiller en afgørende rolle under tumor udvikling. Integreret kombination af lægemidler, der er målrettet tumormikromiljøet er en lovende fremgangsmåde til anticancerterapi. Her rapporterer vi en multifunktionel kombination af lave-cytotoksiske lægemidler bestående af dipyridamol, bestatin og dexamethason (DBDx), der primært virker på tumor mikromiljø viser højpotente antitumor effekt

in vivo

. I muse hepatoma H22 model, viste den tredobbelte lægemiddelkombination synergistisk og højpotente antitumorvirkning. De kombination indekser af forskellige kombinationer af de tredobbelte narkotika var mellem 0,2 og 0,5. DBDx hæmmede væksten af ​​et panel af humane tumor-xenotransplantater og viste ingen indlysende systemisk toksicitet. Ved tolererede doser, DBDx undertrykte væksten af ​​humane hepatocellulært carcinom BEL-7402, HepG2 og lunge adenocarcinom A549 xenotransplantater med 94,5%, 93,7% og 96,9%, henholdsvis. Klongenicitetsassayet viste, at DBDx viste svag cytotoksicitet. Western blot viste, at Flk1 og NOS3 blev nedreguleret i DBDx-behandlede gruppe. Proteomisk analyse viste, at DBDx primært påvirket den metaboliske proces og immunsystemet proces; Derudover blev den angiogenese og VEGF signalvej også påvirket. Sammenfattende DBDx, et multifunktionelt stof kombination af tre lav-cytotoksiske lægemidler, viser synergistisk og højpotente antitumorvirkning åbenbart medieret af modulering af tumormikromiljøet. På baggrund af dets lave cytotoksiske egenskaber og dets bredspektret antitumor terapeutisk virkning, kan dette multifunktionelle kombination være nyttige til behandling af cancere, især dem resistente over for konventionelle kemoterapeutiske midler

Henvisning:. Liu XJ, Zheng YB, Li Y, Wu SY, Zhen YS (2014) En Multifunktionel Drug Kombination Viser meget potent terapeutiske virkning mod human Kræft i athymiske mus. PLoS ONE 9 (12): e115790. doi: 10,1371 /journal.pone.0115790

Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Center for Bioteknologi, Indien

Modtaget: Juli 4, 2014 Accepteret: December 1, 2014; Udgivet: 22 December, 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra “Betydelig nye lægemidler udvikling” Major videnskabelige og teknologiske projekter i Kina (nr 2012ZX09301002, http: //www.nmp. gov.cn) og National Natural Science Foundation of China (nr 81.201.665, https://www.nsfc.gov.cn). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en kompleks sygdom, der involverer ændringer i tumorceller og tumormikromiljøet [1]. Som rapporteret, tumormikromiljøet ændringer i forbindelse med tumor udvikling og fremmer tumorvækst og metastase [2], [3]. Anvendelser af lægemidler rettet mod tumormikromiljøet tilvejebringe en lovende strategi til cancerterapi [4] – [5]. Kombinationen af ​​lægemidler rettet mod tumormikromiljøet har vist sig at være effektiv i behandling af kræft [6] – [8]. Her rapporterer vi en multifunktionel lægemiddelkombination sammensat af dipyridamol (DPM), bestatin (BEN) og dexamethason (DEX), som hovedsagelig er rettet mod tumormikromiljøet og dens højpotente terapeutisk virkning.

Dipyridamole, en velkendt anti -thrombotic lægemiddel er en aktiv nukleosid transport inhibitor. Det kan øge antitumoraktiviteten af ​​mange antimetabolitter, såsom 5-fluoruracil og methotrexat [9]. Dipyridamol kan også forringe tumor mikromiljø og forebygge brystkræft progression i mus [10]. Bestatin (ubenimex), en aminopeptidase inhibitor, er vist diverse antitumoraktiviteter og immunmodulerende aktiviteter [11], [12]. Klinisk bestatin anvendes som en immunmodulator i kombination med kemoterapi eller strålebehandling [13]. Bestatin kan hæmme tumor celledeling og undertrykke tumor angiogenese [14], [15]. Dexamethason er et meget anvendt lægemiddel med glucocorticoid steroid familie med potente anti-inflammatoriske og immunosuppressive virkninger. I klinikker, er det ofte anvendes til behandling af inflammatoriske og autoimmune sygdomme. I tumorbehandling, er dexamethason almindeligvis anvendes til at lindre bivirkninger af kemoterapi [16]. Der er rapporter om, at dexamethason også kan undertrykke tumor angiogenese [17], [18].

I denne undersøgelse har vi designet en integreret, multifunktionel kombination herunder dipyridamol, bestatin og dexamethason og undersøgt dens antitumoraktivitet, især dets terapeutiske effekten

in vivo

. Vores forskning viser, at DBDx er en yderst effektiv, bredspektret antitumor kombination overvejende rettet mod tumor mikromiljø.

Materialer og metoder

Materialer

Dipyridamol og dexamethason blev opnået fra National institutter for Food and Drug Kontrol (Kina). Bestatin blev leveret af Apeloa Kangyu (Kina). For dobbelte eller tredobbelte kombinationer fremstilling blev agenterne blandedes ifølge de angivne doser i saltvand, derefter formalet og homogeniseret ved anvendelse af en morter. Gemcitabin (Gemzar) blev indkøbt fra Lilly, Frankrig. Gefitinib (IRESSA) var fra AstraZeneca. 5-FU var fra Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co., Ltd. Alle kemikalier og biokemiske midler anvendt var af analytisk kvalitet.

Cell kultur

Menneskelig hepatocellulært carcinom BEL-7402 celler blev opnået fra Shanghai Institut for Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Humane hepatocellulære carcinoma HepG2-celler blev indkøbt fra ATCC. Humane lungeadenocarcinom A549 celler og humane epidermoide carcinomaceller A431 celler blev opnået fra Cell Center Institut for Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College. Humane pulmonale kæmpe celle karcinom PG celler blev opnået fra Patologisk Institut, Peking University Health Science Center. Alle disse cellelinier blev kryokonserveret i vores laboratorium og dyrket ved 37 ° C i RPMI-1640-medium (Gibco BRL Inc.) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco BRL Inc.), 2 mM glutamin, 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

In vivo terapi studie

Alle Kunming mus og NIH (nu /nu) athymiske mus blev købt fra Vital River Laboratories (Beijing, Kina).

I mus hepatoma 22 (H22) model, kvindelige Kunming mus (18-22 g) blev tilfældigt delt med 10 mus for hver gruppe. På dag 0 blev murine hepatomceller 22 celler fra ascites af tumorbærende mus transplanteret subkutant i højre armhulen region med 1,5 × 10

6 celler /mus. Fra dag 3 til dag 12 blev de tumorbærende mus behandlet oralt med saltvand, enkelte midler, dobbelte eller tredobbelte kombinationer hhv. 5-FU blev administreret med den samme tidsplan men givet intraperitonealt. På dag 14 blev alle mus aflivet. Tumorvægte blev målt og hæmningen satser af tumorvækst blev beregnet. Kombinationsindeks (CI) blev analyseret ifølge Chou og Talalay-fremgangsmåden [19].

hepatom BEL-7402 xenograft model, human hepatomaceller BEL-7402 celler (1 x 10

7) suspenderet i 200 uL saltvand blev podet subkutant (sc) i højre armhule kvindelige NIH

(nu /nu)

atymiske mus (18-22 g). Efter 3 uger blev tumorer dissekeret og stykker af tumorvæv (2 mm

3 i størrelse) blev transplanteret subkutant af en trokar i athymiske mus. Når tumorstørrelsen nåede ca. 100 mm

3 (dag 7) blev musene delt med 6 mus pr gruppe og behandlet oralt med saltvand eller lægemiddelkombinationer i forskellige doser henholdsvis én gang dagligt, 5 på hinanden følgende dage om ugen i 2 uger . Tumorstørrelse og kropsvægt blev målt hver 3-4 dage. Tumor volumen blev beregnet med formlen: V = ab

2/2, hvor

en

repræsenterer den langsgående diameter og

b

den vinkelrette diameter. Inhiberingsforholdene satser tumorvækst blev beregnet efter den tumorvolumen.

I hepatom HepG2 xenograft model, lungecarcinom A549 xenograft model, lungecarcinom PG xenograftmodel og epidermoid carcinom A431 xenograft model, tumorer blev inokuleret i athymiske mus som beskrevet i BEL-7402 model. Skemaer for lægemiddeladministration blev beskrevet i resultaterne.

klongenicitetsassayet

BEL-7402 celler af eksponentiel vækst blev podet ved 50 celler pr brønd i 96-brønds plader og dyrket i 24 timer ved 37 ° C. Så forskellige koncentrationer af lægemidler blev tilsat i tre eksemplarer, og cellerne blev dyrket i yderligere 7 dage. Kolonier af mere end 50 celler blev talt. De overlevelse fraktioner blev beregnet efter følgende formel: overlevelse fraktion (%) = tællinger af test brønde /tællinger af kontrol såvel × 100%

Akut toksicitet test

Kunming mus (18-. 22 g, halvt mandlige og halv kvinde) blev tilfældigt inddelt i 4 grupper med 20 mus per gruppe. DBDx (forhold mellem dipyridamol, bestatin, og dexamethason var 100, 20, og 1) blev givet oralt i en enkelt dosis på 0, 1,28, 1,6 og 2 g /kg hhv. Kropsvægt af mus, neurologisk respons og adfærd abnormitet blev nøje overvåget i 14 dage.

Western blot-analyse

I H22 model, 3 dage efter tumor implantering, DBDx på 242 mg /kg blev givet oralt, én gang dagligt i 10 dage. På dag 14 blev tumorvæv isoleret, 5 vævsprøver blev taget fra hver gruppe. Tumorvævene blev lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat 100 ug /ml phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 ug /ml aprotinin , pH 8,0) og homogeniseret med en håndholdt homogenisator. Lysaterne blev centrifugeret ved 12 000 rpm i 10 min, og supernatanterne indeholdende protein blev kvantificeret under anvendelse af et BCA-proteinassay-kit (Pierce).

Proteinprøverne blev elektroforesebehandlet på 10% SDS-PAGE og overført til PVDF membran. Efter blokeret med 1% BSA blev membranen inkuberet med primært antistof (Santa Cruz) og HRP-konjugeret sekundært antistof (Zhongshan Inc.), sekventielt. Den immunreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af Western blot luminol reagens (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), og billedet blev taget med billedanalyse-system (AIO Inc.).

Prøveforberedelse for todimensional forskellen gelelektroforese

BALB /c athymiske mus, der bærer BEL-7402 xenotransplantater blev inddelt i to grupper, 5 mus i hver gruppe. En gruppe mus blev behandlet med 242 mg /kg DBDx, en gang om dagen i 10 dage; en anden gruppe mus blev administreret med saltvand som kontrol. Næste dag efter den sidste administration blev musene aflivet. Tumorvæv blev opsamlet og lynfrosset med flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C, indtil den forarbejdes.

Protein prøveforberedelse, todimensional elektroforese (2-DE) og massespektrometri (MS) blev udført ved Beijing Protein innovation.

Proteinprøver blev fremstillet ved anvendelse af trichloreddikesyre (TCA)-acetone nedbør metode. Kort fortalt, omkring 50 mg tumorvæv nedfrosset i flydende nitrogen tidligere blev knust af en metal morter, og suspenderes derefter med 10% TCA i acetone indeholdende 1 mM PMSF, 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 10 mM dithiothreitol (DTT) til 2 timer. Efter centrifugering blev det udfældede protein vasket med forafkølet acetone. Pelleten blev opløst i lyseringsbuffer indeholdende 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 8 M urinstof, 4% 3 – [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] – 1-propansulfonat (CHAPS), 0,5% Pharmalyte (pH 3-10L ), 10 mM DTT, 1 mM PMSF og 2 mM EDTA. Lysatet blev sonikeret i 5 minutter efterfulgt af centrifugering ved 40 000 g i 15 min. Supernatanten protein blev kvantificeret ved anvendelse af Bradford-metoden. De “blandede proteinsamlinger” blev fremstillet ved at blande lige store mængder af protein fra 5 tumor prøver af den samme gruppe i 2-DE.

2-DE og billedanalyse

“blandede proteinprøver “(200 ug) blev blandet med rehydrering buffer og påført på en 18 cm lineære IPG strimler, pH 3-10 (Amersham Biosciences, Sverige) .Derefter strimlerne blev underkastet isoelektrisk fokusering i IPGphor (Amersham Biosciences, Sverige). De fokuserede strimler blev derefter nedsat med 1% DTT og alkyleret med 2,5% iodacetamid (IAM) i ækvilibreret puffer (6 M urinstof, 30% glycerol, 2% SDS og 50 mM Tris-HCI, pH 8,8). De behandlede strimler blev overført til 12% SDS-PAGE i Ettan Dalt II System (Amersham Biosciences, Sverige) i den sekundære elektroforese. De analytiske geler blev farvet med sølvfarvning uden tilsætning af glutaraldehyd. De farvede geler blev scannet under anvendelse af et Imagescanner (Amersham Biosciences, Sverige), og billederne blev analyseret ved anvendelse Image Master 2-D Platinum version 3.0 (Amersham Biosciences, Sverige).

MS og proteinidentifikation

den differentielle ekspression pletter blev udskåret fra gelerne og anbragt i Eppendorf-rør. Gelstykkerne blev reduceret med 10 mM DTT og alkyleret med 55 mM IAM. Derefter blev gelerne sekventielt ækvilibreret med 25 mM ammoniumbicarbonat, 50% acetonitril (ACN) 25 mM ammoniumbicarbonat og 100% ACN i 10 minutter, efterfulgt udtørret i en vakuum centrifuge i 10 min. De tørrede geler blev rehydreret i fordøjelsen opløsning (0,01 ug /ml trypsin opløst i 25 mM ammoniumbicarbonat) på is i 30 min, og inkuberet i 25 mM ammoniumbicarbonat (10-15 pi) natten over ved 37 ° C. Fordøjelsen standsedes ved anvendelse af 0,1% trifluoreddikesyre (TFA). De spaltede peptider blev plettet på målet (AnchorChip ™, Bruker, Tyskland) og co-krystalliseret med α-cyan-4-hydroxykanelsyre (CHCA, 4 mg /ml i 70% ACN og 0,1% TFA). Så de tørrede matricer blev analyseret ved en Ultraflex MALDI-TOF /TOFII MS (Bruker, Tyskland) drives i reflektoren mode i m /z mellem 600 og 4 000 Kalibrering for PMF (peptidmassefingeraftryk) prøver blev udført eksternt ved hjælp en blanding af standard peptider og indvendigt med peptidfragmenterne trypsin autolyse produkter. Ifølge PMF signalerne, blev de tre højeste peptider med højere nøjagtighed og højere overflod yderligere analyseret i MS /MS-tilstand. PMF blev analyseret med MASCOT (Matrix Science, UK) mod NCBInr database. En masse nøjagtighed tolerance var tilladt inden for 100 ppm. Protein identifikationer blev udført baseret på sandsynlighed-baserede Mowse scoring algoritme med et konfidensniveau på 95% .Derefter de identificerede proteiner blev analyseret ved hjælp af PANTHER (proteinanalyse gennem Evolutionary Relationships) klassifikationssystem (www.pantherdb.org) .Den systemet er designet til klassificere proteiner (og deres gener) og kategoriserer dem i henhold til familie og underfamilie, molekylær funktion, biologiske processer, og veje.

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité for Animal Forsøg fra Institut for Medicinalkemi Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences (IMBF20060302). Studieprotokollerne overholder anbefalingerne i forordningen for Forvaltning af forsøgsdyr af Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina.

Resultater

Triple kombinationer viste forbedret og synergistisk antitumorvirkning

antitumorvirkningen af ​​tredobbelte kombinationer sammensat af DPM, BEN og DEX blev først sammenlignet med enkelte midler eller dobbelte kombinationer i muse hepatoma H22 model. Efter 3 dages tumorimplantation (tumorvolumen: 250 ± 30 mm

3), blev medikamenter gives oralt, én gang dagligt i 10 dage. På dag 14 blev musene aflivet, og tumoren vægt blev målt. Ved de angivne doser i tabel 1 inhiberingen satser af respektive enkelte midler varierede fra 22,8% til 68,6%. For de dobbelte kombinationer inhiberingen satser var fra 58,7% til 66,3%. CI værdier dobbelte kombinationer var 0,8-1, angives additive eller lidt synergistiske virkninger. For de tredobbelte kombinationer blev 3 × 3 grupper af kombinationer studeret som vist i tabel 1. Når tre lægemidler kombineres sammen inhiberingen satser klatrede op til 79,2% -89,4%, hvilket var statistisk forskellig fra den af ​​relevante enkelte midler eller dobbelte kombinationer . De Cl-værdier for alle tredobbelte kombinationer var mellem 0,2 og 0,5, angivet synergistisk antitumorvirkning. For at lette stof kombination undersøgelsen, dosis forholdet mellem DPM, BEN og DEX blev fastgjort til 100:20:1 (masse) og navngivet DBDx.

DBDx viste yderst potent antitumor aktivitet mod humane tumorxenoplantater

antitumor effekt af DBDx blev yderligere evalueret i human hepatocellulært carcinom BEL-7402 xenograftmodel. Efter 7 dages tumorimplantation blev forskellige doser af DBDx givet oralt, én gang dagligt i 10 dage. Saltvand blev givet til mus i kontrolgruppen. På dag 17, DBDx ved 121, 242 og 363 mg /kg inhiberede tumorvækst med 73,0%, 88,1% og 94,5% vurderet ved tumorvolumen henholdsvis statistisk signifikant forskellig fra den for kontrolgruppen (P. 0,01, figur 1 .EN). Især efter dissektion, blev det konstateret, at den implanterede tumor forsvandt i 2 af 8 mus (fig. 1.B) .De tumorvægte blev vist i fig. 1.B. Under forsøgene var det organ vægttab af det behandlede mus mindre end 10% i forhold til legemsvægten ved starten af ​​eksperimentet (fig. 1.C). I et andet uafhængigt forsøg, blev medikamenter administreres som ovenfor, efter 10 dages behandling de langsigtede antitumorvirkninger af DBDx blev evalueret. På dag 60, nemlig 44 dage efter den sidste behandling, DBDx på 242, 363 og 484 mg /kg inhiberede tumorvækst med 56,4%, 71,9% og 69,2% vurderet ved tumorvolumen, (fig. 1.D), hvilket var i overensstemmelse med de tumor vægtdata (fig. 1.E). Legemsvægten af ​​behandlede grupper udviste mindre fald (10%) under behandlingen, mens forøget ved afslutningen af ​​forsøgene, hvilket indikerer, at de administrerede doser var veltolereret (fig. 1.F).

A. DBDx inhiberede tumorvækst på en dosis-afhængig måde. B. På dag 17 blev musene aflivet. Tumorer blev fotograferet og tumorvægte blev målt. C. legemsvægte af mus under de 17 dages forsøg. D. På lang sigt eksperimentet, på dag 60, nemlig 44 dage efter den sidste behandling, DBDx kunne stadig hæmme tumorvækst. E. Ved slutningen af ​​eksperimenterne blev mus aflivet, og tumorvægte blev målt. F. dyrekroppen vægtene af alle grupper i løbet af 60 dage eksperimentet. (Dosis: mg /kg). Statistisk signifikans blev bestemt ved t-test; ** P. 0,01 sammenlignet med kontrol

Desuden blev antitumorvirkningen af ​​DBDx evalueret med andre menneskelige kræft implanteret, herunder menneskelige hepatocellulært carcinom HepG2 og lunge adenocarcinom A549. Lægemidler blev administreret oralt, én gang dagligt, 5 på hinanden følgende dage om ugen i 3 uger (7-11 D, 14-18 d, 21-25 d). I HepG2 model, på dag 28, DBDx ved 121, 242 og 484 mg /kg inhiberede tumorvækst med 61,9%, 72,3% og 93,7% vurderet ved tumorvolumen, (fig. 2. A). I mellemtiden, 5-FU med 15 mg /kg inhiberede tumorvækst med 42%. De tumorvægte for alle grupper er vist i fig. 2.C. I A549 model, på dag 28, DBDx ved 121, 242 og 484 mg /kg inhiberede tumorvækst med 89,5%, 94,9% og 96,9% vurderet ved tumorvolumen, (fig. 2.B). De tumorvægte blev vist i fig. 2.D. Åbenbart, behandlede dyr veltolereret til alle ovennævnte doser af DBDx. Som vist i fig. 2.E og F, ved afslutningen af ​​eksperimentet, forekom ingen dødsfald, og legemsvægttab var mindre end 10% i alle behandlede mus af forskellige dosisgrupper, hvilket indikerer, at de behandlede dyr veltolereret med de administrerede doser af DBDx.

A, C og E. tumor vækstkurve, tumorvægt ved slutningen af ​​eksperimentet og summen af ​​mus af alle grupper i HepG2 xenograftmodel krop. B, D og F. Tumorvækst kurve, tumorvægt ved slutningen af ​​eksperimentet og summen af ​​mus af alle grupper i A549 xenograft model krop. (Dosis: mg /kg). Statistisk signifikans blev bestemt ved t-test; ** P 0,01 sammenlignet med kontrol

Sammenligning af antitumor effekt af DBDx med andre kemoterapi narkotika

antitumor effekt af DBDx blev yderligere sammenlignet med gemcitabin (GEM) og gefitinib.. Som det er velkendt, GEM, en antimetabolit lægemiddel, er almindeligt anvendt i klinikker til behandling af lungecancer, pancreascancer, etc. I human lungecarcinom PG xenograftmodel blev antitumoraktiviteten af ​​DBDx sammenlignet med virkningen af ​​GEM. Syv dage efter tumorimplantation blev DBDx givet oralt, én gang dagligt i 10 dage. GEM fik i.p. på dag 7, 10 og 13, i alt tre doser. Som vurderet med tumorvolumen på dag 17, GEM inhiberede tumorvækst med 65,2%, mens DBDx inhiberede tumorvækst med 82,6%, hvilket var signifikant forskellig fra den for GEM (P 0,05, figur 3.A.). På dag 35, DBDx stadig udøves hæmning af tumorvækst ved 57,1%.

A. DBDX udviste stærkere antitumoraktivitet end GEM i PG xenograft model. B. DBDX viste lignende antitumorvirkning med gefitinib i A431 xenograft model. C. legemsvægte af PG xenograft-bærende mus under behandling. D. legemsvægte af A431 xenograft-bærende mus under behandling. (Dosis: mg /kg).

Gefitinib er en EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren. For sammenlignende undersøgelse blev effekten af ​​DBDx og gefitinib evalueret med den humane epidermoide carcinom A431 xenograft model, hvor EGFR er højt udtrykt. DBDx og gefitinib blev hver givet oralt, én gang dagligt i 10 dage. Som vist i fig. 3B viste DBDx lignende antitumorvirkning med gefitinib. På dag 17, inhiberingshastigheden for DBDx på 242 mg /kg var 84,3%, mens gefitinib ved 100 mg /kg inhiberede tumorvækst med 84,8% hhv.

Både i PG og A431 modeller, kropsvægten tab af behandlede grupper var mindre end 11%, og legemsvægten af ​​behandlede mus i alle grupper steg i slutningen af ​​eksperimentet, hvilket indikerer, at de behandlede dyr veltolereret med administrerede doser af DBDx og gefitinib (fig. 3C, D )

Toxicopathological undersøgelse

i HepG2 xenograftmodel beskrevet ovenfor, på dag 28, DBDx på 242 mg /kg hæmmede tumorvækst med 72,3%, histopatologisk undersøgelse (afsnit farvet med H E) viste ingen tegn på toksikologisk skader i lever, nyre, mave, tyndtarm, knoglemarv, lunge, hjerte og milt (fig. 4).

histopatologisk undersøgelse i HepG2 xenograft-bærende mus i kontrolgruppen og gruppen behandlet med DBDx. Ingen patologiske ændringer blev fundet i lever, nyre, mave, tarm, knoglemarv, lunge, hjerte og milt i DBDx-behandlede dyr (H vækstfaktorreceptorer såsom EGFR (EGF-receptor), Flk1 (VEGF receptor 2); proteiner relateret til tumorcelleoverlevelse og apoptose såsom Bc-2 og survivin; og nogle andre proteiner såsom NOS3. Som følge heraf blev to proteiner Flk1 og NOS3 fundet at være nedreguleret i DBDX-behandlede gruppe (fig. 5).

Fem tumor vævsprøver taget fra hver gruppe af hepatoma 22 (H22) transplanteret Kunming mus blev anvendt.

Dernæst den globale protein forskellen mellem saltvand kontrol og DBDx-behandlede grupper blev sammenlignet med 2-dE og MS. Tumorvæv fra human leverkarcinom BEL-7402 xenograft i athymiske mus blev anvendt. Omkring 700 protein spots blev vist pr gel. Fig. 6 viste repræsentative protein-profil opnået fra 2-DE. Statistisk analyse af den normaliserede volumen af ​​matchede pletter afsløret 33 proteinpletter hvis intensitet viste 3-fold forskel mellem saltvand og DBDX-behandlede grupper. Fra disse protein spots blev 17 differentielt udtrykte proteiner identificeret (tabel 3). Blandt disse identifikationer, 12 var enestående i to grupper, 4 nedreguleres og 1 opreguleret i DBDx-behandlede gruppe. Andre relevante oplysninger anført i tabel 3 omfattede NCBI accessionsnumre, fold ændret, maskot score, teoretisk og eksperimentel molekylvægt, teoretisk og eksperimentel pI og sekvens dækning.

Efter separation på 17 cm, pH 3-10 lineær strimler i den første dimension og på en 12% SDS-PAGE i den anden dimension blev proteiner farvet med sølv. A. Saline-behandlede gruppe. B. DBDx-behandlede gruppe. Protein pletter markeret på kortene blev udskåret fra geler og sekventielt identificeret af MS.

Så disse identificerede proteiner blev kategoriseret efter biologisk proces og signal pathway hjælp PANTHER klassifikationssystem. Analyse af den biologiske proces viste, at metaboliske proces (40,6%) og immunsystemet fremgangsmåde (12,5%), hovedsagelig påvirket af DBDx behandling. Andre biologisk proces påvirket af DBDx inkluderet celle kommunikation, cellulær proces, reaktion på stimulus, systemet proces, transport og apoptose og generering af prækursor metabolitter og energi (fig. 7A). Analyse af de cellulære signalveje viste, at angiogenese, VEGF-signalvejen og glycolyse omfattede 42,9% af de signalveje, der berøres af DBDx behandling (fig. 7B). Andre berørte veje inkluderet apoptose signalvejen, endothelin signalvejen, Huntington sygdom, interleukin signalvejen, PI3 kinase pathway, Parkinsons sygdom, pyruvat stofskifte, og p38 MAPK pathway.

Diskussion

drug kombinationer er meget udbredt i kræftbehandlingen i over et halvt århundrede. Det er en rationel og effektiv strategi for at øge terapeutiske virkning, mens mindske toksicitet og overvinde modstand. I den foreliggende undersøgelse, vi foreslog en tumor mikromiljø-orienteret, multifunktionelle stof kombination strategi, der sigter mod en meget potent terapeutisk effekt

in vivo

. En tredobbelt stof kombination, der omfatter dipyridamol, bestatin og dexamethason er designet og dets terapeutiske virkning er blevet bekræftet. DBDx, den tredobbelte lægemiddelkombination er unik for omfattende andre end konventionelle kemoterapeutika lave cytotoksiske midler og til opnåelse af bemærkelsesværdige terapeutisk effektivitet ved godt tolererede dosisniveauer. Generelt undersøgelse af terapeutisk effekt

in vivo

med eksperimentelle tumor systemer, især humane cancer i athymiske mus, er af særlig betydning for vurderingen af ​​anticancer midler. Som vist DBDx er yderst effektiv mod vækst af humane hepatocellulært carcinom BEL-7402 xenograft. Ud over at reducere tumorstørrelse markant, DBDx behandling selv forårsagede den implanterede tumor helt forsvundet i 2 ud af 8 mus.

Især DBDx vises en bredspektret antitumoraktivitet. Når dosen af ​​DBDX nåede 484 mg /kg, en tolerabel dosering inhiberingen satser var op til 90% i alle de testede xenograftmodeller, herunder menneskers hepatocellulært carcinom HepG2, lungeadenocarcinom A549, lunge giant cell carcinoma PG, og epidermoid carcinoma A431 implanteret. Det bredspektrede antitumoraktivitet indebærer, at DBDx kan handle hovedsageligt via modulering tumormikromiljøet; Det er derfor relativt uafhængig af tumortype. Endvidere kombinationen af ​​3 lægemidler med forskellige virkningsmekanismer kan også give multimodal dækning af et bredt spektrum af tumorer.

I lægemiddelkombinationer, den terapeutiske aktivitet er ikke kun afhængige af dosis intensitet, men også på de doseringsforhold af de kombinerede komponenter. Nogle forhold af kombinerede lægemidler kan være synergistisk, mens andre forhold af de samme midler kan være additiv og endda antagonistiske [20]. I alle vores testede kombinationer, de tre agenter handlet synergistisk (CI: 0,2-0,5). Som det er kendt, kan synergistisk kombination forøge den terapeutiske virkning ved tolererede doser og forsinke udviklingen af ​​lægemiddelresistens [21]. Det er af interesse, at de tre agenter DBDx kombination er ikke konventionelle cytotoksiske kemoterapeutika; derimod de hovedsagelig påvirke tumor mikromiljø. Derfor kan denne multifunktionelle stof kombination være i stand til at reducere fremkomsten af ​​resistens.

Selvom DBDx viser højpotente antitumor effekt

in vivo

, viser klongenicitetsassayet at denne kombination ikke viser potent cytotoksicitet

in vitro

. Det indikerer, at hæmning af tumorvækst ved DBDx

in vivo

ikke hovedsagelig afhænge af drabet af tumorceller direkte; derimod kan DBDx udøve sin antitumorvirkning overvejende gennem forstyrre tumormikromiljøet. Som rapporteret, dipyridamol er en aktiv inhibitor af nukleosid transport. Bestatin kan målrette til aminopeptidase N og inhibere tumorangiogenese [15]. Dexamethason kan også undertrykke angiogenese [17]. Vores mekanistiske undersøgelser vist, at DBDx nedregulerede ekspressionen af ​​Flk1, en receptor for VEGF, og NOS3, som kan regulere vaskulær funktion [22]. Ud over at fungere på tumorangiogenese, DBDx påvirker også immunsystemet og inflammation. Som rapporteret, inflammation spiller en vigtig rolle i tumorigenese og udvikling [23], [24]. Bestatin er en udbredt immunomodulator mod tumor. Dexamethason er et anti-inflammatorisk lægemiddel. En nylig rapport viser, at dipyridamol signifikant nedsætter immunforsvaret celleinfiltration og serum inflammatoriske cytokiner niveauer i mus [9]. Virkningerne af DBDx på tumor mikromiljø blev yderligere bevist af 2-DE og efter PANTHER analyse. Klassifikation af differentielt udtrykte proteiner ved de cellulære signalveje afslørede, at DBDx hovedsagelig påvirket angiogenese og VEGF-signalvejen. Analyse af den biologiske proces viste, at immunsystemet proces blev påvirket.