PLoS ONE: Mouse Model for ROS1-omarrangeret Lung Cancer

Abstrakt

Genetisk omlægning af

ROS1

receptortyrosinkinase blev for nylig identificeret som en særskilt molekylær signatur for menneskets ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). er dog fortsat, direkte beviser for lunge carcinogenese induceret af

ROS1

fusion gener, der skal kontrolleres. Nærværende undersøgelse viser, at

EZR-ROS1

spiller en væsentlig rolle i onkogenese af NSCLC huser fusionsgenet.

EZR-ROS1

blev identificeret i fire kvindelige patienter af lunge adenocarcinom. Tre af dem var aldrig rygere. Interstitiel sletning af 6q22-Q25 resulterede i gen-fusion. Ekspression af fusions-kinase i NIH3T3-celler induceret vækst forankringsuafhængig

in vitro

og subkutane tumorer i nøgne mus. Dette transformerende evne var tilskrives dens kinase-aktivitet. Den /MET /ROS1 kinase inhibitor, crizotinib, undertrykt fusion-induceret forankringsuafhængig vækst ALK af NIH3T3 celler. Vigtigst, etablerede transgene muselinjer specifikt udtrykker EZR-ROS1 i lunge alveolære epitelceller udviklet flere adenocarcinom knuder i begge lunger i en tidlig alder. Disse data tyder på, at

EZR-ROS1

er en central onkogen i human NSCLC, og at denne dyremodel kunne være værdifulde for at udforske terapeutiske midler mod

ROS1

-rearranged lungekræft.

Henvisning: Arai Y, Totoki Y, Takahashi H, Nakamura H, Hama N, Kohno T, et al. (2013) musemodel for ROS1-omarrangeret Lung Cancer. PLoS ONE 8 (2): e56010. doi: 10,1371 /journal.pone.0056010

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: Oktober 3, 2012; Accepteret: 4 Jan 2013; Publiceret: 13. februar 2013 |

Copyright: © 2013 Arai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Program til fremme af grundlæggende Studier i Health Sciences fra National Institute of Biomedical Innovation, National Cancer center for Forskning og Udvikling Funds (23-A-7 og 23-B-28), Forskning Grant af Prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund og Tilskud-i-Aid fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd for 3. sigt Omfattende 10-årig strategi for Cancer Control. National Cancer Center Biobank er støttet af National Research and Development Fund Cancer Center, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald verden over [1]. Lung adenocarcinom (LADC), den mest almindelige form for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), består af flere forskellige genomiske undergrupper defineret af unikke onkogene ændringer, og en betydelig del af LADC sager havnen driver ændringer i

EGFR, KRAS

ALK

gener ved gensidigt udelukkende måde med sjældne undtagelser [2] – [5]. Forståelse af molekylære basis for kræft giver os mulighed for at udvikle terapeutiske midler, der er målrettet genetiske druggable aberrationer identificeret i cancerpatienter genomer. Tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) der er målrettet mod EGFR og ALK-proteiner er særligt effektive til behandling af LADC transporterer

EGFR

mutationer og

ALK Salg fusioner henholdsvis [2] – [6]. Men udviklingen af ​​en effektiv TKI kræver eksperimentel validering af de genetiske afvigelser som handlingsrettet og druggable,. Transgene musemodeller huser

EGFR

mutationer eller

EML4-ALK

genfusioner har med succes demonstreret onkogene potentiale disse ændringer og virkningen af ​​TKI-behandling [7], [8]. Genetisk omlægning af

ROS1

blev for nylig identificeret som en særskilt molekylær signatur til human LADC [9] – [16]. I den foreliggende undersøgelse, vi etableret en musemodel af

ROS1

fusion, og viste, at

EZR-ROS1

som en vigtig drivkraft onkogen i lunge carcinogenese.

Resultater

Identifikation af EZR-ROS1 Fusion Gene i LADC af Never-rygere

Hele transkriptom high-throughput sekventering af tumor prøver er en af ​​de mest effektive metoder til at identificere fusion onkogener [17]. Analyse af fem LADC tilfælde aldrig-rygere uden

EGFR /KRAS /ALK

ændringer ved hjælp transkriptom sekventering identificeret 56 læser tvingende in-frame

EZR-ROS1

gen fusion punkt forbinder

EZR

exon 10 til

ROS1

exon 34 i én tumor. RT-PCR-analyse af matchede ikke-kræft væv bekræftede tumor-specifikt udtryk for det fusion udskrift (figur 1A). Desuden transkriptom sekventering klart demonstreret en specifik stigning i ekspressionen af ​​det fusionerede 3 ‘del af

ROS1

(exon 34 til 43) efter breakpoint, tyder på, at

EZR-ROS1

fusion transkript forårsager aberrerende overekspression af

ROS1

tyrosinkinasedomæne sammen med 5′-delen af ​​

EZR

(figur 1B). SNP-array komparative genomisk hybridisering (array CGH) data viste, at denne fusion genet blev genereret af en stor interstitiel sletning spænder ~41.5 Mb på kromosom 6q22-Q25 (Figur 1C). Genomisk PCR og sekventering analyse afslørede også sletning af 41,5 Mb forårsager somatiske fusioner af

EZR

intron 10 på 6q25 med

ROS1

intron 33 på 6q22 (Figur S1).

(A) Junction læser repræsenterer

EZR-ROS1

fusion udskrifter i LCY66T prøve (til venstre). Sanger sekventering af RT-PCR-produkt valideret tumorspecifikt fusion i ramme transkript (højre). m: molekylær markør. (B) Expression profiler af

EZR

og

ROS1

i LCY66T. Aktiv udtryk for

ROS1

genet blev observeret efter fusion punkt. (C) SNP vifte CGH analyse af LCY66T. Kopiér nummer hele kromosom 6 er plottet som log2 ratio.

RT-PCR og Sanger sekventering analyse af 569 LADC prøver fra japanske enkeltpersoner, herunder de ovennævnte sager (343 sager med tidlig patologisk stadium og 226 sager med fremskredent stadium), identificeret fire sager huser denne fusion udskrift (Figur S2). Alle fire

EZR-ROS1

fusion-positive tilfælde var kvinder, og nærede hverken

EGFR-service /

KRAS /HER2

mutationer eller

EML4-ALK /KIF5B-RET

fusioner. Tre sager var dårligt differentierede adenokarcinomer af aldrig rygere, og den anden var en moderat differentieret adenocarcinom af en ryger.

Transforming Aktivitet af EZR-ROS1

EZR-ROS1

cDNA isoleret fra tumorprøve kodede for et protein af 858 aminosyrer (figur 2a; GenBank /DDBJ accession number AB698667). Proteinet forbinder FERM domænet [18] af ezrin (EZR) med de transmembrane og kinasedomæner af ROS1, men mangler det meste af den coiled-coil domæne af EZR.

(A) Skematisk repræsentation af EZR, ROS1 , EZR-ROS1, og sletninger /mutationer af EZR-ROS1 gener. Domænet organisation er vist. C-C: coiled-coil-domæne; TM: transmembrane; C-ERMAD: C-terminale ERM associeret domæne. (B) ROS1 fosforylering i vildtype og mutant EZR-ROS1 (E /R) udtrykkende NIH3T3 kloner. Cellelysater fra hver klon blev immunoblottet med anti-V5-tag (øverst) og anti-phosphoryleret ROS1 (Tyr-2274, nederst) antistoffer. (C) Suppression af ROS en kinase aktivitet EZR-ROS1 ved crizotinib hæmmer STAT3 aktivering. NIH3T3-celler transficeret med 1: tom vektor, 2: vildtype EZR-ROS1, 3: KD 4: DL1, 5: DL3 var serum sultet og behandlet i 2 timer med DMSO eller 1 uM crizotinib, og immunoblottedes med de relevante antistoffer . β-actin blev anvendt som en loading kontrol. E /R: EZR-ROS1, p-E /R: phosphoryleret EZR-ROS1 påvises med en anti-phosphotyrosin-2274 antistof ROS1. (D) blød agar-kolonidannelse af vildtype og mutant EZR-ROS1 udtrykkende NIH3T3-kloner. Et repræsentativt billede af kolonidannelse for hver klon er afbildet øverst (skala bar, 100 pm). Antallet af kolonier opnået for hver klon er afbildet i bunden. * P 0,05. (E) Crizotinib-induceret undertrykkelse af forankringsuafhængig vækst NIH3T3 celler, der udtrykker EZR-ROS1. Søjlediagram, som viser procentdelen af ​​NIH3T3 kolonier induceret af

EZR-ROS1

eller

CCDC6-RET

efter behandling med 200 nM af crizotinib eller Vandetanib i forhold til dem, der dannes af DMSO-behandlede celler. EZ-ROS: EZR-ROS1, C6-RET: CCDC6-RET. * P 0,05. (F) Repræsentative billeder af mus subkutant transplanteret med NIH3T3-celler, der udtrykker vildtype, kinasedomænet-muteret eller amino-terminal-deleteret EZR-ROS1. En EML4-ALK-udtrykkende NIH3T3-klonen blev anvendt som en positiv kontrol. Antallet af tumorer per injektion i hvert transfektant vises under fotografierne.

For at undersøge onkogene aktivitet af

EZR-ROS1

fusion

in vitro

, vi etableret stabile NIH3T3 kloner, der udtrykker vildtype EZR-ROS1 og kinase-død mutant EZR-ROS1 (KD), hvor ATP-bindende lysinrest var muteret til methionin (K491M), samt mutanter med serielt slettet aminoterminale FERM domæner (DL1, DL2 og DL3, figur 2A). Autophosphorylering af specifikke tyrosinrester er en afgørende begivenhed i aktiveringen af ​​distinkte signaltransduktionsveje, og Tyr-2274 af ROS1 er en specifik autophosphorylering websted væsentligt at inducere kinaseaktivitet til transformation [19]. I transformation assays, phosphorylering af Tyr-2274 (svarende til Tyr-785 i vildtype EZR-ROS1 fusion) blev observeret i en vildtype EZR-ROS1-udtrykkende klon, men blev ikke påvist i kinase-døde (KD) og slettet (DL) mutanter; dette indebærer, at den aminoterminale del af FERM (1-88 aminosyrer) er nødvendig for ROS1 kinase aktivering (figur 2B). Wild-typen

EZR-ROS1

men ikke KD /DL mutanter specifikt induceret aktivering af STAT3 for downstream signalering, og produceret væsentligt forankringsuafhængig vækst (figur 2C, D). Den forankringsuafhængig vækst induceret af

EZR-ROS1

blev undertrykt ved behandling med crizotinib, en TKI mod ALK /MET /ROS1, mens væksten fremkaldt af en anden onkogen af ​​lunge,

CCDC6-RET

[11] blev ikke (Figur 2E). Tværtimod Vandetanib, en TKI mod RET /EGFR /VEGFR var effektiv til inhibering af kolonidannelse af CCDC6-RET udtrykkende celler, men ikke i de EZR-ROS1 udtrykkende celler. Som vist i figur 2C, crizotinib behandling undertrykt phosphorylering af EZR-ROS1 og inhiberer aktiveringen af ​​STAT3.

Dernæst NIH3T3-celler blev subkutant injiceret i immunsvækkede mus. Vildtype EZR-ROS1-udtrykkende kloner uvægerligt producerede tumorer (6/6), mens ingen af ​​KD og DL-mutanter-udtrykkende kloner producerede tumorer (figur 2F), bekræfter, at

in vivo

tumorigen aktivitet

EZR-ROS1

kræver ROS1 kinase aktivitet.

Udvikling af LADC i EZR-ROS1 transgene mus

for yderligere at evaluere betydningen af ​​

EZR-ROS1

i lunge carcinogenese, genereret vi transgene mus, der udtrykker fusionsgenet under kontrol af en type 2 alveolær epithelium-specifik overfladeaktivt C genpromotor [20] (figur 3A). Vi opnåede fire uafhængige rederier (TGA, B, C og D) med forskellige antal kopier af transgenet (figur S3) og påvist lungeadenokarcinom knuder i alle linjer undersøgte undtagen TGD. Analyse af fusionsproteinekspression niveau blandt dem viste ingen udtryk i TGD (figur S4). Fødselstallet af transgene-positive afkom var lav i TGC (Transgene-positive F1 afkom nummer: total F1 nummer, 01:03), og vi undlod at holde en TGC linje, så vi primært analyseret én linje (TGA), som rummer cirka fire kopier af transgen. RT-PCR og immunoblotanalyse verificeret lunge-specifik

EZR-ROS1

mRNA og proteinekspression, og indikeret phosphorylering af EZR-ROS1 fusionsprotein (figur 3B). Selvom endogene

Ezrin

ubikvitært blev udtrykt i mange væv, endogene

Ros1

-transcript blev opdaget kun i mave, nyre og lunge. Protein-ekspressionsniveauer af endogent ROS1 var meget svag i forhold til niveauerne af fusionsgenet i transgene mus (figur S4). Selv på de fire uger gamle, flere læsioner blev påvist over 1 mm i diameter i de transgene mus, og tumorer besat over 40% af sektioneret overflade af lunge (figur 3C og fig S5). Computertomografi undersøgelse registreres flere knuder i begge lunger, og de mus viste nedsat overlevelse (figur 3D, E). Histologisk undersøgelse af lungetumorer i de transgene muselinjer generelt demonstreret adenocarcinomer med papillære /lepidic vækstmønster (figur 3C). Disse læsioner blev vist at være invasive adenocarcinomer med moderat mitotisk aktivitet som afsløret ved positiv Ki-67-farvning (fig S6A). Men i nogle tilfælde af TGB linjer, observerede vi ophobning af cytoplasmatisk mucin i tumorceller (figur S6B).

(A) Skematisk præsentation af

SP-C /EZR-ROS1 /polyA

transgen. (B) Ekspression af det eksogene

EZR-ROS1

genet i transgene mus. RT-PCR (øverst) og immunoblotanalyse (nederst) af musevæv afslørede, at EZR-ROS1 specifikt blev udtrykt i lungerne hos to transgene mus (TgA21 og TgA25). HT: hjerte, LV: lever, ST: mave, SP: milt, KD: nyre, LG: lunge (C) Repræsentant histologisk analyse af lunge læsioner i transgene mus. Hematoxylin-eosin farvning viser udbredte læsioner i både 4 uger gamle og 15 uger gamle fusion-positive mus. Tg: fusion-positiv, CR: fusion-negativ. Scale bar, 100 pm. (D) computertomografi (venstre) af lungerne i TgA04 mus i uge 19. Forbedrede læsioner i begge lunger blev påvist. Multiple nodular læsioner (højre) blev observeret på pleural overflade af lungen i TgC01 mus ved obduktion. (E) Overlevelseskurver for transgene mus og kontrolmus dannet ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden.

Trods tilstedeværelsen af ​​multiple tumorer i lungerne af de transgene mus, vi ikke har kunnet påvise fjernmetastaser ved obduktion i TGA, B og C-mus. Det er således sandsynligt, at ekspressionen af ​​

EZR-ROS1

alene ikke er tilstrækkelig til at gøre kræftcellerne metastatisk.

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse identificeret

EZR- ROS1

som en central driver onkogen i lunge carcinogenese. Ezrin er ubikvitært udtrykt i mange væv. I

EZR-ROS1

fusion opdaget af RNA sekventering af LADC tilfælde, 5 ‘delen af ​​

EZR

forårsager afvigende overekspression af kinase domæne af

ROS1

. Ingen tydelige effekt til referatet niveauer af 3′-delen af ​​

EZR

blev observeret. Dette kan være tilskrives den overskydende udtryk vildtype

EZR

over fusionsgenet. Vi viste også, at ROS1 kinase aktivering i denne fusion forudsætter den N-terminale FERM domæne af EZR. FERM forbinder med mange forskellige proteiner, herunder phospholipider, stilladset proteiner EBP50 og E3KARP og andre membranassocierede proteiner, som kan regulere dimerisering eller oligomerisering af ezrin [21]. Mange fusion kinase proteiner, herunder ALK og RET, vise konstitutive tyrosinkinaseaktivitet tilskrives dimeriseringsdomæner i den aminoterminale fusionspartner [6], [22]. Men en anden ROS1 fusionsprotein, FIG-ROS1, som findes i humant glioblastom, cholangiocarcinom og lunge adenocarcinom, viste ingen dimerisering egenskaber, i stedet eksisterende som en monomer i fusionsproteinet trods fastholde de coiled-coil domæner og et leucin-zipper [19 ]. Derfor er de molekylære mekanismer bag ROS1 aktivering af FERM domænet fortsat uklart.

Den transgene mus viste en fremkomsten af ​​flere adenocarcinom knuder på et tidligt tidspunkt, og den hurtige progression af tumorer. Disse funktioner er stort set svarer til

EML4-ALK

musemodel [8]. Flere grupper rapporterede, at mucinøs cribriform mønster og signetring celle er karakteristiske histologiske træk af E

ML4-ALK

positiv menneskelig lungecancer [23] – [25]. For nylig undersøgte vi histopatologi af

ROS1

-fusion positive menneskelige lungekræft [16]. Selv om andre forskere rapporteret, at signetring celle funktion ikke var almindeligt i

ROS1

-rearranged lungekræft [10], fandt vi, at 53% af tilfældene husede mucinøs cribriform eller signetring celle funktioner svarer til

ALK

-rearranged lungekræft, men at resten viste papillære /lepidic vækstmønster.

EZR-ROS1

-positive tumorer syntes mindre godt differentieret, og viste oftere histologiske træk af mucinøs cribriform eller signetring celle. Vores musemodel for

EZR-ROS1

lungekræft generelt demonstreret papillær /lepidic vækstmønster, men i nogle tilfælde, observerede vi akkumulering af cytoplasmatisk mucin i tumorceller, og som helt ligner den karakteristiske histologi rapporteret i

ROS1

-rearranged lungekræft. I øjeblikket har vi ikke noget svar, hvorfor kun en del af mus nærede tumorer med mucin ophobning.

EZR-ROS1

fusion genet blev specifikt påvist i lungekræft eksemplarer af kvindelige aldrig-rygere uden

EGFR, KRAS,

ALKs

ændringer. Det blev anslået, at ca. 2% af patienterne i White og asiatiske lungekræft kohorter havde

ROS1

-rearrangements, der forekommer ved betydeligt højere i de yngre, ikke-ryger, kvindelige individer [10], [11], [16]. Selv om hver ændring er sjældne,

ROS1

fusioner med mange slags 5 ‘partner gener (

CCDC6, CD74, EZR, FIG, KDELR2, LRIG3, SDC4, SLC34A2 og TPM3

) er blevet rapporteret i lunge, hjerne, galdevejene, og ovariecancere [9] – [16], [26] – [28]. Disse

ROS1

-rearranged tumorer kunne målrettes terapeutisk med specifikke kinase hæmmere, herunder crizotinib [10], [14], [27], [29]. To LADC patienter havde en bemærkelsesværdig klinisk respons på crizotinib [10], [14]. Således er vores

EZR-ROS1

lungekræft dyremodel kunne være værdifulde for at vurdere det terapeutiske potentiale af disse forbindelser og nye lægemidler samt biologiske funktioner i

ROS1

-rearranged lungekræft

in vivo

.

Materialer og metoder

kliniske prøver

Vævsprøver fra patienter med lungecancer blev leveret af National Cancer center Biobank, Japan. Højmolekylært genomisk DNA og RNA blev ekstraheret fra frisk frossen tumorprøver og ikke-kræft lungevæv. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Etisk Komité National Cancer Center, Tokyo, Japan.

Analyse af Whole-transkriptom sekvensdata

Indsæt cDNA biblioteker (150-200 bp) blev fremstillet af 2 pg totalt RNA ved anvendelse af mRNAseq Sample Preparation Kit (Illumina). Bibliotekerne blev underkastet parret ende sekventering af 50 bp på HiSeq2000 (Illumina), ifølge producentens instruktioner. Parret ende læser blev kortlagt til kendte RNA-sekvenser i RefSeq, Ensembl, og LincRNA databaser ved hjælp af Bowtie programmet, som beskrevet tidligere [30].

RT-PCR, Genomisk PCR og sekventering

totalt RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af Superscript III (Life Technologies). cDNA eller genomisk DNA blev udsat for PCR-amplifikation ved hjælp Ex-Taq (Takara Bio) og primere EZR-e10-CF1 (GAAAAGGAGAGAAACCGTGGAG) og ROS1-E34-CR1 (TCAGTGGGATTGTAACAACCAG). PCR produkterne blev direkte sekventeret ved Sanger sekventering hjælp af BigDye terminator kit (Life Technologies).

SNP Array CGH Analyse

kromosomal kopi nummer for tumorerne blev bestemt ved hjælp af høj-opløsning SNP arrays ( GeneChip Mapping 250K-Nsp array, Affymetrix). Genomisk DNA blev mærket og hybridiseret til SNP arrays i henhold til producentens anvisninger, og kopi numre blev beregnet ud fra hybridiseringssignalerne vha CNAG programmet [31].

Vector Kloning, og Generation of sletning og punkt Mutants

Den kodende region af

EZR-ROS1

cDNA blev opnået ved PCR-amplifikation fra LCY66 tumor cDNA under anvendelse Phusion Taq polymerase (New England Biolabs) og primerne EZR-H1F1 (CACCATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTT) og ROS1-H1R1 ( ATCAGACCCATCTCCATATCCACTGTG).

EML4-ALK

cDNA og

CCDC6-RET

cDNA blev opformeret fra en

EML4-ALK

-positiv primær lungekræft prøve (E13, A20) og fra en

CCDC6-RET

-positiv primær lungekræft prøve (C1, R12), hhv. PCR-produkterne blev subklonet ind i en pcDNA3.1D-V5-His plasmid (Life Technologies). Udskiftning af lysin med methionin i codon 491 i

EZR-ROS1

genet blev udført under anvendelse af en primestar stedorienteret mutagenese kit (Takara Bio). N-terminale deletionsmutanter af FERM domæne

EZR-ROS1

cDNA blev konstrueret ved PCR under anvendelse af primerne EZR-FERM-AF (CACCATGGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATC) og ROS1-H1R1 for DL1, EZR-FERM-BF (CACCATGATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAG) og ROS1-H1R1 for DL2, og EZR-FERM-CF (CACCATGACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGC) og ROS1-H1R1 for DL3. Plasmiderne blev transficeret i NIH3T3-celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies), og stabile kloner blev isoleret ved G418-selektion (0,7 mg /ml). For kolonidannelse assayet blev cellerne indlejret og dyrket i 0,4% blød agar i tre eksemplarer, og antallet af kolonier blev talt efter 21 dage. Kvantificering af forankringsuafhængig vækst på betingelse med eller uden crizotinib (S1068, Selleck) og Vandetanib (S1046, Selleck) efter 9 dage blev udført med CytoSelect-96 kit (Cell Biolabs). Forbindelsen blev tilsat til det øverste lag af blød agar hver 3. dag.

immunoblotanalyse

Hele cellelysater blev ekstraheret med CelLytic M reagens (# C2978, Sigma), og underkastet SDS PAGE efterfulgt af blotting på en PVDF-membran. Påvisning af Western blots blev udført med WesternBreeze Chemiluminescent Immundetektion kit (Life Technologies) ved hjælp af primære antistoffer mod ROS1 (# 9202, Cell Signaling Technology), phosphoryleret-ROS1 (Tyr2274) (# 3078, Cell Signaling Technology), STAT3 (# 610.189, BD), phosphoryleret-STAT3 (Tyr705) (# 9138, Cell Signaling Technology), P44 /42 MAPK (# 4695, Cell Signaling Technology), phosphoryleret-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 9106, Cell Signaling Technology) , Ezrin (# 4135, Cell Signaling Technology), p53 (# 6243, Santa Cruz), og b-actin (# A5441, Sigma).

Undertrykkelse af ROS en kinase aktivitet af EZR-ROS1 af Crizotinib

transficerede NIH3T3-celler (tom vektor, vildtype EZR-ROS1, KD /DL-mutanter) blev serum sultet i 2 timer, derefter tilsat i 2 timer med 1% DMSO eller 1 uM crizotinib, så dyrkningsmediet var ændres med standard 10% FBS-medium i 10 min. Hele cellelysater blev udsat for immunoblotanalyse.

Subkutan Transplantation i immunsvækkede mus

I alt 1 × 10

6 celler blev injiceret subkutant i nøgne mus (BALB /c- nu /nu, CLEA Japan). Mus blev overvåget dagligt for tumordannelse. Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse af dyret komitésystem af National Cancer Center.

Generation og Undersøgelse af

EZR-ROS1

transgene mus

FLAG-mærket

EZR-ROS1

cDNA blev subklonet i en

SPC-iNOS

plasmid (leveret af Dr. Hagiwara), som omfattede en

SPC

promotor og et polyadenyleringssignal, ved at erstatte

iNOS

fragment med cDNA. Ekspressionskassetten med

SPC

promotoren blev udskåret fra konstruktionen og injiceret i pronukleær-embryoer af C57BL /6J-mus (Unitech Japan). Kopiantallet af transgenet blev bestemt ved Southern blot analyse af DNA fra dyrenes haler. Transgene linier blev opretholdt ved tilbagekrydsning til C57BL /6-mus. Total RNA blev isoleret fra organer fra transgene mus og udsat for RT-PCR-analyse til at opdage

EZR-ROS1

, endogene

Ros1

, endogene

Ezrin

GAPDH

mRNA’er. For at detektere EZR-ROS1 protein endogent ROS1 og Ezrin i væv, blev lyseret homogenater underkastet immunoblotanalyse under anvendelse af anti-ROS1, anti-Ezrin og anti-β-actin-antistoffer. Undersøgelse af lunge tumorer i levende dyr blev udført med en X-ray CT apparat (udforske mikro-CT, GE Healthcare). Lungevæv blev fikseret i 10% formalin og indstøbt i paraffin. Hematoxylin-eosin farvning og immunhistokemi for Ki67 blev udført som tidligere beskrevet [32].

Støtte Information

Figur S1.

Påvisning af

EZR-ROS1

genomisk breakpoint krydset. Elektroferogram for Sanger sekventering af genomiske fragmenter omfatter den

EZR-ROS1

breakpoint krydset af LCY66 tumor. Genomisk PCR-produkter forstærkes af EZR-e10-CF1 og ROS1-E34-CR1 primere blev direkte sekventeret ved hjælp af EZR-e10-CF1 primer. Tallene over elektroferogrammet indikerer genomiske position i kromosom 6 (human genom bygge 37.3). En genomisk fragment af 35 bp af

EZR

intron 10 blev vendt i intron før fusionen til

ROS1

intron 33.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s001

(PDF)

Figur S2.

Påvisning af fusionsgenet transkripter i kliniske prøver ved hjælp af RT-PCR. Repræsentative RT-PCR-resultater viser fusion-positive og fusion-negative sager under anvendelse af primere EZR-e10-CF1 og ROS1-E34-CR1. M: molekylær markør, NC: negativ kontrol. RT-PCR for vildtype

EZR

udskrift (primere EZR-e4-CF1 og EZR-e7-CR1) og for

GAPDH

(primere til GAPDH-F og GAPDH-R) er . også vist

doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s002

(PDF)

figur S3.

Kopier nummer analyse af transgenet i transgene mus. Genomisk DNA blev isoleret fra halerne af transgene mus genereret fra pronukleær-trins C57BL /6J embryoner. Dette gDNA blev derefter underkastet Southern blot-analyse med et PCR-amplificeret SPC promotorfragment af 464 bp, genereret under anvendelse af primere SPC-pro-F og SPC-pro-R, som en probe. Kontrolprøver til højre bestod af muse genomisk DNA med de angivne kopier af transgenet pr diploid genom. De ID-numre af mus positive for transgenet vises øverst

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056010.s003

(PDF)

Figur S4. Salg Gene udtryk i transgene mus. Ekspression af generne, der er angivet på venstre side blev undersøgt ved RT-PCR eller immunoblotanalyse. I RT-PCR, at amplificere PCR-cykler målgener blev angivet ved højre side. Ezrin viste allestedsnærværende endogen ekspression imidlertid endogen Ros1 ekspression var lav. Ingen ekspression af EZR-ROS1 fusionsproteinet blev påvist i TGD line mus (*). SW480 blev anvendt som en negativ kontrol for fusion ekspression. HT: hjerte, LV: lever, ST: mave, SP: milt, KD: nyre, LG:. Lunge

doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s004

(PDF)

Figur S5.

Lung tumor udvikling i transgene mus. Lungevæv af TGA mus tværsnit og histologisk karakteriseret. Antallet og størrelsen af ​​læsioner blev undersøgt i fusion-positive mus (Tg) og fusion-negative mus (CR) ved 4 uger og 15 uger efter fødslen. (A) tumorbyrde blev klassificeret langs sin størrelse i diameter (mm), og talt. (B) Tumor belægning blev beregnet ud fra den afledte tumor området

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056010.s005

(PDF)

Figur S6.

Histologisk karakterisering af lunge tumorer i transgene mus. (A) Hematoxylin-eosin-farvning af en mus lunge viser invasiv lunge adenocarcinom omgiver en pulmonal beholder (a1). Større forstørrelse af tumoren (a2). Positive Ki-67-farvning i tumoren (a3). Scale bar, 100 pm. (B) Hematoxylin-eosin-farvning af en mus lunge viser cytoplasmatisk mucin i lungen adenocarcinomceller (b1). Større forstørrelse af tumoren (b2). Scale bar, 200 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056010.s006

(PDF)

Tak

Vi takker Dr. K. Hagiwara (Saitama Medical University ) varetagelse af SPC-iNOS plasmid, Drs. Y. Nanya og S. Ogawa (University of Tokyo) varetagelse af CNAG programmet, og Ms. N. Okada, H. Shimizu, A. Kokubu, T. Urushidate, S. Ohashi og W. Mukai for deres fremragende teknisk bistand.