PLoS ONE: MicroRNA Expression Profilering at identificere og validere reference gener for den relative Kvantificering af microRNA i Rektal kræft

Abstrakt

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​biologiske processer på post-transkriptionel niveau. Deregulering af miRNA er blevet observeret i kræft, og miRNA bliver undersøgt som potentielle biomarkører om diagnose, prognose og forudsigelse i kræftbehandlingen. Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er almindeligt anvendt, når der måles miRNA ekspression. Passende normalisering af RT-qPCR data er vigtigt at sikre pålidelige resultater. Formålet med denne undersøgelse var at identificere stabilt udtrykte miRNA gældende som normaliser kandidater i fremtidige studier af miRNA udtryk i endetarmskræft.

Materialer og metoder

Vi udførte high-throughput miRNA profilering (OpenArray ®) på ti par laser mikro-dissekeret endetarmskræft væv og tilstødende stroma. En global gennemsnitlig udtryk normalisering strategi blev anvendt til at identificere de mest stabilt udtrykte miRNA til efterfølgende validering. I det første validering eksperiment blev et panel af miRNA analyseret på 25 par af meget små dissekerede rektal cancer væv og tilstødende stroma. Efterfølgende blev de samme miRNA analyseret i 28 par af endetarmskræft væv og normal rektal slimhinde.

Resultater

Fra miRNA profilering eksperiment, miR-645, miR-193a-5p, miR- 27a og lad-7g blev identificeret som udtrykt stabilt i både maligne og stromavæv. Desuden NormFinder bekræftede høj ekspression stabilitet for de fire miRNA. I RT-qPCR baseret Valideringsforsøg, ingen signifikant forskel mellem tumor og stroma /normal rektale slimhinde blev detekteret for middelværdien af ​​normaliser kandidater MIR-27a, MIR-193a-5p og lad-7g (første validering

P

= 0,801, anden validering

P

= 0,321). MIR-645 blev udelukket fra dataanalyse, fordi det blev opdaget i 35 af 50 prøver (første validering) og i 24 af 56 prøver (anden validering), hhv. Signifikant forskel i udtryk niveau af RNU6B blev observeret mellem tumor og tilstødende stromale (første validering), og mellem tumor og normal rektal slimhinde (anden validering).

Konklusion

Vi anbefaler betyde udtryk for miR-27a, miR-193a-5p og lad-7 g som normalisering faktor, når du udfører miRNA udtryk analyser ved RT-qPCR på endetarmskræft væv

Henvisning:. Eriksen AHM, Andersen RF, Pallisgaard N, Sørensen FB , Jakobsen A, Hansen TF (2016) microRNA Expression Profilering at identificere og validere reference Gener for den relative Kvantificering af microRNA i Rektal Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0150593. doi: 10,1371 /journal.pone.0150593

Redaktør: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, UNITED STATES

Modtaget: September 8, 2015; Accepteret: 17 februar 2016; Udgivet: 3 mar 2016

Copyright: © 2016 Eriksen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke-kodende RNA-molekyler, der virker som negative gen lovgivere på post-transkriptionel niveau. Disse små RNA består af 18-25 nukleotider og spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​biologiske processer såsom celledifferentiering, proliferation og apoptose. Ændringer i miRNA udtryk profiler er forbundet med unormale cellulære funktioner og er blevet observeret i en lang række sygdomme, herunder cancer [1, 2]. Mange miRNA målrette onkogener og tumorsuppressorgener med direkte involvering i carcinogenese [3]. På grund af sammenhængen mellem mange miRNA og kræft, er miRNA undersøges som potentielle biomarkører om diagnose, prognose og forudsigelse i kræft forvaltning [2, 4].

Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er bredt accepteret som den foretrukne metode til relativ genekspression kvantificering, da det er den mest følsomme og reproducerbar metode. Men den nøjagtighed og præcision af resultaterne er afhængige af korrekt data normalisering. Reference gener er nødvendige for at korrigere for ikke-biologiske prøve-til-prøve variationer, som kunne indføres i alle trin fra prøveforberedelse til forstærkning. Anvendelsen af ​​ikke-stabilt udtrykt reference- gener for normalisering kan føre til ukorrekte konklusioner. Det er almindeligt accepteret, at der ikke findes et universelt henvisning gen egnet til alle typer væv [5-8]. Den mest nøjagtige metode er at vælge stabilt udtrykte reference- gener for hver specifik eksperiment ifølge vævet af interesse [9].

På trods af et stigende antal miRNA udtryk undersøgelser, litteraturen er ekstremt sparsomme, når det kommer til rektal cancer og pålidelige normaliser kandidater.

Formålet med denne undersøgelse var at identificere stabilt udtrykte miRNA i endetarmskræft væv, der skal bruges som normalisers i fremtidige miRNA udtryk studier. I denne sammenhæng miRNA-normalisers vil blive henvist til som referencepunkter gener. Vi studerede ekspressionen profilen af ​​miRNA i laser mikro-dissekeret tumorvæv og tilstødende stromale væv fra enheder af patienter med rektal cancer. Først valgte vi de mest stabilt udtrykte miRNA fra vores high-throughput teknologi baseret miRNA udtryk profilering undersøgelse af 10 patienter (OpenArray®, Life Technologies). For det andet blev stabiliteten af ​​disse miRNA yderligere vurderet ved RT-qPCR i endetarmskræft væv fra 25 andre patienter. Endelig har vi analyseret stabiliteten af ​​de samme miRNA i endetarmskræft væv og normal rektal slimhinde fra 28 sammenlignelige patienter. Vi inkluderede den almindeligt anvendte små nukleare RNA RNU6B i alle vores analyser.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Patienterne blev tilfældigt udvalgt fra en kohorte af 239 patienter, der gennemgår resektion af endetarmskræft på Vejle Sygehus, Danmark fra 1999 til 2008. Inklusion blev kun gennemført, hvis deres histopatologisk diagnose var rektal adenocarcinom, hvis de havde nogen præoperativ kemo-strålebehandling, og hvis formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) endetarmskræft væv var tilgængelig

for miRNA udtryk profilering analyse, tumorvæv fra i alt 10 patienter (5 mænd, 5 kvinde; median alder 74, rækkevidde 59-86 år). blev valgt repræsenterer forskellige patologiske tumor stadier (pT1- pT4) og forskellige mængder af lymfocytter i tumor mikromiljø (tabel 1). For første valideringsundersøgelse væv fra en anden 25 patienter rektal cancer (13 mænd, 12 kvinder, median alder 68, rækkevidde 49-87 år) blev udvalgt efter tumor stadie, men uanset antallet af stromale lymfocytter; femten tumorer blev klassificeret pT3 blev ti tumorer klassificeret pT4. For det andet valideringsundersøgelse endetarmskræft væv og normal rektal slimhinde fra 28 andre patienter (13 mænd, 15 kvinder, median alder 70, rækkevidde 45-89 år) blev inkluderet; alle tumorer blev klassificeret pT3.

Ifølge Den Danske Komité for Health Research Etik, etisk godkendelse og skriftligt informeret samtykke ikke var påkrævet, fordi formålet med undersøgelsen var kvalitetsudvikling og ingen kliniske data var yderligere analyseret (lov om Forskning Etik anmeldelse Sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter, jf § 14, § 1). Ingen prøver blev indsamlet specielt til formålet med denne undersøgelse. Prøverne blev opsamlet under standard behandling. Projektet blev udført anonymt. Vævet anvendt i denne undersøgelse blev bekræftet ikke at indgå i dansk Registry of Human Tissue Udnyttelse. Undersøgelsen er blevet rapporteret til Dansk Datatilsynet.

Laser mikro-dissektion

For at specifikt evaluere miRNA udtryk i rektal adenocarcinomceller og i det omkringliggende stroma, laser mikro-dissektion (LMD) blev udført (figur 1). Tilgængelige histologiske snit farvet med hematoxylin og eosin blev undersøgt af en patolog, for at vælge den dybeste invasive FFPE sektion fra tumoren. På miRNA ekspression profilering, blev et lige antal tilfælde med en høj versus en lav mængde lymfocytter i den tilstødende stromavæv valgt (tabel 1). Ifølge ovenstående udvælgelse, blev sektioner (8-10 um) skæres fra FFPE væv og fastgjort til indramme slides til membran-baserede LMD, hjælp Leica LMD6500 Microsystems (Leica). Objektglas blev tørret i 45 minutter ved 60 ° C, vasket to gange i 5 minutter i xylen til fjernelse paraffin, rehydreret ved en gradueret ethanolserie (99%, 99%, 96%, 70%), skyllet i demineraliseret vand, farvet for 3 min med hematoxylin, skyllet i 5 minutter i demineraliseret vand, og fik lov at lufttørre. Tumorceller (a) og tumor mikro-miljø stroma (b) blev isoleret ved LMD og særskilt indsamlet i hætterne på 0,5 ml RNase-fri PCR-rør, hvor en dråbe ethanol blev tilsat. For den anden validering eksperiment blev tumorcellerne isoleret ved LMD, mens den normale rektale slimhinde blev fjernet fra objektglassene med en skalpel. Salg

Områder i tumorceller er blevet fjernet (pile). Områder, der skal fjernes fra det stromale væv er blevet markeret (røde linjer).

RNA-ekstraktion

RNA blev isoleret ved hjælp af miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til producentens anvisninger. Da paraffin blev fjernet før LMD blev første trin tilsætning af en lyseringsbuffer indeholdende proteinase K, efterfulgt af en kort inkubation ved en højere temperatur. Dette blev efterfulgt af DNase-behandling og RBC buffer behandling. Ethanol blev tilsat, og prøven blev påført en RNeasy MinElute spinkolonne hvor det totale RNA, herunder miRNA, bundet til membranen blev vasket væk. Endelig blev total RNA, herunder miRNA, elueres i 14 pi RNase-frit vand.

OpenArray® Paneler

OpenArray® Menneskelig MicroRNA Panel (Life Technologies, Foster City, CA, USA) er en high-throughput PCR-baseret miRNA array, der muliggør analyse af mere end 750 foruddefinerede miRNA på en mikrofluid platform. Enkeltstrenget cDNA blev revers transkriberet fra totalt RNA under anvendelse Megaplex ™ RT-primere, Human Pulje A eller B. Hver RT-reaktionen havde et slutvolumen på 7,5 pi og indeholdt totalt RNA (3 pi) og reagenser fra TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit ( 4,5 pi) (Life Technologies).

Preamplification (16 cykler) blev udført med Megaplex ™ preamp Primere, Menneskelig Pool A eller B (Life Technologies) og TaqMan preamp MasterMix (Life Technologies) i overensstemmelse med producentens standardvejledning for lav prøve indgang (LSI). Forforstærker Produkt blev fortyndet 1:40 i TE-buffer. For at teste resultatet af revers transkription og forforstærkning før vi fortsatte med at OpenArray® blev produkterne testet med enkelt assay qPCR til enten miR-16 (Pool A) eller miR-151-3p (Pool B). Analyser blev udført i 20 pi reaktioner i to eksemplarer hjælp 1,3 ul prøve. blev opdaget Begge miRNA.

For qPCR trin TaqMan® OpenArray® Menneskelig miRNA Paneler (Life Technologies) blev anvendt i overensstemmelse med producentens anvisninger. qPCR blev udført under anvendelse QuantStudio 12K Flex System (Life Technologies). Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer, hvor hver prøve blev analyseret på tre forskellige OpenArray® paneler.

Validering RT-qPCR

Brugerdefineret TaqMan® Array MicroRNA Cards (Life Technologies) blev anvendt i overensstemmelse med producentens standardvejledning i LSI. RNA blev omvendt transskriberet hjælp Brugerdefineret miRNA RT Primer Pools leveres sammen med Array Cards. Hver RT-reaktionen indeholdt 3 pi total RNA og 4,5 pi RT reaktion mix fra TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit.

5 pi RT produkt blev forforstærket (14 cykler) med brugerdefinerede Preamp Primer Pools (følger med Array Cards) og TaqMan preamp Mastermix i 25 pi reaktioner. Forforstærker Produkt blev fortyndet 1: 4 i TE-buffer. qPCR analyser blev udført ved hjælp af TaqMan® Universal Master Mix II NoAmpErase® UNG og Applied Biosystems 7900 HT Real-Time PCR System. Alle reaktioner blev udført tre gange.

Begge validering eksperimenter fulgte de samme trin som beskrevet ovenfor.

Dataanalyse

High throughput data genereret fra TaqMan® OpenArray® RT-qPCR blev analyseret ved hjælp af Expression Suite Software Version 1.0.3 (Life Technologies), en data-analyse værktøj, der udnytter den sammenlignende Cq (ΔΔCq) metode til at kvantificere relative genekspression på tværs af en lang række gener og prøver. Relativ kvantificering (RQ)-også kaldet Fold Change (FC) -blev beregnet ud fra CQ værdier i overensstemmelse med ligningerne: (a) ΔCq = Cq (miRNA) -Cq (globale gennemsnitlige); (B) ΔΔCq = ΔCq (tumor) -ΔCq (stroma); og (c) RQ = 2

-ΔΔ

Cq

, hvor Cq er defineret som PCR cyklus nummer, hvor fluorescens opfylder tærsklen i forstærkning plot.

Expression Suite udfører en uparret t-test for biologiske gruppe sammenligninger, under forudsætning af, at CQ-værdier for begge grupper følger en normalfordeling.

for at analysere udtrykket stabilitet henvisning gen kandidater, softwareprogrammet NormFinder [10] blev anvendt i overensstemmelse med bygherrens anbefalinger. NormFinder beregner en stabilitet værdi for et panel af henvisning gen kandidater kombinerer inter- og intra-gruppe udtryk variation. De laveste værdier angiver de mest stabilt udtrykte reference- gener. Gennemsnitlige værdier af tredobbelte CQ værdier blev konverteret til lineære værdier for Norm Finder og statistiske analyser, ved ligningen lineær værdi (Cq) = 2

–

Cq

, under forudsætning af, at forstærkningen effektiviteten for henvisningen gen assays er tæt på 100%. Statistiske analyser blev udført ved anvendelse NCSS 2007 (NSCC LLC, Kaysville, UT, USA). I validering eksperimenter blev Wilcoxon Rank-Sum Test anvendes til at teste for forskelle i medianerne, når man sammenligner tumor og stroma (første validering) og tumor og normal slimhinde (anden validering). P-værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant for alle tests.

Resultater

Identifikation af kandidat reference- gener ved hjælp af Expression Suite Software

Vi profilerede et panel af mere end 750 miRNA og kontrol med 10 par endetarmskræft væv og tilstødende stromale væv. I første omgang blev en global gennemsnitlig udtryk normalisering strategi anvendes til at identificere de mest stabilt udtrykte miRNA [2]. Data blev udelukket fra yderligere analyser, hvis CQ-værdier oversteg 35 og /eller forstærkning score var under 1,24.

Fra Expression Suite data analyse, de fire henvisning gen kandidater Lad-7g, miR-193- 5p, miR-27a, og miR-645 (tabel 2) blev udvalgt fra følgende kriterier: (a) Relativ kvantificering (RQ) tæt på 1: 1 (hvor det biologiske referenceprodukt gruppe er stromale væv); (B) miRNA detekteret i mere end 70% af alle replikater af alle prøver; (C) Cq værdier mellem 18 og 28; (D) Ingen intentioner herunder miRNA som et mål i vores fremtidige projekter. Derudover vi kiggede på p-værdi, overvejer en høj p-værdi blev antyder ingen større forskel mellem de væv grupper og ingen større spredning af CQ værdier inden grupperne.

For at tilføje en anden generelt accepteret tilgang, et panel af 10 miRNA, alle opfylder ovennævnte kriterier ((a) – (d)), blev analyseret ved hjælp af Norm Finder (tabel 3). RQ varierede fra 1: 0.8 til 1: 1,2 (hvor referencen biologiske gruppe var stroma). Den p-værdi blev ikke anset for ved udvælgelsen af ​​miRNA til denne analyse. RNU6B blev inkluderet i denne analyse. Undersøgelsen identificerede Lad-7g, miR-193a-5p, miR-27a, og miR-645 blandt en gruppe af miRNA med en lav og næsten lige stabilitet værdi, hvilket indikerer høj ekspression stabilitet. RNU6B viste en 10-gange højere stabilitet værdi, hvilket indikerer lavere udtryk stabilitet end de andre henvisning gen kandidater. Skift fra to biologiske grupper (tumor og stroma) til tre grupper (tumor, stroma med lav mængde lymfocytter, og stroma med høj mængde lymfocytter) kun havde mindre virkning på stabiliteten værdier (data ikke vist).

RT-qPCR-baserede validering af henvisning gen kandidater i tumor og tilstødende stroma

udtrykket mønstre af lad-7g, miR-193a-5p, miR-27a, miR-645 og RNU6B blev yderligere analyseret på 25 par af rektal cancer og tilstødende stromavæv. Fordi MIR-645 kun blev detekteret i 15 af 50 prøver, var dette miRNA fjernet fra yderligere dataanalyser. Lad-7g, miR-193a-5p og miR-27a viste forskellige, men målbare ekspressionsniveauer og alle af dem blev udtrykt i alle 50 prøver. Rå CQ-niveauer varierede fra 20,1 til 28,9 for lade-7g, 23,2-31,1 for miR-193a-5 p, og 19,7-26,4 for miR-27a. For RNU6B den rå Cq niveau varierede fra 12,0 til 23.6. Kassegrafer vist for det aritmetiske gennemsnit af lade-7g, miR-193a-5p og miR-27a, og for RNU6B i figur 2. Det aritmetiske gennemsnit af CQ værdier for lad-7g, miR-193a-5p og miR- 27a, og CQ-værdier for RNU6B blev konverteret til lineære værdier, og Wilcoxon Rank-Sum Test for forskel i medianer blev udført. Vi observerede en signifikant forskel for RNU6B (

P

= 0,004) mellem tumorvæv og det tilstødende stromale væv, hvorimod blev opdaget nogen signifikant forskel for gennemsnittet af de øvrige tre reference- gen kandidater: Lad-7g, miR -193a-5p og miR-27a (

P

= 0,801).

Angivelse af henvisning gen kandidater i endetarmskræft væv (n = 25) og tilstødende stromale væv (n = 25) ( A), og i rektal cancer væv (n = 28) og normale rektale slimhinde (n = 28) (B). Værdier er angivet som kvantificering cykler (CQ). Boxes (grøn, kræft væv, blå, stromale væv, grå, normal slimhinde) repræsenterer øvre og nedre kvartiler med medianer som vandrette linjer. Whiskers skildrer 1,5 x den interkvartile område. Outliers vises ikke. P-værdier er ifølge Wilcoxon Rank Sum Test for forskellen i medianer. RNU6B viste en signifikant forskel mellem tumor og stroma (A), og mellem tumor og normal mucosa (B). Der er ingen signifikant forskel i den gennemsnitlige ekspressionsniveauet af lad-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a mellem tumor og stroma (A), og mellem tumor og normal mucosa (B).

RT-qPCR-baserede validering af henvisning gen kandidater i tumor og normal slimhinde

Som en anden validering, udtrykket mønstre af lad-7g, miR-193a-5p, miR-27a, miR-645 og RNU6B blev analyseret i 28 par af rektal cancer væv og normal rektale slimhinde. MIR-193a-5p, miR-27a og RNU6B blev påvist i alle 56 prøver. Lad-7 g blev påvist i 55 prøver og uopdaget i én prøve med normal rektal slimhinde. Fordi miR-645 kun blev påvist i 32 af 56 prøver blev denne miRNA ikke medtaget i den videre analyse af data. Raw CQ-niveauer varierede fra 18,2 til 29,5 for lade-7g, 20,9-34,7 for miR-193a-5p, 18,7-29,5 for mi-27a, og 14,3-29,7 for RNU6B. Kassegrafer vist i fig 2. Ingen signifikant forskel blev påvist for det aritmetiske gennemsnit af lade-7g, MIR-193a-5p og MIR-27a (

P

= 0,321) mellem tumorvævet og det normale slimhinde , mens der for RNU6B, observerede vi en signifikant forskel (

P

= 0,031).

diskussion

brugen af ​​pålidelige reference- gener for normalisering er af stor betydning, når du udfører RT-qPCR baseret forskning. Proceduren normaliseringen kompenserer for variationer i RNA-ekstraktion udbytte, revers-transkription udbytte, og effektiviteten af ​​amplifikation, hvorved sammenligning af miRNA ekspressionsniveauer på tværs af forskellige prøver [11].

Det er almindeligt accepteret, at en enkelt , er universel henvisning gen ikke eksisterer, og det er blevet fremført, at den mest præcise normalisering opnås ved at vælge reference- gener, der tilhører samme klasse af RNA som de undersøgte gener. Desuden anbefales det at søge efter stabilt udtrykte gener i hvert eksperimentelt system [12, 13].

Davoren

et al

. rapporterede den første systematiske identifikation af henvisning gen kandidater til miRNA RT-qPCR forsøg i brystkræft i 2008 [5]. I 2010, Chang

et al

. rapporterede deres identifikation reference gen kandidater til miRNA RT-qPCR i kolorektal cancer [6], hvor de identificerede de øverste seks mest stabilt udtrykte miRNA som lad-7a, miR-16, miR-26a, miR-345, miR-425 og miR-454.

for at finde navnlig oplysninger om reference- gener for miRNA udtryk studier i endetarmskræft, vi udført en PubMed søgning. Brug af MeSH termerne “microRNA” og “endetarmskræft”, fandt vi 9 artikler om endetarmskræft udtryk undersøgelser, der er offentliggjort indtil februar 2015 om, at omfattede oplysninger om anvendelsen af ​​reference- gener. (Tabel 4 [3, 14-21])

Denne søgning afslørede, at små nukleare RNA var sædvanlige referencepunkter gener i rektal cancer eksperimenter, hvor RNU6B blev foretrukket. Men ved hjælp af disse små RNA’er som referencepunkter gener kan være problematisk, trods de viser stabile ekspressionsniveauer i normale væv, har de vist forskellige ekspressionsniveauer i cancervæv sammenlignet med normalt væv [4]. Desuden oplysninger om udvælgelse og validering af de anvendte referencepunkter gener og uanset om de er blevet stabilt udtrykt over undersøgte væv er ofte ikke givet. Ingen af ​​undersøgelserne anvendte en miRNA som reference gen.

Ifølge Peltier

et al

., Den mest anvendte henvisning gen i rektal kræft eksperimenter, RNU6B, viste sig at være en af de mindste stabilt udtrykte RNA-arter [8].

Så vidt vi ved, er dette den første OpenArray® baseret og efterfølgende RT-qPCR-valideret identifikation af egnede reference- gener i rektal cancer prøver alene. Fordi hidtil RNU6B har været den mest anvendte endogene kontrol i endetarmen undersøgelser kræft, besluttede vi at medtage det i vores forsøg til sammenligning. Vi profileret ekspressionen af ​​humane miRNA (herunder RNU6B) på 10 par endetarmskræft væv og tilstødende stromale væv. Da reference- gener skal bruges til normalisering i fremtiden RT-qPCR analyser på rektal kræft biopsier, der kun indeholder tumorceller og tilstødende stromale væv, vi ikke omfatter normal rektal slimhinde i de indledende analyser. Ved at anvende den globale gennemsnitstemperatur udtryk værdi for normalisering, vi identificeret de mest stabilt udtrykte miRNA: Lad-7g, miR-193a-5p, miR-27a og miR-645. Global betyde normalisering er tidligere vist sig at være overlegen i forhold til andre tilgange til normalisering reducere tekniske variationer og vise biologiske ændringer [2].

Efterfølgende brug af NormFinder bekræftede høj ekspression stabilitet for de fire miRNA, som var alt om ti gange mere stabil end den ofte anvendte henvisning gen RNU6B. Da mængden af ​​stromale lymfocytter gjorde ingen væsentlige ændringer i stabilitets- værdier, konkluderede vi, at mængden af ​​lymfocytter ikke påvirker ekspressionsniveauerne af disse miRNA, og antallet af lymfocytter i det stromale rum ikke blev taget i betragtning i de Valideringsforsøg .

Vores første validering forsøg blev udført i en større gruppe på 25 par af væv og bekræftet ingen signifikant forskel (

P

= 0,801) i den gennemsnitlige ekspression værdi for lad-7g, miR- 193a-5p og mIR-27a mellem rektal cancer væv og tilstødende stromavæv. Fraværet af en signifikant forskel beviser ikke lige ekspressionsniveau mellem tumorvæv og tilstødende stromavæv; Men på den anden side en høj p-værdi taler for lighed eller mindre forskelle. Den betydelige forskel i ekspression af RNU6B mellem tumorvæv og tilstødende stroma (

P

= 0,004) er i konkordans med tidligere resultater [8]. MIR-645 blev udelukket, fordi det ikke var repræsenteret i alle prøver.

For yderligere at validere resultaterne, vi gjorde en anden validering i en kohorte af 28 par af endetarmskræft væv og normal rektal slimhinde. Som i de to indledende forsøg, fandt vi ikke en signifikant forskel (

P

= 0,321) mellem det aritmetiske gennemsnit af ekspressionsniveauerne af Lad-7g, miR-193a-5p og miR-27a i endetarmen cancervæv og sammenlignet rum (i dette tilfælde den normale rektale slimhinde), hvorimod en signifikant forskel blev påvist for ekspressionsniveauet af RNU6B (

P

= 0,031). Som i den første validering undersøgelse blev miR-645 påvises i en betydelig del af prøverne (24 af 56), og derfor stadig ikke egnet som reference gen i denne indstilling.

MIR-645 var bredt opdaget i OpenArray®, men ikke i de to Valideringsforsøg. Fordi der ikke var nogen forskelle i de grundlæggende egenskaber mellem prøverne, der anvendes i identifikationen eksperimentet og de efterfølgende valideringer, forskellene i opdagelse sats er sandsynligt at være forårsaget af platformen. De store variationer i detektion af miR-645 i de forskellige platforme understreger vigtigheden af ​​at validere resultater fra en high-throughput metode.

Ifølge www.miRBase.org, lad-7g, miR-193a-5p og miR-27a ikke hører til de samme miRNA-familier, som reducerer chancen for, at de kunne være co-reguleret. Udvælgelsen af ​​tre referenceår gener mødes Vandesompele

et al

. Anbefaling om at bruge mindst tre ordentlige reference- gener for beregning af en normalisering faktor [12].

Som konklusion, baseret på en høj -throughput RT-qPCR miRNA profilering studie og to efterfølgende RT-qPCR baseret validering eksperimenter, anbefaler vi middelværdien af ​​lad-7g, miR-193a-5p og miR-27a som normalisering faktor, når du udfører miRNA udtryk analyser ved RT-qPCR på endetarmskræft væv.

Støtte Information

S1 Table. Data fra den indledende profilering eksperiment (OpenArray®)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150593.s001

(XLSX)

S2 Table. Data fra den første validering eksperimentet (tumor og stroma)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150593.s002

(XLSX)

S3 Table. Data fra den anden validering eksperimentet (tumor og normal rektal slimhinde)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150593.s003

(XLSX)

Tak

Vi er meget taknemmelige for den tekniske bistand fra Birgit Roed Sørensen, Pia Nielsen, Tina Brandt Christensen og Lone Hartmann Hansen.