PLoS ONE: Overekspression af N-myc Downstream-Reguleret Gene 2 (NDRG2) Regulerer spredning og invasion for blærekræft celler in vitro og in vivo

Abstrakt

N-myc nedstrøms-reguleret gen 2 (

NDRG2

) er en kandidat tumorsuppressorgen, som spiller en vigtig rolle i at kontrollere tumorvækst. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge ekspressionen af ​​

NDRG2

gen i blærekræft (BC) væv og flere blære cancer cellelinjer, og til at søge sin klinisk og patologisk betydning. Syvoghalvfems blærecarcinom og 15 normale blære vævssnit blev analyseret retrospektivt med immunhistokemi. Den menneskelige blærekræft cellelinje T24 blev inficeret med udlåns-

NDRG2

eller LEN-LacZ. Virkningerne af

NDRG2

overekspression på T24 celler og T24 nøgen mus xenografter blev målt via celle vækstkurver, tumor vækstkurver, flowcytometrianalyse, western blot og Transwell assay.

NDRG2

var stærkt udtrykt i normal blære væv, men fraværende eller sjældent udtrykt i cacinomatous væv (χ

2 = 8,761, p 0,01).

NDRG2

niveau var negativt korreleret med tumor kvalitet og patologisk stadie (r = -0,248, p 0,05), samt øget c-myc niveau (r = -0,454, p 0,001). Udtrykket af

NDRG2

var lav i de tre BC cellelinjer. T24 celler inficeret med udlåns-

NDRG2

viste hæmning af spredning både

in vitro

in vivo

, og

NDRG2

overekspression kan hæmme tumorvækst og invasion

in vitro

Henvisning:. Li R, Yu C, Jiang F, Gao L, Li J, Wang Y, et al. (2013) Overekspression af N-myc Downstream-Reguleret Gene 2 (NDRG2) Regulerer spredning og invasion for blærekræft Cells

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 8 (10): e76689. doi: 10,1371 /journal.pone.0076689

Redaktør: Raffaele A Calogero, University of Torino, Italien

Modtaget: Maj 27, 2013; Accepteret: August 26, 2013; Udgivet: 16 oktober 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31.070.681). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forekomsten af ​​blærekræft er stigende. Det anslås 386,300 nye tilfælde og 150,200 dødsfald som følge blærekræft fandt sted i 2008 på verdensplan [1]. Hos mænd blærekræft er den fjerde mest almindelige kræftform efter prostata, lunge og kolorektal kræft, der tegner sig for 7% af alle kræfttilfælde i USA [2]. I mere end 75% af tilfældene, stilles diagnosen på et tidligt stadium af sygdommen (trin Ta og T1). Trods have fået tilstrækkelig behandling, den femårige samlede overlevelsesrate for patologisk T2 sygdom er 52-77%, T3 sygdom 40-64%, og T4 eller lymfeknude-positiv sygdom 26-44% [3]. Der er talord terapeutiske indgreb til at behandle denne sygdom; dog har den samlede overlevelse ikke er blevet forbedret i de sidste tyve år. Derfor, for at etablere en ny form for behandling med antioncogene agent for at forbedre overlevelsesraten for patienter er meget ønskeligt.

N-myc nedstrøms regulere gen 2 (

NDRG2

) tilhører NDRG familie, som omfatter fire medlemmer:

NDRG1, NDRG2, NDRG3

NDRG4

. Sekvensen homologi i det menneskelige

NDRG

familie er 57-65% og

NDRG

familie er blevet undersøgt i nogle af human cancer og sygdomme i nervesystemet [4]. Som et gen for at regulere nedstrøms for Myc,

NDRG2

ekspression er blevet bekræftet at blive reduceret i mange typer af carcinomer, herunder thyroidcancer, levercancer, meningeom, pancreascancer og prostatacancer [5-11]. Disse undersøgelser tyder på, at

NDRG2

kunne spille en vigtig rolle i at kontrollere sygelighed af karcinomer.

NDRG2

er blevet bekræftet at være involveret i cellevækst og differentiering, i mellemtiden,

NDRG2

udtryk i high-grade gliomer er blevet vist at associere med overlevelse [12,13].

(A) ekspressionsniveauerne for

NDRG2

protein fald mens graden af ​​malignitet af blære karcinom øges (x400) (1). Normal blære væv; (2) Blære papilloma (T0-Ta); (3) Høj-niveau blærekræft (T2-T4). (B) Ekspressionsniveauerne af c-myc protein forøger mens graden af ​​malignitet af blærecarcinom øges (x400) (4). Normal blære væv; (5) Blære papilloma (T0-Ta); (6) Høj-niveau blærekræft (T2-T4). De dele af (B) (4-6) stammer fra de samme paraffinblokke som (A) (1-3) henholdsvis.

Selvom flere undersøgelser har undersøgt funktionen af ​​

NDRG2

i almindelige tumorer, der ikke har været funktionel karakterisering af den potentielle rolle for

NDRG2

gen i blærekræft. Derfor er formålet med den aktuelle undersøgelse var at undersøge den rolle,

NDRG2

i human blærecancer. Først undersøgte vi ekspressionen af ​​

NDRG2

i humane blære karcinom væv og sammenlignet med normale blære væv ved immunkemi. Vi fandt, at ekspressionsniveauet af

NDRG2

i BC væv var lavere end i normalt væv. Dernæst brugte vi blærekræft cellelinjer som modeller til at vurdere effekten af ​​

NDRG2

på tumorvækst, differentiering og invasion

in vitro

in vivo

. Vores resultater tyder på, at

NDRG2

har et potentiale antioncogenic rolle i blærekræft.

Materialer og metoder

kliniske prøver

formalin-fikseret og paraffin-embedded blokke af blære karcinom væv blev tilfældigt indsamlet fra 112 patienter og kontroller (gennemsnitsalder 63,4 år, spænder fra 21 til 81 år) fra Institut for Urologic Surgery, Xijing Hospital, FMMU (Xi’an, Kina) mellem 2008 og 2011.These prøver omfattede 15 normale blære væv, 20 blærepapillom (T0-Ta), 38 lavt niveau blærekræft (Tis-T1) og 39 højt niveau blærekræft prøver (T2-T4). Skriftligt samtykke blev opnået fra hver emne. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Xijing Hospital, Xi’an, Kina.

(A) Real-time PCR-analyse af

NDRG2

mRNA-ekspression. (B) Ekspression niveau af

NDRG2

protein som analyseret ved western blot. Alle assays blev gentaget uafhængigt for mindst tre gange. Resultaterne er vist som gennemsnit ± SD (** p 0,001) ..

Immunhistokemi (SP: streptavidin-perosidase)

Mouse anti-human

NDRG2

monoklonalt antistof og c-myc-monoklonalt antistof blev købt hos Santa Cruz Biotechnology Company (Santa Cruz, USA.). Den immunhistokemi kit blev købt fra Boster Company (Wuhan, Kina). Den immunhistokemi-farvning blev udført ifølge producentens anvisninger. Følgende præparater blev fremstillet fra hver vævsblokken:. Et dias farves med HE (den patologiske stadium blev kontrolleret af patologer), et dias inkuberes med anti-

NDRG2

antistof, et dias inkuberes med c-myc antistof

for at nøjagtigt at bestemme den positive udtryk og for at minimere falsk positiv rate, vi brugte to arbitory semikvantitativ pointsystem til at vurdere omfanget og intensiteten af ​​farvningen af ​​tre patologer selvstændigt. Pointene blev defineret som følger: (1) omfanget af farvning scoring: 0 point for farvning 5%, 1 point for farvning 6% til 25%, 2 point for farvning 26% til 50%, 3 point for farvning 51 % til 75%, og 4 point for farvning 75% (2). Intensiteten af ​​farvning scoring: 0 point for negativ farvning, 1 point for svagt positiv farvning, 2 point for moderat farvning og 3 point for en stærk farvning (tan). For hver prøve, scoringer stammer fra de to pointsystemer var mangedoblet. Resultaterne af bestemmelsen var inddelt i fire niveauer: negativ (0 til 1, -), svagt positiv (2 til 4, +), positive (5 til 8, + +), stærk positiv (9 til 12, + + +) . Billeddannelse blev udført ved lysmikroskopi (Olympus, Nagano, Japan) og beregnet med statistisk analyse.

Cell Culture

Vi selekterede humane T24, 5637 og BIU-87 cellelinjer, der skal anvendes i den aktuelle undersøgelse. Disse cellelinier er tidligere blevet bekræftet som passende cellelinier til forskning af blærecancer. Som normal kontrol, valgte vi human blære celle (SV-HUC-1). Alle cellelinjer blev købt fra Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina. Cellerne blev dyrket i RPMI1640 (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Holly blade Hangzhou, Kina). Alle cellelinier blev dyrket i sterile betingelser ved 37 ° C og 5% CO

2.

(A) Detektion af lentiviral infektionseffektivitet, og fasekontrast (venstre) eller GFP (højre) billederne var opnået fire dage efter infektion. (B) Real-time PCR-analyse af

NDRG2

mRNA-ekspression i T24 celler. (C) Western blot-analyse af

NDRG2

proteinekspression. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD (** p 0,01) ..

Real-time kvantitativ PCR

Det totale RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Takara Bio, Japan) og revers transkriberet under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Fermentas) ifølge producentens anvisninger. De anvendte primere var som følger: GAPDH, 5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3 ‘og 5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3’;

NDRG2

, 5′-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3 ‘og 5′-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3’. Amplifikationen Programmet bestod af polymerase-aktivering ved 95 ° C i 30 sekunder og 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing og forlængelse ved 59 ° C i 30 sekunder. De relative ekspressionsniveauer blev normaliseret under anvendelse af komparativ tærskelcyklus (2

-ΔΔCt). Real-time PCR udført ved hjælp CFX96 Touch PCR-system (Bio-Rad). Alle ovennævnte forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Western blotting-analyse

Alle cellerne blev opsamlet i eksponentiel fase og derefter det totale protein blev ekstraheret med lysispuffer indeholdende 1% Tween 20, og endelig kvantificeret med BCA assay. Lige så stor mængde af proteiner 20 ug blev underkastet 10% koncentration SDS-PAGE. Proteinerne adskilles ved SDS-PAGE under gelerne blev overført til nitrocellulose (NC) membraner (Amersham, St. Giles, UK). Efterfølgende blev NC-membraner blokeret med 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur og derefter inkuberet med muse-anti-human

NDRG2

antistof (1: 800) (Santa Cruz, USA) natten over ved 4 ° C. GAPDH protein detektion blev anvendt som en intern kontrol. Efter vask tre gange, de overførte blots indeholdende

NDRG2

bånd blev visualiseret med peberrod-peroxidase (HRP) -konjugeret anti-muse eller anti-kanin sekundært antistof (fortynding 1: 2000, Santa Cruz) i 2 timer ved stuetemperatur. De forøget kemiluminescens (ECL) systemet afsløring løsninger (Pierce, NJ) blev derefter anvendt, og kvantificeret ved Kodak Digital Science ID software (Kodak, NY).

lentivirus Infektion

At producere lentivirus, 293T-celler blev cotransficeret med PLEN-GFP-

NDRG2

eller PLEN-GFP-lacZ, som blev forstærket i

E. coli

DH5a, oprenset under anvendelse af et Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA), og transficeret ind i 70% sammenflydende 293T-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Lentivirale partikler blev høstet fra supernatanten 72 timer efter transfektion og oprenset ved ultracentrifugering. Disse partikler blev følgende benævnt udlåns-

NDRG2

, og LEN-lacZ (negativ kontrol). Stabilt inficerede T24-celler blev selekteret under anvendelse blasticidin, ved at tælle grønt fluorescerende protein (GFP) -positive celler under fluorescensmikroskopi (Olympus, Japan), påført ved den minimale koncentration af blasticidin, efter en seriel titrering, der kræves for at dræbe ikke-inficerede T24-celler. Cellen linje blev inddelt i følgende tre forsøgsgrupper: 1)

NDRG2

gruppe (udlåns-

NDRG2

-inficerede celler), 2) lacZ gruppe (LEN-LacZ-inficerede celler), og 3) CON gruppe (ikke-inficerede celler). Både Real-time PCR og Western blot bekræftet, at vi med succes inficeret T24 celler med lentiviral og overekspression af

NDRG2

ordentligt efter infektion. Vi konstaterede også den differentielle ekspression af proteiner, som korrelerede med cellecyklus fase, apoptose og cellemigration og invasion (cellecyklus protein: cyclinD1, CDK4; celleapoptose protein: p21; cellemigration og invasion protein: MMP-2 og MMP-9) .

celievækstinhiberingen Tests

i vitro

Denne test omfattede MTT assays, kolonidannelse analyser og flowcytometrisk analyse (FCA) (BD Biosciences, NJ). Hvert assay blev påført hver af de tre grupper (blindprøvekontrollen; LEN-LacZ, den negative kontrol, og udlåns-

NDRG2

, forsøgsgruppen). Forsøgene blev gentaget fem gange (1). MTT-assay: Alle celler, herunder de smittede, blev dyrket i eksponentiel fase og løsgøres ved trypsinbehandling. Levedygtige celler (2000 celler /ml) blev inokuleret i 96-brønds plader og hver gruppe havde seks reduplicative brønde. På forskellige tidspunkter, blev MTT-reagens tilsat 20 pl /brønd (5 mg /ml) og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO) efterfulgt af rystning i 10 minutter. Absorbans (A) blev målt med et autokinetic enzym skalering meter (Bio-Rad, USA) ved 490 nm bølgelængde. Cell vækstkurver derefter blev derefter trukket baseret på den gennemsnitlige A-værdier (2). Kolonidannelse assay: Celler blev podet i seks-brønds plader (200 celler /brønd) (i tre duplikatbrønde) og dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2. Efter to uger blev cellerne fikseret med methanol i 20 minutter og derefter farvet med Giemsa i 20 minutter. ddH

2O blev anvendt til at vaske cellerne tre gange for at opnå en ren baggrund. Antallet af kolonier og celletallet i hver koloni blev talt og analyseret statistisk (3). FCA: T24-celler (1 x 10

6 celler /brønd) blev udpladet i seks-brønds dyrkningsskåle lentivirus med inficeret udlåns-

NDRG2

. Tre grupper af celler blev opsamlet efter 48 timer og 72 timer henholdsvis og endelig centrifugeret og fikseret i 95% ethanol. Efter inkubation natten over ved 4 ° C blev cellerne farvet med 0,5% propidiumiodide (10 pi) i nærvær af 0,01% RNAse A og 0,1% Triton X-100, derefter blev målt med et flowcytometer.

(A og B) Kolonidannelse assay. Opregulering af

NDRG2

hæmmer kolonidannelse. (C) The Cell vækstkurver T24 celler ved MTT-metoden. Alle assays blev gentaget uafhængigt for mindst tre gange. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD (* = p 0,001).

Migration og invasion assays Salg

Invasion assay med en Matrigel-coated membran og migration assay uden Matrigel membran blev udført ved anvendelse en 24-brønds Transwell indsatser (8 pm pore filtre, BD Biosciences, Bedford, MA), som blev udført ifølge producentens instruktioner. De eksponentielle fase celler blev høstet og resuspenderet (2 × 10

5 celler /ml) i serumfrit medium, derefter podet og resuspenderet i 200 pi kulturmedium i det øvre kammer. Dernæst blev dyrkningsmediet med 20% FBS placeret i bottom godt. Transwell blev inkuberet ved 37 ° C og 5% COz atmosfære

2 natten over. De T24 Cellerne fik lov til at migrere gennem et porøst til bunden af ​​membranen. Efter inkubation blev cellerne på undersiden af ​​membranen fikseret med methanol i 5 minutter og derefter farvet med Kristallviolet. Antallet af invaderende celler eller migrerende celler blev bestemt i mikroskop ved en 400x forstørrelse på hver membran og beregnes det gennemsnitlige antal celler pr. Alle assays blev gentaget mindst tre gange uafhængigt af hinanden.

Growth Inhibition Assays

i Vivo

Seks uger gamle BALB /c nøgne mus blev købt fra Shanghai Experimental Animal center, Shanghai, Kina. Den udlåns-

NDRG2

gruppe og LEN-lacZ gruppe celler blev høstet og resuspenderet med 1 x PBS, og koncentrationen blev indstillet til 5 x 10

7 pr ml, 200 pi cell-opløsning (1 x 10

7-celler) blev injiceret subkutant i den venstre flanker nøgne mus. Musene blev tilfældigt opdelt i to grupper: udlåns-

NDRG2

og LEN-LacZ (n = 5 pr gruppe). Når gennemsnittet størrelse podede tumorer nået til 300 mm

3 (som beregnet ved ligningen: V [mm

3] = ab

2/2)

in vivo

, musene blev aflivet ved cervikal dislokation og tumorprøver blev opsamlet, fotograferet og målt for dens mængde og vægt. Musene blev anatomized at undersøge, om der var metastase til andre organer og lymfeknude. Ekspressionen af ​​

NDRG2

protein i de inokulerede tumorer i nøgne mus blev påvist ved western blot. Andre markører for proteinekspression blev også målt, herunder cellecyklus-protein: cyclinD1, CDK4; celleapoptose protein: p21; celle migration og invasion protein:. MMP-2, MMP-9

(A) T24cells inficeret med udlåns-

NDRG2

lentivirus var mere åbenlyst anholdt i G0 /G1cycle. (B) Procent af apoptotiske celler i udlåns-

NDRG2

grupper var større end i de to andre grupper (1-3). 48 timer efter infektionen (4-6); 72 timer efter infektion; (1 og 4) blank kontrol (PBS); (2 og 5) LEN-LacZ; (3 og 6) udlåns-

NDRG2

. Alle assays blev gentaget uafhængigt for mindst tre gange. Resultaterne er vist som gennemsnit ± SD

Group

NDRG2. (-)

NDRG2 (+)

X

2

værdi

s værdi

Normal tissue312Bladder carcinoma59388.761. 0.01Table 1. Angivelse af NDRG2 i normale blære væv og blære karcinom væv

CSV Hent CSV

Statistisk Analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp SPSS17.0 software (SPSS selskab, IN). Alle data er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl afledt af mindst tre uafhængige forsøg. For immunhistokemi blev forskelle på tværs af grupper valideret ved anvendelse af Chi-square test og Pearson korrelation. Analyse af varians (ANOVA), Student-Newman-Keuls (SNK) test og ikke-parametrisk test blev udført for at afgøre, om der var forskelle mellem resultaterne af analyser

in vitro

in vivo

assays. En

P

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Hyppigheden af ​​positive udtryk for

NDRG2

i blære karcinom væv var 39,17 % (38/97), hvilket var lavere end i normale blære væv (80%, 12/15), (χ

2 = 8,761,

P

0,01) (tabel 1).

NDRG2

udtryk, både frekvens og niveau var ikke korreleret med køn eller alder, men blev omvendt korreleret med patologisk stadie (r = -0,248,

P

0,05) (tabel 2) . Immunhistokemi viste at

NDRG2

protein positiv blev farvning i cytoplasmaet af normale væv og blærecarcinom (figur 1A). Ekspressionsniveauerne af

NDRG2

i blærecarcinom blev omvendt korreleret med c-myc i blære carcinom (r = -0,454,

P

0,001). (Figur 1B)

(A) virkningen af ​​

NDRG2

overekspression på G1 cellecyklus og apoptose regulatorer som analyseret ved western blot. (B) Relativ kvantificering af proteinekspression, normaliseret til GAPDH niveauer. Figuren viser tendensen hos hver gruppe som angivet. Alle assays blev gentaget uafhængigt for mindst tre gange. Resultaterne er vist som gennemsnit ± SD (** p 0,01) ..

klinisk-patologisk

Expression niveau af NDRG2

r-værdi

p-værdi

Features –

+

++

+++

Køn Mand 401173Female 1912500.320.759Age ≤60years231061 60 år 361362- 0.0490.637Grade Papilloma10442Low22961High271020-0.2480.014Table 2. Relationer mellem ekspressionen af ​​NDRG2 og blærecarcinom egenskaber.

data er præsenteret som n (antal prøver). Statistisk signifikans blev vurderet med Pearson korrelationskoefficient test. CSV Hent CSV

Både western blot og Real-time PCR viste, at alle tre f.Kr. cellelinjer havde lavere ekspressionsniveauer af

NDRG2

protein og mRNA end de normale humane blære celler (SV-HUC-1). Blandt de tre BC cellelinier viste T24 celler de laveste ekspressionsniveauer (figur 2A, B).

(A) Invasion analyse af T24 celler behandlet med udlåns-

NDRG2

. Invasionen evne blev anslået under anvendelse af Transwell coatet med Matrigel. Den invasionsevne af udlåns-

NDRG2

gruppe celler var signifikant lavere end i de to andre grupper. ** P 0,001. (B) Migration analyse af T24 celler behandlet med udlåns-

NDRG2

. Migrationen evne blev anslået under anvendelse af Transwell ubestrøget med Matrigel. Migrationen evne udlåns-

NDRG2

gruppe celler var signifikant lavere end i de to andre grupper. ** P 0,001. (C og D) Ekspression af MMP-2 og MMP-9 blev målt efter T24-celler blev inficeret med udlåns-

NDRG2

. Udlåns-

NDRG2

gruppe reducerede MMP-2 og MMP-9-ekspression sammenlignet med de andre grupper (** p 0.01).

Group

G0/G1

G2/M

S

Apoptosis

Control48h62.42±2.053.55±0.5534.03±1.655.53±0.6272h69.84±2.602.79±0.4427.73±0.905.57±0.59LEN-LacZ 48h48h64.24±1.923.56±0.5632.21±0.666.49±1.2572h69.63±2.403.08±0.4027.29±0.616.52±1.17LEN-NDRG2 48h48h71.40 ± 0.378.50 ± 0.4720.10 ± 0.3010.25 ± 2.4372h77.61 ± 0.997.05 ± 0.1515.34 ± 0.1712.88 ± 3.01Table 3. Andelen af ​​Cell cyklus fase og celle apoptose induceret af udlåns- NDRG2 på T24-celler.

CSV Hent CSV

(A) udlåns-

NDRG2

undertrykte væksten af ​​tumorer i forhold til LEN-LacZ. Ud undertrykte tumorvækst, den LEN-LacZ gruppen var fundet at have lymfeknudemetastaser. (B) tumor vækstkurver. (C) Forhold mellem tumormasser til muse masser i forskellige grupper. (D) masser af tumorer i to grupper. kurverne og histogrammer blev trukket ud fra de gennemsnitlige værdier ( . n = 5) i to grupper resultaterne er vist som middelværdi ± SD (*, ** p. 0,001)

det blev vist ved fluorescensmikroskopi, at effektiviteten af ​​infektion var høj væsen mere end 95% (figur 3A). Real-time PCR-analyse viste, at mRNA ekspressionsniveauerne af

NDRG2

i udlåns-

NDRG2

gruppe var signifikant højere end i LEN-lacZ (negativ gruppe) og CON grupper (

P

0,05) (figur 3B). Western blot-analyse viste, at

NDRG2

protein niveau i udlåns-

NDRG2

gruppe var højere end i LEN-LacZ og CON grupper (figur 3C). Den udlåns-

NDRG2

også forårsaget overekspression af

NDRG2

i T24 celler. celle vækstkurver og kolonidannelse den viste, at overekspression af

NDRG2

kunne undertrykke væksten af ​​T24 celler mere end i de to andre grupper. I celle vækstkurver analyser, hæmning begyndte den tredje dag og blev mere indlysende derefter (F≥44.58,

P

0,01) (Figur 4). FCA viste, at T24 celler med udlåns-

NDRG2

kunne øge andelen af ​​celler i G

0 /G

1 sammenlignet med de LEN-lacZ grupper og negativ kontrol, hvilket indikerer, at ovexpression af

NDRG2

havde gjort T24 celler til at anholde i G1 cyklus (48 h: F = 41,92,

P

0,01; 72 h: F = 24.11,

P

0,01). (Figur 5, tabel 3.) Western blot viste, at overekspression af

NDRG2

nedregulerede CDK4 og cyclinD1, mens opregulerer p21 i T24-celler (figur 6a, b).

(A) effekt af

NDRG2

overekspression på cellecyklus, apoptose og metastase regulatorer som analyseret ved western blot. (B) Relativ kvantificering af proteinekspression, normaliseret til GAPDH niveauer. Western blots blev analyseret med Kodak Digital Science endimensional software. Figuren viser tendensen hos hver gruppe som angivet. Alle assays blev gentaget uafhængigt for mindst tre gange. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD (* p 0,01).

Transwell migration assays og Matrigelcoatede transwell invasion assays blev udført med T24-celler. De repræsentative mikrografer blev udtaget fra den nedre overflade af Transwell filter, og celler, som migrerede eller invaderet blev farvet med Kristallviolet. Som vist i figur 7A, den invasive potentiale, som er bestemt af cellernes evne til at invadere en Matrigel barriere, var også betydeligt undertrykt i

NDRG2

-overexpressing celler (

P

0,01 ). Desuden tvang udtryk for

NDRG2

i T24 celler betydeligt undertrykt deres vandring gennem transwell (P 0,01). (Figur 7B)

I Western blot analyser, sammenlignet med den LEN-lacZ gruppe og blindprøvekontrol, gruppen af ​​udlåns-

NDRG2

kan undertrykke MMP-2, MMP-9 proteinekspression niveau i T24 celle (Figur 7C, D). MMP-2 og MMP-9 blev højt udtrykt i blærekræft metastase, så

NDRG2

sandsynligt inhiberede metastase af blærekræft ved at regulere ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9.

tumor vækstkurver blev tegnet ved at måle størrelsen af ​​tumorer. Alle nøgne mus overlevede efter injektioner med lentivirus. T24-celler blev injiceret 2 uger senere, tumorens volumen på to grupper begyndte at dukke forskelligt. Fra tre uger var forskellen i tumorvolumen begyndte at vise statistisk signifikant (F≥31.65, s 0,001) (figur 8B). I forhold til LEN-LacZ gruppe, tumor vægt af udlåns-

NDRG2

var betydeligt lettere (F≥39.82, s 0,001) (figur 8D). Forholdet mellem tumor vægt til musevægt indikerede, at den fysiske tilstand af musene i udlåns-

NDRG2

gruppe var meget bedre end den af ​​musene i LEN-LacZ gruppe (F = 39,81, p 0,001) (figur 8C), hvilket indikerer, at overekspression af

NDRG2

kunne undertrykke væksten af ​​tumorer. Ved anatomizing musene blev ipsilaterale lymfeknudemetastaser vist i LEN-LacZ gruppen, men ingen andre organer var involveret; dog i udlåns-

NDRG2

gruppe ingen nogen metastatisk læsion blev fundet (figur 8A). Western blot viste, at

NDRG2

protein blev opreguleret i tumorer i udlåns-

NDRG2

gruppe, og at overekspression af

NDRG2

nedreguleret cyclinD1, CDK4, MMP-2, MMP-9; og opreguleret p21

in vivo

(Figur 9A, B).

Diskussion

Ca. 75% af alle patienter blærekræft gentage sig inden for de første 5 år [14], det høj grad af gentagelse af blærekræft og dens væsentlige metastatisk potentiale har gjort patienternes pleje og prognose anfægtes. Derfor, for at øge tidlig diagnose sats og også for at etablere er et presserende behov nye terapeutiske tilgange gennem forskning af blærekræft.

NDRG2

er en kandidat tumorsuppressorgen, og en række undersøgelser har bekræftet, at det spiller en vigtig rolle i celleproliferation, apoptose og metastase [15,16]. Vores resultater i den aktuelle undersøgelse fås fra blærekræft understøtte disse tidlige resultater.

Vi viste, at

NDRG2

spiller en vigtig rolle i blærekræft, der ligner dens rolle i andre maligne tumorer. Immunhistokemi Resultaterne viste, at den positive ekspressionsniveauet af

NDRG2

i blærecarcinom væv var signifikant lavere end i normale blære væv. Ekspressionsniveauerne af

NDRG2

faldt som graden af ​​blærecarcinom malignitet forøget. Vi fandt også, at ekspressionen af ​​

NDRG2

omvendt var korreleret med c-myc, svarer til den, set i andre tumorceller. I mellemtiden er den

NDRG2

ekspressionsniveauer i blærekræft cellelinier (T24, 5637 og BIU-87) var lavere end normalt blære cellelinje (SV-HUC-1).

Lentivirus har været vist sig at være egnet til genterapi, fordi de kan stabilisere integrere i værtsgenomet at give langsigtet ekspression af målgenet, desuden har lentivira blevet bekræftet at være gradvis sikker ved udviklingen af ​​split plasmid systemer til vektorproduktion at forhindre generation af replikationskompetent virus [17].

Undersøgelser udført af Liu et al. angivet, at

NDRG2

var en ny målgen, der er reguleret af p53 og

NDRG2

mRNA og protein niveauer kan være opreguleret i en p53-afhængig måde. Og de yderligere rapporteret, at lyddæmpning af

NDRG2

dæmper p53-medieret apoptose [18]. I mellemtiden blev det rapporteret, at

NDRG2

kunne opregulere ekspressionen af ​​p53 i brystcancerceller [19]. Disse data kraftigt antydet, at

NDRG2

var en vigtig faktor i reguleringen af ​​tumorceller apoptose. I mellemtiden blev CDC20 reguleret af p53 til at inhibere de maligne cancerceller vokse [20]. Cyclin D1 spiller en vigtig rolle i cellecyklussen, binder til cyclinafhængige kinaser (CDK4 /6), og fremmer phosphorylering af RB1, orkestrere progression gennem G1 restriktion punkt [21].

NDRG2

kan regulere ekspressionen af ​​proteiner (p21, cyclinD1 og CDK4) i blæren kræftceller gennem opregulering af p53. Vi brugte lentivirus-medieret

NDRG2

overekspression strategi for at hæmme proliferation af T24 celler, for at fremme deres apoptose både

in vitro

in vivo

; denne mekanisme er blevet demostracted ved at regulere ekspressionen af ​​proteiner p21, cyclinD1 og CDK4, som er vigtige i celle apoptose og cyklus.

For nylig, flere rapporter tyder på, at

NDRG2

kunne spille en afgørende rolle i hæmning af tumormetastase. Det forlyder, at

NDRG2

kunne antagonisere transformerende vækst factorβ1-medieret tumorcelleinvasion ved specifikt at nedregulere ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinase 2 og laminin 332 pathway komponenter, med samtidig undertrykkelse af Rho GTPase aktivitet i hepatocellulære carcinomer [22 ]. MMP-2 og MMP-9 var høj ekspression i muskel-invasiv blærecancer og metastatisk blærecancer [21,23]. I denne undersøgelse viste western blot assay, der udlåns-

NDRG2

i T24-celler var associeret med signifikant reduktion i MMP-9-ekspression og let nedsat MMP-2-ekspression antyder, at

NDRG2

-overexpression kan regulere ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 og inhibere invasionen evne af metastatiske blære cancerceller. Denne konklusion blev støttet af både

in vivo

og

in vitro

analyser. Vi mistanke om, at ekspressionen af ​​

NDRG2

betydeligt undertrykker MMP-2 og MMP-9 ved at regulere NF-kB signalering i blæren cancerceller [24].

Som konklusion, vi har demonstrerede antioncogenic rolle

NDRG2

i udviklingen og invasion af blærekræft. Da

NDRG2

er impliceret i mange aspekter af tumor progression, herunder cellevækst, cellecyklusregulering, invasion og migration, det repræsenterer en lovende terapeutisk mål for blærekræft. Men flere undersøgelser stadig behov for at belyse yderligere mekanismen i

NDRG2

. Forskning i denne retning vil endelig give nye metoder til tidlig diagnose, roman terapi og postoperativ skærm i blærekræft.