PLoS ONE: Differential Behandling af Lad-7a Forstadier Påvirker RRM2 Expression og kemosensitivitet i kræft i bugspytkirtlen: rolle LIN-28 og SET Oncoprotein

Abstrakt

Overekspression af ribonukleotidreduktase subunit M2 (RRM2), der er involveret i deoxyribonukleotid syntese, driver kemoresistens af kræft i bugspytkirtlen til nukleosidanaloger (f.eks gemcitabins). Mens lyddæmpende RRM2 ad syntetisk vej har vist lovende i at reducere kemoresistens, rettet mod endogene molekyler, især mikroRNA (miRNA), at fremme kemoterapeutiske resultater har været dårligt udforsket. Baseret på beregningsmæssige forudsigelser, vi hypotese, at den

Lad-7

tumor suppressor miRNA vil hæmme RRM2-medieret gemcitabin kemoresistens i kræft i bugspytkirtlen. Reduceret udtryk for flertallet af

Lad-7

miRNA med et omvendt forhold til RRM2 ekspression blev identificeret i medfødt gemcitabin-resistente bugspytkirtelkræft cellelinjer. Direkte binding af

Lad-7

miRNA til 3’UTR af RRM2 udskrifter identificerede post-transkriptionel regulering af RRM2 påvirke gemcitabin kemosensitivitet. Interessant, overekspression af menneskelig precursor-

Lad-7

miRNA førte til differential RRM2 udtryk og kemosensitivitet svar i en dårligt differentieret bugspytkirtelkræft cellelinje, MIA PaCa-2. Defekt behandling af

Lad-7a

forstadier til modne formularer, delvist forklarede uoverensstemmelser observeret med

Lad-7a

udtryksmæssige resultater. Konsekvent, at forholdene mellem modne forstadium

Lad-7a

blev gradvist reduceret i gemcitabin-følsomme L3.6pl og Capan-1 cellelinjer tilskyndet til at erhverve gemcitabin modstand. Udover kendte regulatorer af

Lad-7

biogenese (f.eks LIN-28), korte hårnål RNA bibliotek screening identificeret flere roman RNA-bindende proteiner, herunder SET oncoproteinet, at differentieret effekt

Lad-7

biogenese og kemosensitivitet i gemcitabin-følsomme versus resistente bugspytkirtelkræftceller. Endvidere LIN-28 og SET knockdown i cellerne førte til dybe reduktioner i celleproliferation og koloni-dannelse kapacitet. Endelig defekt behandling af

Lad-7a

forstadier med en positiv korrelation til RRM2 overekspression blev identificeret i patient-afledte bugspytkirtlen duktalt adenocarcinom (PDAC) væv. Disse data viser en indviklet post-transkriptionel regulering af RRM2 og kemosensitivitet af

Lad-7a

at manipulation af regulatoriske proteiner involveret i

Lad-7a

transskription /behandling kan give en mekanisme til at forbedre kemoterapeutiske og /eller tumor vækst kontrol reaktioner i bugspytkirtelkræft

Henvisning:. Bhutia YD, Hung SW, Krentz M, Patel D, Lovin D, Manoharan R, et al. (2013) Differential Behandling af

Lad-7

en Forstadier Påvirker RRM2 Expression og kemosensitivitet i kræft i bugspytkirtlen: rolle LIN-28 og SET oncoproteinet. PLoS ONE 8 (1): e53436. doi: 10,1371 /journal.pone.0053436

Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense University, Spanien

Modtaget: 14. september 2012; Accepteret: November 28, 2012; Udgivet: 15 Jan 2013

Copyright: © 2013 Bhutia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NCI-5-P50-CA128613-SPORE (RG), NCI-1R03CA161832-01 (RG), Georgia Cancer Coalition-Georgia Research Alliance (RG), og af Institut for Farmaceutiske og Biomedicinsk Institut, University of Georgia , Athens, GA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ribonukleotidreduktase (RR) er et hastighedsbegrænsende enzym for cellereplikation, som katalyserer reduktionen af ​​ribonukleotider til deoxyribonukleotider under DNA-syntese. Det overudtrykkes i en række faste tumorer, herunder pancreas [1]. Akkumulere tyder på, at RR fungerer som en positiv determinant for tumorcelleproliferation og metastase samt udvikling af kemoresistens til nukleosidanaloger, der anvendes til behandling af pancreascancer (fx gemcitabin, capecitabin, 5-fluorouracil) [2] – [6]. RR aktivitet reguleres under S-fasen af ​​cellecyklussen primært ved transkriptionel aktivering af en af ​​dens ikke-identiske subunits, kaldet RRM2 [7], [8]. RRM2 ekspression er blevet vist at blive induceret i kemoresistent celler ved genamplifikation, transkriptionel aktivering, og måske andre uidentificerede mekanismer [5], [9]. Nylige undersøgelser har vist, at exogene manipulationer af RRM2 ekspression ved siRNA eller antisense-oligonukleotider forbedre kemosensitivitet i pancreascancer [10], [11].

Selvom nedmodulering af RRM2 ad syntetisk vej (f.eks siRNA) har vist potentiale i faldende tumorvækst og gemcitabin kemoresistens, har mulighederne for at manipulere endogene molekyler til at forbedre gemcitabin svarene og måske forbedre terapeutiske resultater i bugspytkirtelkræft aldrig blevet udforsket. MikroRNA’er (miRNA), endogent udtrykte -22-nt lange RNA’er stand til post-transkriptionelt lyddæmpende target gen udtryk, tilbyder flere fordele i denne henseende. For eksempel det store antal miRNA i det menneskelige genom og deres forskellige mål [12] tillade udvalg af miRNA (er) ikke blot at forbedre chemosensitization men også positivt påvirke mange gen regulatoriske netværk involveret i aspekter som tumorvækst, invasion, cancer stamceller overlevelse, etc. [13], [14]. Eftersom miRNA ofte nedreguleres i kræft [15], [16], genetablere deres udtryk kan lette synergistiske vækst-kontrol reaktioner med kemoterapeutiske midler. Desuden vil udvide forståelsen af ​​miRNA genregulering give muligheder for at manipulere deres ekspression med små molekyler uden kompleksiteten af ​​syntetisk oligonukleotid levering i tumorer.

I søgning efter formodede miRNA inhibitorer af RRM2 af beregningsmæssige miRNA target prædiktionsalgoritmen , fandt vi

lad-7

familie af tumor suppressor miRNA til at besidde et frø match for baseparring med 3’UTR af RRM2 (kontekst score percentil: 94; TargetScanHuman 5.1). Konsekvent, har tidligere undersøgelser impliceret en årsagssammenhæng mellem

Lad-7

og RRM2, identificere nedregulering af mange

Lad-7

familiemedlemmer i RRM2-overekspression, gemcitabin-resistente bugspytkirtelkræftceller eller en reduktion i RRM2 udtryk efter

lad-7

overekspression [17], [18]. Endvidere overekspression af

lad-7

viste sig at forøge radiosensibilisering af pancreatiske tumorceller [19], mens inhibering af RRM2 blev identificeret til at sensibilisere pancreastumorer til ultraviolent stråling [20], [21]. For nylig tvunget udtryk for

Lad-7

miRNA viste sig at hæmme kræft i bugspytkirtlen celledeling

in vitro

men ikke tumorvækst

in vivo

mistanke om komplekse funktionelle forgreninger [22]. Derfor, for at undersøge mulighederne samspil mellem

Lad-7

RRM2 og til yderligere at udforske muligheden for at udnytte

Lad-7

for kræft i bugspytkirtlen terapi, vi har forsøgt at bestemme direkte virkning af menneske

lad-7

familie på RRM2-medieret iboende gemcitabin modstand. Her rapporterer vi en indviklet regulering af RRM2 udtryk og gemcitabin chemosensitization af

lad

-7

en

forstadier og identificere, at miRNA transkriptionelle /maskiner involveret i moden

Lad-7a

biogenese er tilbøjelige til at handle som en afgørende faktor, når man overvejer

lad

-7a-baserede lægemidler til kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Tumor RNA og væv

Total RNA fra 10 PDAC væv og 2 normale pancreas væv blev indkøbt fra Asterand (Detroit, MI). Den demografiske og kliniske oplysninger med RNA-prøver er vist i

Tabel S1

. Seks PDAC vævsprøver sammen med de matchede normale tilstødende væv blev indkøbt fra National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA) [23]. NDRI opnår skriftlige samtykke fra kilderne. Indkøb og brug af disse humane væv til denne forskning blev udført i overensstemmelse med University of Georgia Institutional Review Board. Bestyrelsen har besluttet, at anvendelsen af ​​humane biologiske væv i denne forskning ikke opfylder kriterierne for forskning med mennesket som forsøgsperson pr 45 CFR 46,102, og derfor ikke kræver menneskelig emne godkendes af bestyrelsen.

Reagenser

Gemcitabin blev opnået fra ChemieTek (Indianapolis, IN). Føtalt bovint serum (FBS) var fra PAA Laboratories, Inc. (Ontario, Canada). 4 ‘, 6’-diamidino-2-phenylindol (DAPI), dimethylsulfoxid (DMSO), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), propidiumiodid, ethylenglycol-bis- (2-aminoethyl ether) tetraeddikesyre (EGTA), phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), N-ethylmaleimid (NEM), natriumorthovanadat (Na

2VO

4), og iodacetamid blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Den bicinchoninsyre (BCA) protein-assay-reagens og West Pico kemiluminiscerende substrat var fra Pierce Chemical (Rockford, IL). Fluorescerende anti-fade monterings reagens og Vybrant DyeCycle grøn blev opnået fra Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA). Plasticware til celledyrkning blev opnået fra Corning (Corning, NY). Alle celledyrkningsmedier blev indkøbt fra Mediatech (Manassas, VA) med undtagelse af den humane keratinocyt basalt medium, som blev indkøbt fra Molecular Probes.

Antistoffer Salg

anti-humant gede-polyklonalt RRM1 (T- 16), RRM2 (E-16), dCK (L-19), hCNT3 (C-15), og SET /I2PP2A (E-15) antistoffer samt monoklonale muse hnRNP-A1 (4B10) antistof blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Detaljerne i hENT1, hENT2, hCNT1, hCNT2, og p-actin antistoffer blev beskrevet tidligere [23], [24]. Den anti-humant polyklonalt kanin-CDA (ab56053) og anti-humane monoklonale muse KHSRP antistoffer blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA). Den anti-humant polyklonalt kanin-LIN-28-antistof blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Konstruktioner Salg

RRM2 cDNA uden 3’UTR region blev konstrueret fra RRM2 truclone (RRM2 (NM_001165931) Humant cDNA klon, Produkt-id: SC326997, Origene, MD) ved hjælp af PCR-baserede metoder. Den pmiRGLO-G-FUD konstruktion blev oprindeligt opnået fra Promega (Madison, WI) og modificeret til at indeholde GFP fusioneret med ildflue-luciferasegenet, hvilket gør det et dobbelt reporter assay. Promotoren var også fjernet og udskiftet med CMV-promotoren. Som en journalist til forarbejdning, konstruktioner, der indeholdt -50 basepar opstrøms og nedstrøms for

lad-7a-1 Hotel (pmirGLO-GFP /luc-præ-

lad-7a-1

) og

lad-7b Hotel (pmiR-glo-GFP /luc-præ-

lad-7b

) microRNA’er blev foretaget og klonet nedstrøms for GFP-Luc 3’UTR. Ved korrekt behandlet, spaltning af microRNA destabiliserer GFP /Luc mRNA, der fører til en reduktion i begge proteiner.

Cell Culture, immunocytokemi, MTT cytotoksicitet flowcytometri, kolonidannelse, og Real-time PCR-analyser

Disse procedurer blev udført som beskrevet tidligere [23], [24]. TaqMan primere og prober til RRM2 (Hs00357251_g1) blev opnået fra Applied Biosystems (Foster City, CA).

miRNA Detection

Total RNA isolering og cDNA-syntese blev udført ved hjælp af

mir

Vana miRNA Isolation Kit og TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), henholdsvis som pr producentens anvisninger. Relativ kvantificering af RNA-transkripter blev udført som beskrevet tidligere [23], [24]. Validerede TaqMan primere og prober til

Lad-7a

(hsa000377),

Lad-7b Hotel (hsa002619),

Lad-7c

(hsa000379),

bogstav 7d

(hsa002283),

lad-7e

(hsa002406),

lad-7f

(hsa000382),

lad-7g Hotel (hsa002282),

lad-7i

(hsa002221), pri-

lad-7a-1 Hotel (Hs03302533_pri), pri-

lad-7a-2 Hotel (Hs03302539_pri), og pri-

lad-7a-3

(Hs03302546_pri) anskaffet fra Applied Biosystems blev anvendt.

Generation gemcitabin-resistente pancreas tumorceller

Celler blev udsat for stigende koncentrationer (5-20 nM) af gemcitabin i 5-6 uger om koncentration.

Western blotting

Western blotting-analyse blev udført som beskrevet tidligere [23], [24], bortset fra følgende modifikationer. Totale cellelysater fremstilledes i lysepuffer indeholdende 10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM natriumfluorid, 10 mM NEM, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM iodacetamid, 0,5% Triton-X 100, og en proteasehæmmer cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). PH af lysepuffer blev holdt på 7,4. Efter at have vurderet proteinindhold med BCA Protein Assay Kit, blev 50 ug /bane indlæst og elektroforetisk separeret på 10% polyacrylamid natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) geler og overført ved 150 V i 1 time eller 20 V natten over til en polyvinylidenfluorid ( PVDF) -membran (Millipore, Billerica, MA). Antistoffer mod de enzymer (RRM1, RRM2, dCK, CDA) og nukleosid transportører (hCNT1, hCNT3, ent1, ENT2) [24] blev brugt i 1:500-1000 fortyndinger. Densitometriske analyser blev udført som beskrevet før [23].

Generation of MIA Paca-2 Stabile celler, der overudtrykker Pre-

lad-7

medlemmer

FIV-lad-7 konstruktioner (

lad-7a-2

,

lad-7a-3

,

lad-7b

,

lad-7c

,

bogstav 7e

,

lad-7f-1

,

lad-7f-2

,

lad-7 g

, og

lad-7i

) fra GeneCopoeia (Rockville, MD) og HIV-lad-7-konstruktioner (lad-7a-1 og lad-7d) fra System Biosciences (Mountain View, CA) blev anvendt. Lentivirale pakkeceller (293Ta; GeneCopoeia) blev podet ved en densitet på 1,3-1,5 × 10

6 i 10 cm-skåle indeholdende 10 ml DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS. Cellerne fik lov til at nå 70-80% konfluens ved transfektion af ovennævnte konstruktioner. Virusinfektioner blev udført i henhold til fabrikantens anvisninger. Kort fortalt blev 2,5 ug af udtrykket DNA-klon og 5 pi (0,5 pg /pl) i Lenti-Pac FIV /HIV blanding fortyndet i 200 pi Opti-MEM (Invitrogen). I et separat rør blev 15 pi EndoFectin Lenti også fortyndet i 200 pi Opti-MEM. Den fortyndede EndoFectin Lenti reagens blev derefter tilsat dråbevis til DNA-opløsningen og vortexet. Blandingen blev derefter inkuberet i 10-25 minutter ved stuetemperatur for at tillade DNA-Endofectin kompleks til dannelse. DNA-Endofectin Lenti-komplekset blev tilsat direkte til hver skål af 293Ta celler. Skålene blev forsigtigt hvirvlet for at fordele komplekset og derefter inkuberet natten over i en CO

2 inkubator ved 37 ° C. Cellerne blev udskiftet med frisk DMEM-medium efter 24 timer, og lentivira blev høstet og filtreret ved 24-48 timer efter transfektion. For transduktionen af ​​emballerede lentivirale ekspressions-kloner, blev MIA PaCa-2-celler podet i 10 cm skåle 24 h før virusinfektion. De blev efterfølgende inficeret med 3 ml af den virale suspension i opløsning med 8 ug /ml polybren. Cellerne blev derefter inkuberet natten over i en CO

2 inkubator ved 37 ° C, hvorefter de blev suppleret med friske medier. Efter en 24 timer vækstperiode, kulturer inficeret med Zeocinresistente gener (pMIF-eGFP-Zeo) blev udvalgt med 400 ug /ml Zeocin (Invitrogen), og inficeret med puromycin-resistente gener (pEZX-MR04) blev selekteret med 10 ug /m puromycin.

shRNA-baserede Screening for Formodede RNA Processing Proteiner

96 shRNA konstruktioner fra Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Huntsville, AL) blev opnået fra Genome Sciences Resource på Vanderbilt Universitet. Den lentivirale Pakkecellelinie (Phoenix) blev podet ved en densitet på 1 x 10

6 i 6 cm-skåle indeholdende 5 ml DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS. Cellerne blev dyrket til 70-80% konfluens på tidspunktet for transfektion med shRNA konstruktioner. Virusinfektioner blev udført i henhold til fabrikantens anvisninger. Kort fortalt, 1 ug af udtrykket DNA-klon, 0,75 ug af emballagen vektoren (pCMV~DR7.74psPAX2) og 0,3 ug af konvolutten vektor (pMD2.G) blev blandet og tilsat til et rør indeholdende 200 pi Opti-MEM ( Invitrogen) og 6 pi Fugene 6 (Roche). Blandingen blev derefter inkuberet i 25 minutter ved stuetemperatur, hvorefter den blev direkte tilsat til hver skål af Phoenix celler. Skålene blev forsigtigt hvirvlet for at fordele komplekset og derefter inkuberet natten over i en CO

2 inkubator ved 37 ° C. Cellerne blev udskiftet med frisk DMEM-medium efter 24 timer, og lentivira blev høstet og filtreret ved 24-48 timer efter transfektion. For transduktionen af ​​emballerede lentivirale ekspressions-kloner, blev MIA PACA-2 og L3.6pl celler udsået i 6-brønds klynger 24 timer forud for virusinfektion. De blev efterfølgende inficeret med 1 ml af den virale suspension i opløsning med 4 ug /ml polybren. Cellerne blev derefter inkuberet natten over i en CO

2 inkubator ved 37 ° C, hvorefter de blev suppleret med friske medier. Efter en 24 timer vækstperiode blev cellerne udvalgt med 0,5 og 0,1 ug /ml puromycin for MIA PaCa-2 og L3.6pl hhv. Adskillige stabile kloner blev screenet ved mikroskopi for GFP co-ekspression.

Target

In Vitro

Reporter Assay

For luciferase bindingsassays, 293Ta celler blev podet på en 24-brønds klynge ( 5 × 10

3 celler /brønd) og transduceret med forskellige lad-7 forstadier ved hjælp af lentivirale genoverførselsfremgangsmåde (som beskrevet tidligere). Fireogtyve timer efter podning blev cellerne suppleret med frisk medium og transficeret med 1 ug af det betjeningsorgan eller RRM2 3’UTR målvektoren (ID: HmiT053958; GeneCopoeia), 100 pi Opti-MEM (Invitrogen) og 3 pi FuGeneHD transfektion reagens (Roche) ifølge producentens protokol. Seksogtredive timer efter transfektion blev cellerne lyseret ved den passive lysis procedure og håndteres som beskrevet i Dual-Luciferase Assay Kit (Promega). Cellelysater blev centrifugeret ved 10.000 rpm i 30 s, og luciferase-assayet blev udført med den klare supernatant overført til en sort 96-brønds mikrotiterplade (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Tyve pi af cellelysat blev blandet med 100 pi LARII løsning at begynde reaktionen og 100 pi Stop og Glo reagens blev anvendt til samtidigt at slukke luciferase og start renilla reaktionen. Luciferase og renilla luminescens blev kvantificeret ved 100 nm, og hvert eksperiment blev gentaget tre gange. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD.

Statistisk analyse

Den studerendes t-test blev anvendt til at identificere signifikante forskelle, og hvert forsøg blev gentaget mindst tre gange. Medmindre andet er angivet,

s

0,05,

s

0,01 og

s

0,001 sammenlignet med kontrol betingelser var repræsenteret ved en, to, og tre stjernerne henholdsvis.

Resultater

RRM2 og

lad-7

er omvendt Udtrykt i Human bugspytkirtelkræftceller

Vi først verificerede RRM2 udtryk i bugspytkirtelkræft cellelinjer, der blev kategoriseret tidligere som i sagens natur gemcitabin-følsomme eller resistent [23]. QRT-PCR (

Fig. 1A

) og Western blotting (

Fig. 1B

) analyser viste signifikant højere RRM2 mRNA (2-3 gange) og protein (5-6 gange) udtryk, henholdsvis i 2 ud af de 3 gemcitabin-resistente cellelinier undersøgt (MIA PaCa-2 og PANC-1) som vurderet ved sammenligninger med en normal human pancreas ductal epitel (HDPE) cellelinie. Omvendt blev sammenlignelige RRM2 udtryk identificeret mellem de fleste gemcitabin følsomme cellelinjer (L3.6pl og Capan-1) og HDPE (

Fig. 1A-B

). Disse resultater tyder på, at en overekspression af RRM2 sandsynligvis spille en rolle i gemcitabin kemoresistens i størstedelen af ​​kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, hvis ikke alle.

A,

RRM2 mRNA-ekspression i bugspytkirtelkræft cellelinier i forhold til ekspression identificeret i HDPE.

Kolonner,

betyde af tre eksemplarer;

barer,

SD. n = 3.

B,

Western blotting-analyse af RRM2 (~45 kDa) og β-actin (45 kDa) i helcellelysater af HPDE og bugspytkirtelkræft cellelinjer.

C,

Angivelse af

bogstav 7

familiemedlemmer i bugspytkirtelkræft cellelinjer forhold til udtryk i HDPE.

Kolonner

, gennemsnit af tre eksemplarer;

barer

, SD. n = 3; *

P

0,05.

D,

RRM2 er et direkte mål for

Lad-7

. 293TA og MIA PaCa-2 celler blev viralt inficeret for ekspression af forstadier af

lad-7a-1

,

lad-7a-2

,

lad-7a-3

,

lad-7b

, og miR-214 (

negativ kontrol

) og efterfølgende transficeret med et RRM2 3’UTR luciferase reporter konstruktion. Luciferaseaktiviteter målt 36 timer efter transfektion (normaliseret i forhold til renilla aktivitet) blev afbildet.

Kolonner

, gennemsnit af tre eksemplarer;

barer

, SD. n = 3. *

s

0,05, **

s

. 0,01

For at vurdere

Lad-7

kontrol over RRM2 udtryk, vi efterfølgende profileret de førnævnte cellelinjer til relativ udtryk for alle

lad-7

familiemedlemmer ved QRT-PCR. Interessant, signifikant lavere udtryk for det meste af den

Lad-7

miRNA sås kun i cellelinier med relativt større RRM2 udtryk. MIA PaCa-2 udviste reduceret ekspression af

Lad-7a

,

Lad-7b

,

Lad-7c

,

Lad-7e

,

lad-7f

, og

lad-7 g

, PANC-1 udviste reduceret ekspression af

lad-7b

,

lad-7c

,

lad -7d

,

lad-7 g

,

lad-7h

, og

lad-7i

, og BxPC-3 udviste reduceret ekspression af

bogstav 7b

,

lad-7c

,

lad-7d

,

lad-7f

, og

lad-7i Hotel (

fig . 1C

). Ingen for kun få

Lad

-7 medlemmer var betydeligt reduceret udtryk i de resterende cellelinjer, som udtrykte tilsvarende niveauer af RRM2 protein som HPDE (dvs. L3.6pl: ingen; AsPC-1:

lad -7C

; Capan-1:

lad-7c

,

lad-7f

) (

fig 1C

).. Disse resultater understøtter et omvendt forhold mellem RRM2 og

Lad-7

udtryk i bugspytkirtelkræftceller.

Vi derefter testet direkte interaktion af

Lad-7

med RRM2 ved transfektion et luciferase-ekspressionskonstruktion fusioneret til 3’UTR af RRM2 ind 293Ta (ATCC-CRL-9078) [23] og MIA PaCa-2 transient overekspression

lad-7

medlemmer. Mens alle

Lad-7

medlemmer faldt betydeligt luciferase udtryk i 239Ta celler, mange

bogstav

7 medlemmer bragte et signifikant fald i luciferase udtryk i MIA PaCa-2-celler samt (

fig. 1D

), hvilket tyder på, at den direkte binding af

lad-7

til RRM2 3’UTR forårsager RRM2 undertrykkelse. Endelig da

lad-7

overekspression øger G2 /M brøkdel af fibroblaster [25], og RRM2 ekspression er specifik for S-fase celler, afprøvede vi rollen som

lad-7

i reducere RRM2 ekspression ved at formindske andelen af ​​MIA PaCa-2 i S-fase. Under disse betingelser, men ingen fremtrædende fald i S-fase celler blev observeret i nogen af ​​de præ-

Lad-7

overekspression MIA PaCa-2 (

Fig. S1

). Tilsammen disse data sandsynligvis tyder på, at

Lad-7

medlemmer kan endogent hæmme RRM2 udtryk ved direkte post-transkriptionel repression i MIA PaCa-2.

Menneskelig

Lad-7

prækursorer Differentielt Ændre RRM2 Expression og Gemcitabin Chemosensitization i MIA PaCa-2

Vi har forsøgt siden generere stabile kloner af MIA PaCa-2, der overudtrykker en af ​​ti menneskelige

lad-7

forstadier [27 ] for at studere deres virkninger på RRM2 protein og kemosensitivitet. Vi valgte MIA PaCa-2 cellelinie til disse undersøgelser, fordi det udviser lav følsomhed over for gemcitabin, især på sub-sammenflydende betingelser, men udtrykker høje niveauer af RRM2 (

Fig. 1B

) [23]. Desuden MIA PaCa-2 repræsenterer et dårligt differentieret bugspytkirtelkræft celle model [23] og

lad-7

spiller kritiske roller i cellulær differentiering. MIA PaCa-2 stabilt udtrykker præ-

lad-7a-1

, præ-

Lad-7a-

2, før

lad-7a-3

, præ-

lad-7b

, præ-

lad-7d

, præ-

lad-7e

, præ-

lad-7f-1,

præ-

lad-7f-2

, og præ-

lad-7i

blev genereret med succes af lentiviral genoverførsel; dog gentagne forsøg på at stabilt at transducere præ-

Lad-7c

præ-

Lad-7g

mislykkedes på grund af en mangel på overlevende kolonier. Interessant, viste Western blotting analyse betydelige reduktioner i RRM2 proteinekspression kun i MIA PaCa-2 stabilt udtrykker pre

-Lad-7a-3

, pre

-Lad-7e

, pre

-Lad-7f-1

, og pre

-Lad-7i

men kun minimalt i MIA PaCa-2 celler, der udtrykker pre

-Lad-7b

, pre

-Lad -7d

, og pre

-Lad-7-f-2

celler (

fig. 2A

). Overraskende, niveauet af RRM2 protein steg i MIA PaCa-2 udtrykker præ-

lad-7a-1 Hotel (

Fig. 2A

). Immuncytokemisk analyse af disse stabile kloner for RRM2 udtryk [26] bekræftet disse resultater (

Fig. 2B

). Disse data identificere, at RRM2 udtryksmæssige resultater afviger væsentligt med overekspression af specifikke for-

Lad-7

undertyper i bugspytkirtelkræftceller.

En

, Western blotting analyse af RRM2 (~45 kDa) og β-actin (45 kDa) i helcellelysater af MIA PaCa-2 overekspression forstadier til

lad-7

familiemedlemmer. Forhold på RRM2 til p-actin band intensiteter (normaliseret til kontrol) fra tre forsøg er angivet (

top

). Stjerner angiver signifikante reduktioner (

s

0,05) i RRM2 niveauer sammenlignet med kontrol.

B

, Immunocytokemisk detektion af RRM2 i eksponentielt voksende MIA PaCa-2 overekspression præ-

Lad-7

familiemedlemmer. Original forstørrelse, x20.

C

, MIA Paca-2-celler stabilt overekspression præ-

Lad-7

familiemedlemmer (

rød

) eller vektor alene (

blå og) var behandlet med gemcitabin (0,1 nM til 100 uM), og procent inhibering af cellulær proliferation blev målt under anvendelse af et MTT-assay.

Points

, gennemsnit af tre eksemplarer;

barer

, SE. n = 3. Gemcitabin IC

50 skøn angivet (

parenteser

).

Da de fleste

Lad-7

medlemmer [27] syntes at negativt indflydelse RRM2 udtryk, vi yderligere undersøgt, om præ-

lad-7

kunne forøge kemosensitivitet af MIA PaCa-2 til gemcitabin. Interessant, betydelige reduktioner i gemcitabin cytotoksisk IC

50 skøn blev identificeret i næsten alle præ-

Lad-7

udtrykkende MIA PaCa-2 stabile kloner genereret med den eneste undtagelse er præ-

bogstav 7a-1

hvilke indførsel bragte ingen forskelle (

fig. 2C

). For at teste, om

Lad-7

medierede stigning i gemcitabin cytotoksicitet blev lettet af RRM2 undertrykkelse, vi overudtrykt RRM2 cDNA med eller uden 3’UTR regioner i MIA PaCa-2 udtrykker præ-

lad-7a-3

. Vores resultater identificerede lavere gemcitabin cytotoksicitet IC

50 i celler, der udtrykker RRM2 med 3’UTR (69,34 ± 3,4 nM) sammenlignet med dem uden 3’UTR (383,4 ± 20,3 nM). Disse resultater tyder på, at reduktionen i RRM2 protein som følge af præ-

lad-7a-3

overekspression blev lettet af post-transkriptionel repression af RRM2, selvom RRM2-uafhængige mekanismer sandsynligvis spille fremherskende roller i andre præ-

lad-7

-overexpressing celler (fx præ-

lad-7f-2

).

Defekt Behandling af Pre

lad-7a- 1

i MIA PaCa-2

Selvom vi brugte før

lad-7

medlemmer til at generere alle stabile MIA PaCa-2-kloner, var forventet funktionel RNA-interferens at være medieret af den modne

lad-7

miRNA genereret efter en række intracellulære RNA forarbejdning begivenheder. På grund af forskelle i RRM2 udtryk og gemcitabin chemosensitization ved overekspression af præ

-Lad-7

medlemmer, vi mistanke om, at nogle af disse forstadier undladt at forarbejde til moden

lad-7

former i MIA PaCa -2. Derfor har vi kvantificeret relativ moden

Lad-7

niveauer ved QRT-PCR i forskellige præ-

lad-7-

udtrykke MIA Paca-2 kloner og sammenlignet dem med mock-transducerede MIA PaCa- 2. Interessant, betydelige stigninger (gennemsnit spænder fra 2-5 gange) i moden

lad-7

former blev identificeret i alt præ-

Lad-7

-overexpressing celler testet, med undtagelse af præ-

lad-7-a-1

-overexpressing celler, som ikke viste nogen ændring i moden

lad-7a

niveauer (

fig. 3A

).

En

, Relativ udtryk for modne former for

lad-7

i MIA PaCa-2 stabilt udtrykker præ-

lad-7

familiemedlemmer.

Kolonner,

betyde af tre eksemplarer;

barer,

SD. n = 3.

B,

Relativ udtryk for forstadie (

fyldte søjler

;

højre akse

) og ældre (

åbne barer

;

venstre akse

)

lad-7

former i bugspytkirtelkræftceller forbigående udtrykker

lad-7a forstadier

.

Kolonner,

betyde af tre eksemplarer;

barer,

SD. n = 3.

C,

Skematisk fremstilling af strukturerne for præ-

lad-7a-1

og præ-

lad-7a-3

. Sekvenser af modne og passager

Lad-7a

tråde inden for forstadier er indrammet i kontinuerlige eller brudte linjer, hhv.

D,

Mangel på fuldstændig spaltning af præ-

lad-7a-1

GFP mRNA i MIA PaCa-2 celler. MIA PaCa-2-celler blev forbigående transficeret med enten pmirGLO-G-Fud (kontrol), pmirGLO-GFP-præ-

lad-7a-1

, eller pre-pmirGLO-GFP-præ-

lad 7b

konstruerer, og GFP-fluorescens blev fanget. Original forstørrelse, x20. *

s

0,05, **

s

0,01, ***

s

. 0,001

Da defekt miRNA forarbejdning maskiner kunne nedmodulere modne miRNA [16], vi næste undersøgt, om en sådan defekt er især påvirker

lad-7a

biogenese i kræft i bugspytkirtlen. Da vi ikke har overholdt en overekspression i moden

lad-7a

i MIA PaCa-2 (

Fig. 3A

), valgte vi at undersøge, i detaljer, udtryk /behandling af alle tre

lad-7a

precursorformer (præ-

lad-7a-1

, præ-

lad-7a-2

, og præ-

lad-7a- 3

), der er afledt af tre separate gener (kromosomale steder 9q22.32, 11q24.1 og 22q13.31, henholdsvis) [27]. Brug QRT-PCR og primere, der enten flankerer hele hårnåle-struktur (som registrerer miRNA prækursorer) eller den modne sekvens (som registrerer modent miRNA), vi kvantificeret de intracellulære niveauer af alle tre

Lad-7a

forstadier samt moden

lad-7a

i forskellige bugspytkirtelkræftceller forbigående overekspression præ-

lad-7a-1

, præ-

lad-7a-2

eller præ -.

lad-7a-3

Mens precursor former blev stærkt udtrykt i alle tre tilfælde (3-38-dobling), modne

lad-7a

kun var løbende steget i præ-

lad-7a-3

udtrykkende celler, men ikke i dem, der udtrykker præ-

lad-7a-1 Hotel (L3.6pl, MIA PaCa-2) (

fig. 3B

).