PLoS ONE: MicroRNA 128a Øger Intracellulær ROS niveau ved Målretning Bmi-1 og Hæmmer medulloblastom Cancer Cell Growth ved Fremme Senescence

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af kort ikke kodende RNA’er der regulerer cellehomeostase ved at inhibere translation eller nedbryde mRNA af målgener, og derved kan fungere som tumorsuppressorgener eller onkogener. Rolle microRNA i medulloblastom er først for nylig blevet behandlet. Vi antager, at microRNA differentielt udtrykte under normal CNS udvikling kan være unormalt reguleret i medulloblastom og er funktionelt vigtige for medulloblastom cellevækst.

Metode og vigtigste resultater

Vi undersøgte udtryk for microRNA i medulloblastom og derefter undersøgt funktionelle rolle af et specifikt, mIR-128a, i regulering medulloblastom cellevækst. Vi fandt, at mange microRNA forbundet med normal neuronal differentiering væsentligt er nedreguleret i medulloblastom. En af disse, MIR-128a, inhiberer vækst af medulloblastom celler ved at målrette BMI-1-onkogen. Desuden miR-128a ændrer den intracellulære redox tilstand af tumorcellerne og fremmer cellulær ældning.

Konklusioner og betydning

Her rapporterer vi romanen regulering af reaktive ilt arter (ROS) ved microRNA 128a via den specifikke inhibering af BMI-1-onkogen. Vi viser, at miR-128a har væksten undertrykkende aktivitet i medulloblastom og at denne aktivitet delvist medieres ved at målrette Bmi-1. Disse data har konsekvenser for modulation af redox stater i cancer stamceller, som menes at være resistente over for behandling på grund af deres lave ROS stater

Henvisning:. Venkataraman S, Alimova I, Fan R, Harris P, Foreman N, Vibhakar R (2010) MicroRNA 128a Øger Intracellulær ROS niveau ved Målretning Bmi-1 og Hæmmer medulloblastom Cancer Cell Growth ved Fremme Ældning. PLoS ONE 5 (6): e10748. doi: 10,1371 /journal.pone.0010748

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 3, 2010; Accepteret: April 30, 2010; Udgivet den 21. juni, 2010

Copyright: © 2010 Venkataraman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Pediatric Brain Tumor Foundation (https://www.pbtfus.org/), The Bear Necessities Pediatric Cancer Foundation (https://www.bearnecessities.org) og National Institutes of Health-National Institute of Neurologiske og Stroke (NIH-NINDS) tilskud K08NS059790. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

medulloblastom er den mest almindelige maligne hjernetumor af barndommen. Mens resultaterne er forbedret, er der betydelig terapi sygelighed [1], [2]. Desuden patienter med høj risiko funktioner fortsat har en dårlig prognose. Nylige fremskridt viser, at medulloblastom skyldes cerebellare granula celle precursorer eller neurale stamceller placeret i cerebellum [3], [4], [5], [6]. Mens de molekylære mekanismer involveret i medulloblastom tumorigenese ikke er veldefinerede, er det klart, at der er unormal kontrol af normale udviklingsmæssige mekanismer [7].

For nylig arbejde fra vores laboratorium og andre har impliceret microRNA som vigtige regulatorer af medulloblastom cellevækst [8], [9], [10]. MikroRNA’er består af 18-22 nucleotid RNA-molekyler med post-transkriptionel gendæmpning aktivitet [11]. Mest almindeligt de kontrollerer genekspression gennem association med 3′-utranslaterede region (3’UTR) af gener og hæmme proteintranslation [12]. MikroRNA’er kan også destabilisere og medierer nedbrydningen af ​​RNA-transkripter [13]. Ud over deres rolle i normal udvikling, er microRNA også forbundet med carcinogenese [14], [15]. Mange microRNA er under udtrykkes i humane tumorer sammenlignet med normale væv, mens nogle er overudtrykt [16]. Vigtigere, dysregulering af microRNA forarbejdning resulterer i forbedret tumorigenese [17]. Desuden er et stigende antal microRNA forbundet med specifikke humane cancere. For eksempel er microRNA 21 (MIR-21) overudtrykt i glioblastom, og inhibering af MIR-21 inhiberer glioblastoma vækst

in vitro

in vivo

[18]. Andre har vist, at MIR-137 og MIR-124 inducerer differentiering af gliom stamceller [19]. Vi har tidligere vist, at MIR-124 fungerer også som en tumorsuppressor i medulloblastom celler, mens andre nylige undersøgelser har impliceret miR 17-92 polycistron som et onkogen i sonisk hedgehog-medieret medulloblastom [9], [10], [20].

Disse og andre nyere undersøgelser tyder på, at microRNA er kritiske regulatorer af tumorigenese og at deres bidrag til medulloblastom tumorigenese er vigtig. Derfor besluttede vi at undersøge microRNA funktion i medulloblastom. Vi udforskede muligheden for, at ekspressionen af ​​hjerne-beriget microRNA’er ændres i medulloblastom og at nogle af disse microRNA’er kan spille en afgørende regulerende rolle i denne tumor. Vi fandt, at flere microRNAer forbundet med normal neuronal differentiering væsentligt er nedreguleret i medulloblastom. Af disse microRNA 128a (MIR-128a) blev kraftigt nedreguleret. Mens den rolle, MIR-128a er blevet undersøgt i astrocytiske tumorer, såsom glioblastom, er dens rolle i neuronale tumorer, såsom medulloblastom ikke kendt. Her beskriver vi den funktionelle rolle af MIR-128a i medulloblastom for første gang. Vi fandt, at miR-128a hæmmer væksten af ​​medulloblastom celler ved at målrette Bmi-1 onkogen og derved øge steady state niveauer af superoxid og fremme cellulære ældning.

Resultater

Brain beriget microRNA’er er udtrykkes forskelligt i medulloblastom

Som et første skridt til at løse rolle microRNA i medulloblastom vi udførte microarray-analyse af microRNA i medulloblastom celler og sammenlignet det med menneskelig lillehjernen normal voksen. Vi valgte at undersøge primære medulloblastom celle eksplanteret ved passage 2 i kultur for at undgå støj fra at forurene elementer af normal hjerne i biopsiprøver. Ud af de 385 menneskelige microRNA’er analyseret, blev 167 udtrykt ved lavere niveauer i medulloblastom i forhold til normal lillehjernen. Hierarkisk klyngedannelse af microRNA ekspression korrekt adskilt den normale lillehjernen fra medulloblastom prøver (Figur S1-A). Yderligere analyse viste, at nedsat ekspression af 90 microRNA’er i medulloblastom var statistisk signifikante (p 0,05). Denne liste blev derefter undersøgt for at adskille de microRNA, der blev udtrykt i alle tre cerebellare prøver og statistisk faldt i alle tre medulloblastom prøver. Dette indsnævret listen over statistisk signifikante humane microRNA med nedsat udtryk i alle tre medulloblastom prøver til 30 microRNA (Figur S1-B). Af note, havde mange af microRNA tidligere blevet identificeret som beriges i normal hjerne [21]. Nogle, men ikke alle disse microRNA blev også rapporteret tidligere, som formindskes i medulloblastom sammenlignet med normal cerebellum [8], [9]. Sammenligning af datasæt for nedsat microRNA rapporterede tidligere, og vores data viste, at kun fem microRNA blev opdaget af alle tre grupper (Figur S2). Disse er MIR-124, MIR-129, MIR-138, MIR-150 og MIR-323. Vi har tidligere vist, at MIR-124 er funktionelt vigtigt i medulloblastom mens biologi af de andre fire fælles Mirs er endnu ikke klart [10]. Ferretti

et al

havde yderligere 12 microRNA’er fælles med vores datasæt hvor som Northcott

et al

havde kun 3 yderligere microRNA fælles med os (figur S2). Desuden var der 10 ekstra microRNA, der kun blev identificeret af os som værende faldt betydeligt i medulloblastom (figur S2).

Vi næste udført real time RT-PCR på en kohorte af disse miRNA i yderligere prøver at validere vores microarray data (figur 1A). Sammenligning primære medulloblastom celler til både voksne og pædiatriske normal lillehjernen afslørede en signifikant nedregulering af hjernen beriget microRNA i medulloblastom. Der er fire meget ned regulerede microRNA’er nemlig miR-125, miR-128a, miR -139 og lad-7g. Af disse fire microRNA’er blev MIR-139 identificeret ved os, men ikke i to tidligere rapporter [8], [9]. Derudover vi samt Ferretti

et al

men ikke Northcott

et al

opdaget miR-128a som faldt i medulloblastom. Interessant voksen lillehjernen havde højere udtryk for mange af disse microRNA’er i forhold til pædiatrisk lillehjernen. Ekspressionen af ​​stærkt undertrykte microRNAer blev yderligere valideret i et panel af medulloblastom cellelinier. Svarende til de primære eksplantater alle fire microRNAer blev nedsat i cellelinierne i forhold til normal cerebellum (figur 1B). I overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data, vi også fundet miR17-5p at være over-udtrykt i medulloblastom [9].

A) MicroRNA zonekort profilering af medulloblastom patientprøver og sammenligning til normal lillehjernen. B) Undertrykkelse af miR-125, miR-128, miR-139, lad-7g og forøget ekspression af miR17-5p i medulloblastom cellelinjer. C) Relativ udtryk for microRNA i medulloblastom patientprøver.

Næste undersøgte vi ekspressionen af ​​Lad-7g, miR-125 og miR-128a i primære medulloblastom tumorer og normal cerebellar væv. Brug qRT- PCR fandt vi, at alle tre miRNA er faldet betydeligt i udtryk i 10 arkiverede prøver medulloblastom patient (ANOVA, p 0.001, figur 1C). I betragtning af den lille prøve sæt, er det vanskeligt at udvikle nogen sammenhæng med tumor sub-type eller patientresultater. prøverne blev imidlertid ikke Gli1 høj og derfor ikke i SHH underkategori [9], [22]. Disse data indikerer, at disse microRNA kunne have en vigtig biologisk rolle i medulloblastom. Baseret på omfanget af miR-128a undertrykt i medulloblastom i modsætning til sin høj ekspression i normal lillehjernen, valgte vi for yderligere at undersøge den funktionelle rolle miR-128a i medulloblastom.

Re-ekspressionen af ​​miR-128a falder Daoy medulloblastom cellevækst

for at bestemme, om re-ekspressionen af ​​microRNA ændrer tumorcellevækst, vi transficerede Daoy medulloblastom celler med microRNA precursor-oligonukleotider. Disse microRNA precursor molekyler er designet til at efterligne endogene microRNA. Re-ekspression af MIR-128a faldt medulloblastom cellevækst som målt ved MTT-assayet (figur 2A). Lignende resultater blev noteret i D283 medulloblastom cellelinje (data ikke vist). For yderligere at evaluere vækstinhiberende virkning af MIR-128a, transficerede vi Daoy celler med kontrol miR eller MIR-128a oligonukleotider og talt celler i 5 dage under anvendelse af trypanblåt ekskluderingsmetode. I overensstemmelse med MTT data, MIR-128a faldt Daoy cellevækst i en dosisafhængig måde (figur 2B).

A) MIR-128a inhiberer medulloblastom celleproliferation som målt ved MTT-assayet. (P 01) B) Antal Daoy celler som målt ved trypan blåt farveeksklusion assay. C) Nedsat kolonidannelse i miR-128a transfekterede celler (øverste række er miR-128a vektor, nederste række er kontrol vektor). D) kimtal i tre eksemplarer af 2 uafhængige eksperimenter. (P 0,001)

For bedre at vurdere virkningen af ​​microRNA på medulloblastom celler vi brugte en lentiviral plasmid, som udtrykker miR-128a kassette og udførte kolonidannelse analyser. Som vist i figur 2C og D, transfektion med MIR-128a kraftigt inhiberede kolonidannelse med medulloblastom celler indikerer, at MIR-128a er en formodet tumorsuppressor i medulloblastom. Desuden MIR-128a kraftigt nedsat evne Daoy celler til at vokse i blød agar yderligere antyder en tumor undertrykkende rolle for MIR-128a i medulloblastom (fig S3).

MicroRNA 128a nedregulerer Bmi-1 i medulloblastom celler

Vi næste foretaget en analyse af potentielle microRNA target websteder ved hjælp to almindeligt anvendte forudsigelse algoritmer, Targetscan (https://www.targetscan.org) og PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu) [23], [24]. Begge algoritmer forudsagde Polycomb gen Bmi-1 at være et mål for MIR-128a. Den målområdet opfylder match kriterier frø (figur 3A). Eksperimentelt at teste, om vores forudsagte mål blev reguleret af MIR-128a, blev BMI-1 målsted klonet i 3’UTR af Renilla luciferase genet i siCHECK vektoren. Daoy celler blev transficeret med kontrol- eller MIR-128a oligonukleotider. Co-transfektion med MIR-128a faldt betydeligt Renilla luciferaseaktivitet i BMI-1 målstedet af vektorer, men ikke i de muterede stedet vektorer (figur 3B). Disse data tyder på, at Bmi-1 er et mål for miR-128a. En anden nylig undersøgelse af miR-128a i gliom rapporterede også, at Bmi-1 er et mål for miR-128a [25]. Dette er især spændende, da Polycomb gener spiller en afgørende rolle i stamceller fornyelse under embryogenese og er også kendt for at være biologisk vigtige i neurale celle proliferation og medulloblastom patogenese [26] – [27].

A) MiR- 128a målområde i Bmi-1 3’UTR. B) Luciferase reporter assays indikerer, at MIR-128a funktionelt målrettet mod wt Bmi-1 3’UTR, * p 0,01 C) Western blot-analyse bekræfter, at MIR-128a, men ikke kontrol miR (CM), inhiberer proteinekspression fra BMI -1 i medulloblastom celler. D) Kvantificering af Western blot bands. (P 0,01)

For yderligere at validere Bmi-1 som et mål for miR-128a, vi udførte immunoblotanalyse af kontrol eller miR-128a transfekterede celler. Daoy celler blev transficeret med kontrol- eller MIR-128a oligonukleotider og høstet 48 timer senere. Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af anti-Bmi-1-antistof. MIR-128a faldt Bmi-1 proteinniveauer i Daoy celler i overensstemmelse med de luciferase data. (Figur 3C, D).

MicroRNA 128a hæmmer Bmi-1 medieret signalering

Bmi-1 er kendt for at undertrykker p16 udtryk [28]. I fravær af Bmi-1, er p16 opreguleret i neuronale stamceller reducerer celleproliferation [26]. Det har også vist sig at BMI-1 medieret repression af p16 kan føre til øget aggressiv adfærd melanom stamceller [29]. Daoy og ONS76 medulloblastom celler transficeret med MIR-128a opreguleret p16 som detekteret ved western blotting (figur 4A). De samme cellelinjer ved transfektion med Bmi-1 fuldstændigt undertrykt p16-ekspression. For yderligere at bekræfte, at MIR-128a forhindrer undertrykkelse af p16 ved at inhibere Bmi-1, både Daoy og ONS76 cellelinier blev co-transficeret med MIR-128a og BMI-1. Dette resulterede i en moderat stigning i p16-protein niveau sammenlignet med celler kun transficeret med Bmi-1.

A) Western blot-analyse viste øget p16-ekspression i Daoy celler transficeret med MIR-128a sammenlignet med den for styrevektor, pVETL. Niveauet af p16-ekspression var fuldstændigt inhiberet i Daoy celler, som blev transfekteret med BMI-1-vektor alene mens beskeden inhibering blev observeret i celler co-transficeret med MIR-128a. B) Nedsat E2F1-aktivitet i Daoy celler transficeret med MIR-128a som målt ved luciferase reporter assays. (P 0,01)

Tidligere undersøgelser viser, at Bmi-1 hæmmer p16 og dermed øger E2F1 aktivitet [30]. E2F transkriptionsfaktorer spiller en central rolle i reguleringen af ​​celleproliferation og terminal differentiering. Derfor effekten af ​​miR-128a på E2F1 transkriptionel aktivitet blev undersøgt. Det blev fundet, at transfektion af MIR-128a i Daoy celler faldt betydeligt E2F1 aktivitet som målt ved luciferase reporter aktivitet, p 0,05 (figur 4B). Dette er i overensstemmelse med vores resultater, at miR-128a falder Bmi-1 og øger p16.

Bmi-1 er en funktionel del af miR-128a medieret medulloblastom cellevækst anholdelse

For yderligere at vurdere, om Bmi-1 undertrykkelse er en funktionel del af miR-128a vækst anholdelse fænotype vi undersøgt, om Bmi-1 kunne redde miR-128a vækst anholdelse i medulloblastom celler. Medulloblastom celler blev transficeret med MIR-128a, MIR-128a og BMI-1 eller de tilsvarende kontroller, og cellerne udsættes for kolonien fokus assay. Co-transfektion af MIR-128a med Bmi-1 resulterede i svækkelse af MIR-128a medieret vækststandsning i begge Daoy celler (figur 5A og B). Daoy celler co-transficeret med Bmi-1 mangler sin 3’UTR og MIR-128a også reddet proliferationen af ​​celler som inhiberet af MIR-128a alene (figur S4A). Dette tyder klart, at MIR-128a målretter Bmi-1 og formindske celleoverlevelse. En anden medulloblastom cellelinie viste ONS76 celler også den samme tendens i udpladningseffektiviteten når transficeret med MIR-128a og BMI-1 (figur s4b). Disse data funktionelt placerer Bmi-1 i MIR-128a kaskade.

A) Co-transfektion af celler med Daoy MIR-128a og BMI-1 forøgede antallet af dannede kolonier sammenlignet med den af ​​MIR-128a alene . B) Kvantitativ analyse af antallet af kolonier dannet af Daoy celler efter forskellige transfektioner, herunder Bmi-1, der mangler sin 3’UTR. pBABE-puro er en kontrol vektor for fuld længde Bmi-1. * P 0,05 for miR-128a vs. pVETL og ** p 0,001 for miR-128a vs. miR-128a + Bmi-1

MicroRNA 128a øger steady-state niveau af superoxid. i Daoy celler

for nylig er det blevet vist, at fraværet af Bmi-1 fører til øget reaktive oxygenarter (ROS) niveauer i celler afledt fra Bmi-1 knockout mus [31]. ROS er velkendte for modulere en række cellulære funktioner, herunder cancer cellebiologi [32]. Da MIR-128a faldt Bmi-1 proteinniveauer, ønskede vi at teste, om en lignende stigning i ROS-niveauer var tydelig i Daoy celler behandlet med MIR-128a. Vi udførte spin-indfangning af frie radikaler og elektronspinresonans (EPR) spektroskopi til at identificere, om der var en stigning i ROS niveauet i celler igen udtrykker miR-128a. Spin trap, blev DMPO valgt på grund af lav cytotoksicitet, adgang til cellen, og reaktion med hydroxylradikaler (OH ·), hvilket gav en karakteristisk DMPO-OH spin-addukt [33]. Omsætningen af ​​DMPO med superoxid giver et produkt (DMPO-OOH), der omdannes til DMPO-OH ved GPX i celler. Derfor DMPO er en nyttig probe til påvisning af oxygen-centrerede radikaler, der følger af superoxid og H

2O

2. De EPR spektre viser en typisk 1:2:2:1 DMPO-OH kvartet (lukkede cirkler, figur 6A-ii). EPR resultater viser klart en stigning i DMPO-OH kvartet intensitet i Daoy celler, der udtrykker MIR-128a sammenlignet med den tomme vektor (figur 6A-i). Præcist at identificere, om DMPO-OH kvartet signal kan skyldes direkte til superoxid eller H

2O

2, Daoy celler transficeret med MIR-128a blev inkuberet med CuZnSOD i 30 minutter før tilsætning af DMPO. Tilsætning af SOD faldt betydeligt EPR signal højden tyder på, at DMPO-OH signal er direkte skyldes superoxid (figur 6A-iii). Den kvantitative analyse af kvartetten signal højde (figur 6B) viste en signifikant stigning (p 0,05) af superoxid i celler transient transficeret med MIR-128a sammenlignet med celler behandlet med kontrolvektoren. Denne stigning i signalintensiteten blev inhiberet ved tilsætning af SOD. Det er derfor klart, at miR-128a øger steady-state niveau af superoxid i medulloblastom celler. For yderligere at bekræfte, at stigningen i ROS skyldes inhiberingen af ​​Bmi-1, Daoy celler blev co-transficeret med Bmi-1 og MIR-128a. Dette resulterede i et fald ROS niveau i celler sammenlignet med den af ​​MIR-128a alene (figur 6A-iv). Rescue eksperimenter med Bmi-1 mangler sin 3’UTR afslørede også, at miR-128a henvender Bmi-1 og dermed fører til stigning i ROS niveau i celler (Figur S5)

A) Øget superoxid radikal dannelse i Daoy celler der blev transficeret med mIR-128a som påvist under anvendelse af EPR-spektre af DMPO-OH spin-addukt (udfyldte cirkler i (ii)). Den opsamlede spektre er et signal gennemsnit på 15 scanninger. Den 1:2:2:1 (lukkede cirkler) kvartet signal set skyldes dannelsen af ​​DMPO-OH. Cellerne behandlet med MIR-128a har -3 gange stigning i ROS signalintensiteten (ii) i sammenligning med den tomme vektor (i). Co-transfektion af celler med MIR-128a og BMI-1 resulterede i et fald ROS niveau sammenlignet med den af ​​MIR-128a alene (iii). Behandlingen af ​​SOD i MIR-128a-transficerede celler afskaffet de signaler, der viser, at den radikale dannede hovedsagelig superoxid (iv). B) Den kvantitative analyse af EPJ tophøjde normaliseret til celle nummer. * P. 0,05 miR128a vs. pVETL og miR-128a + SOD

MicroRNA 128a inducerer celle ældning i Daoy celler

Reaktive ilt arter, kan et biprodukt af oxidativt stress fremkalde irreversible cellevækst anholdelse og ældning [34]. Endvidere senescing celler har signifikant flere ROS sammenlignet med apoptotiske celler [35]. Desuden p16-ekspression er en af ​​hall mark af cellulær senescens [36]. Da vi fandt MIR-128a transficerede Daoy celler viste øget i steady state niveauet af ROS, steg i p16 proteinniveau og demonstrerede en celle vækststandsning, udførte vi et assay for ældning. Fem dage efter transfektion med MIR-128a, et øget antal senescens-associerede β-galactosidase (SA-β-gal) positive celler blev observeret (figur 7A). Der var en femdobling i senescentceller efter miR-128a transfektion af celler i forhold til de tomme vektor transfekterede celler (Figur 7B) Lignende data blev observeret i ONS 76 medulloblastom celler (figur S6).

A ) MIR-128a inducerer ældning i medulloblastom celler som påvist ved SA-beta galactosidase farvning (mørkeblå celler eksempler angivet med røde pile). B) Cell tællinger pr høj powered Field of β-gal-positive celler i kontrol vektor (pVETL) eller MIR-128a transficerede celler, * p = 0,003. C) Western blot-analyse viser forøget niveau af H3K9me2 protein i Daoy celler transficeret med MIR-128a sammenlignet med den tomme vektor. Actin anvendes som en intern kontrol.

For yderligere at understøtte vores fund, at miR-128a transfektion fører til cellulær aldring, vi undersøgte methylering niveauer af histon 3, lysin 9 (H3K9) ved western blotting. Senescens-associerede heterochromatin foci er forbundet med methylering af histon 3 lysin 9 (H3K9me2). Interessant, re-ekspressionen af ​​miR-128a medførte øget methylering af histon 3 lysin 9 (H3K9me2), andet mærke undertrykte genekspression formidlet af Bmi-1 Polycomb repressor kompleks (Figur 7C). Alle disse resultater tyder på, at væksten hæmmende effekt af miR-128a skyldes ældning-signalvejen som udløses af stigningen i ROS

Diskussion

Her rapporterer vi romanen regulering af reaktiv ilt arter af microRNA 128a via den specifikke hæmning af Bmi-1 onkogen. Den funktionelle rolle microRNA 128a i medulloblastom er ikke tidligere blevet beskrevet.

Vi fandt signifikant nedregulering af flere microRNA’er vides at være involveret i CNS udvikling i medulloblastom ,. Vores data er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der har beskrevet nedsat ekspression af microRNA i medulloblastom [8], [9]. Ferretti

et al

fandt 55 microRNA skal nedreguleret i medulloblastom med forskelle i udtryk blandt de store histologiske undertyper [8]. Tilsvarende Northcott

et al

fandt 61 microRNA skal faldet i medulloblastom i forhold til normal lillehjernen [9]. Interessant, når yderligere klassificeret i 4 molekylære grupper var der betydelige forskelle i microRNA udtryk. For eksempel Sonic Hedge Hog (SHH) drevne tumorer var faldet udtryk for 10 microRNAer men ingen, der overlappede med microRNA identificeret af os eller af Ferretti

et al

. Faktisk sammenligning analyse viste signifikante forskelle mellem de opdaget af de tre grupper (Figur S2) microRNA. Disse forskelle er sandsynligvis relateret til platformene, der anvendes af hver gruppe, tumor kilde og kilden og alder af den normale cerebellum anvendes. Vi anvendte primær celle eksplantater i kulturen ved passage 2, medens de to andre grupper anvendes biopsi materiale. Endvidere vore patientens væv var alle af den klassiske histologi, og har ikke en genekspression signatur for SHH. Af note både vores undersøgelse og rapport fra Ferretti

et al. Hej, fundet, at miR-128a blev signifikant reduceret i udtryk i medulloblastom i forhold til normal lillehjernen.

Vi viser, at dette faldt udtryk er en egenskab af primære tumorprøver samt et panel af almindeligt anvendte medulloblastom cellelinier. Disse data vil være af særlig anvendelse som microRNA funktion er yderligere probes i medulloblastom. Af bemærk miR17-5p klyngen blev overudtrykt i vores prøver, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter [9].

Analysen af ​​re-udtrykkende miR-128a i medulloblastom celler viste, at miR-128a hæmmede væksten af medulloblastom celler sandsynligvis ved at reducere proliferation. MIR-128a demonstrerede tumor undertrykkende virkninger ved kraftigt at inhibere kolonidannelse af medulloblastom celler. Yderligere analyse af mulige mekanismer afslørede, at Bmi-1 onkogen var en formodet mål for miR-128a. Vi demonstrerede at BMI-1-protein ned reguleres af MIR-128a, hvilket igen fører til en stigning i p16 en cellecyklus-inhibitor. Regulering fra BMI-1 af microRNA er spændende eftersom Bmi-1 er overudtrykt i medulloblastom og er kritisk for normal cerebellar udvikling [27]. Bmi-1 er også kritisk for neural stamcelle selvfornyelse [26]. Bmi-1 blev også for nylig vist sig at være et mål for miR-128a i glioblastom [25]. Vores data udvider denne observation ved at demonstrere, at hæmning af Bmi-1 er funktionelt kritisk for miR-128a vækst undertrykkende funktion. Gendannelse Bmi-1-ekspression i miR-128a udtrykkende celler redder de medulloblastom celler fra vækst anholdelse. Vi derefter forsøgt at yderligere at undersøge mekanismen af ​​miR-128a-Bmi-1-vejen i medulloblastom.

Nye data tyder på, at Bmi-1 regulerer reaktive ilt arter [31]. Vi viser, at microRNA 128a inducerer intracellulær superoxid generation, muligvis ved at regulere Bmi-1-niveauer, og at Bmi-1 re-udtryk vender superoxid generation. Nylig dokumentation antyder, at cancer stamceller er mere resistente over for behandling på grund af en lavere samlet redoxtilstand [37]. Således modulerende reguleringsmekanismer af ROS generation i cancer stamceller måske en nyttig strategi til at ødelægge disse celler. Vi forestiller os et scenarie, hvor microRNA 128a kan anvendes til at inducere ROS i medulloblastom stamceller og derved gøre dem mere radiosensitive. Det centrale er at modulere homøostase af ROS. Ved normale koncentrationer, ROS spille en rolle i cellulære funktioner involverer signaltransduktion. Men for at en ubalance mellem produktion af ROS og kapacitet af antioxidanter neutraliserer ROS kan resultere i en afbrydelse af cellulær redox-status, hvilket fører til oxidativ stress. Vores observation af en øget steady-state niveau af ROS, og induktion i p16 kan bidrage til for tidlig-ældning i celler, der udtrykker miR-128a (figur S7).

Sammenfattende beskriver vi den funktionelle rolle af microRNA 128a i medulloblastom. Vi viser, at microRNA 128a nedsætter medulloblastom cellevækst gennem mekanismer, der involverer ROS og ældning. Vi undersøger nu rollen som microRNA 128a i radio-sensibiliserende medulloblastom hjælp

in vivo

ortotopisk xenograftmodeller.

Materialer og metoder

celler, væv og Kultur

Daoy og D283 medulloblastom celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, Md.) og dyrket i DMEM-medium (Gibco, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco) ifølge leverandørens anbefalinger . Cellelinie ONS76 blev venligst tilvejebragt af Dr. James T. Rutka (University of Toronto, Canada) og blev dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS. D341 blev opnået fra ATCC og dyrket i DMEM med 20% FBS og 1% natriumpyruvat og L-glutamin. Primære cellekulturer blev afledt fra biopsiprøver af medulloblastom patienter under en protokol godkendt af Institutional Review Board på University of Iowa Hospitaler og Klinikker. Skriftligt samtykke fra alle patienter blev opnået som mandat fra University of Iowa IRB. Kulturer blev opretholdt ved lave passagetal (p2-p4) i DMEM medium suppleret med 20% føtalt bovint serum. Normale humane cerebellum og medulloblastom patientprøver blev opnået fra Pediatric Co-operative humant væv Network (Columbus, Ohio) under en University of Iowa IRB godkendt protokol. Alle prøver blev opnået i en anonym måde som mandat fra IRB. Prøver vi Normale cerebellare prøver var fra nonmalignant pædiatriske og voksne hjerne. Alle medulloblastom prøver var fra pædiatriske patienter. Detaljer for patientprøver er tidligere blevet beskrevet [38]. Kort fortalt alle prøver var fra ikke-metastatiske (M0) tumorer med klassisk medulloblastom histologi.

MicroRNA Isolering og kvantitativ PCR-analyse

Små RNA’er blev isoleret ved anvendelse af Mirvana RNA isolation kit (Ambion).

MicroRNA ekspression blev målt ved kvantitativ PCR under anvendelse af et ABI 7700 termisk-cykliseringsapparat. MiRNA primere og prober blev købt fra Applied Biosystems (Foster City, CA) og analyserne udføres pr fabrikantens anbefalinger med flere ændringer for at vi kan registrere lav hyppighed microRNA. For den omvendte transkription (RT) reaktion 20 nanogram af total RNA blev anvendt. På qPCR reaktion den resulterende cDNA blev fortyndet 1:02. Hver RT blev udført in duplo, og qPCR i tre eksemplarer for hver RT-reaktionen. U6b og U66 små RNA blev brugt som endogene kontrol og relativ microRNA mængde beregnet af ΔΔCT metoden.

Transient transfektion af Daoy celler med miR-128a og analyse af celledeling og levedygtighed

Cell spredning blev målt ved MTT-assay og cellelevedygtigheden blev bestemt ved trypanblåt-udelukkelse assay. Til assay for celleproliferation blev medulloblastom celler transficeret med kontrol miR, MIR-9 eller MIR-128a oligonukleotid i 24-brønds plader under anvendelse af LT1 reagens (Mirus, Madison WI). 6, 000 celler /brønd blev derefter podet i tre eksemplarer på til 96-brønds plader i 100 ul medium. Efter 2 dage blev 100 ul af Cell Titer vandig (Promega, Madison, WI) tilsat, og cellerne blev inkuberet i 1 time, og absorbansen måles ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser pr producentens anbefalinger. (F).